陳東亮孫化雨李利超趙韓生高志民（1北京市農(nóng)林科學(xué)研究院北京農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究中心北京100097 國際竹藤中心國家林業(yè)局竹藤科學(xué)與技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室北京10010）

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麻竹DlSCL6基因amiRNA前體合成及表達(dá)載體構(gòu)建

陳東亮1，2孫化雨2李利超2趙韓生2高志民2
（1北京市農(nóng)林科學(xué)研究院北京農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究中心北京100097 2國際竹藤中心國家林業(yè)局竹藤科學(xué)與技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室北京100102）

Web MicroRNA Designer（WMD3）是一個專門應(yīng)用于植物人工miRNA設(shè)計和前體序列設(shè)計的專業(yè)網(wǎng)站，其中利用重疊PCR法合成amiRNA前體序列，涉及多個PCR和純化回收過程，步驟繁瑣，周期較長。本研究利用WMD3設(shè)計了麻竹轉(zhuǎn)錄因子DlSCL6基因的人工miRNA序列和其前體序列，采用改進(jìn)的重疊PCR方法，快速克隆獲得了該前體序列，并以改造的pCMABIA1301載體為框架，構(gòu)建了該前體的植物表達(dá)載體，為進(jìn)一步研究利用amiRNA調(diào)控SCL6基因的表達(dá)奠定了基礎(chǔ)。

麻竹；人工miRNA；重疊PCR；表達(dá)載體構(gòu)建

microRNA（miRNA）是一類生物內(nèi)源的小分子非編碼RNA，廣泛存在于動物、植物和微生物中。miRNA調(diào)控是基因表達(dá)轉(zhuǎn)錄后層面的重要調(diào)控方式之一，研究表明miRNA在植物的生長發(fā)育、物質(zhì)代謝、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)以及抗逆等多種生理生化過程中發(fā)揮重要功能［1-3］。人工 miRNA （artificial miRNA，amiRNA）是通過模擬天然miRNA結(jié)構(gòu)特點(diǎn)、作用機(jī)制，設(shè)計出一段與目標(biāo)基因高度匹配的序列，利用分子生物學(xué)技術(shù)將其轉(zhuǎn)入植物體內(nèi)并使其表達(dá)，而達(dá)到對該基因抑制調(diào)控的目的。amiRNA的有效性已經(jīng)在擬南芥 （Arabidopsis thaliana）、楊樹 （Populus trichocarp）、水稻 （Oryza sativa）等十幾種植物的數(shù)十個基因中得到驗(yàn)證［4-7］。

2009年，Weigel等發(fā)布了 WMD3軟件平臺（http：//wmd3.weigelworld.org/cgi-bin/webapp.cgi），利用這個平臺可以設(shè)計目標(biāo)基因的amiRNA以及基于平臺提供的若干前體框架的amiRNA表達(dá)前體及其合成引物。WMD3實(shí)現(xiàn)了amiRNA設(shè)計合成的自動化，大大方便了amiRNA設(shè)計合成。然而，利用WMD3平臺合成amiRNA前體基因的重疊PCR法，不僅需要以其推薦的載體，比如RS300、NW55等為模板，而且PCR合成過程需要多次PCR和回收純化，過程較為繁瑣。本研究利用WMD3平臺設(shè)計了麻竹（Dendrocalamus latiflorus）DlSCL6基因的amiRNA及基因RS300的表達(dá)前體，對原有的重疊PCR合成方法進(jìn)行了改進(jìn)。改進(jìn)的重疊PCR方法，不需要其特定的載體作為模板，并且僅需1次重疊PCR和純化回收過程，即可獲得完整的amiRNA前體序列，大大簡化了操作流程和縮短了合成周期。同時，利用pCAMBIA1301載體為框架，構(gòu)建了DlSCL6基因人工miRNA的植物表達(dá)載體，為進(jìn)一步研究利用amiRNA技術(shù)調(diào)控DlSCL6基因表達(dá)奠定了基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)方法

1.1 amiRNA設(shè)計方法

利用WMD3在線程序Designer功能設(shè)計麻竹DlSCL6基因 （Genbank：KC182562）［8］的 amiRNA，默認(rèn)以amiRNA優(yōu)劣排序。選擇最優(yōu)的amiRNA序列，利用psRNAtarget在線程序進(jìn)行靶位點(diǎn)驗(yàn)證。以RS300載體 （以擬南芥miR319a前體為框架）為模板，利用WMD3程序Oligo功能設(shè)計WMD3推薦的方法合成amiRNA前體所需的4條重疊引物。根據(jù)重疊引物和RS300模板序列，推導(dǎo)出含有amiRNA 和amiRNA?的完整前體序列。分別在該amiRNA前體序列的5′端添加BamHⅠ和ClaⅠ2個酶切位點(diǎn)（GGATCCATCGAT），在3′端添加XbaⅠ酶切位點(diǎn)（TCTAGA），含有酶切位點(diǎn)的完整序列命名為preamiR-scl6，并利用mfold在線軟件分析pre-amiR-scl6的二級折疊結(jié)構(gòu)。

1.2 amiRNA合成

將設(shè)計的pre-amiR-scl6序列分割成10條短片度重疊引物 （P1—P10），每對相鄰引物有10 bp左右的重疊堿基 （圖1），引物盡量不超過60 nt，且避免不同引物末端連續(xù)3個以上堿基重復(fù)。改良的重疊PCR法，反應(yīng)體系如下：引物P1和P10各0.8 μL，引物P2-P8各0.2 μL，PrimeSTAR HS高保真聚合酶 （TAKARA）0.2 μL，5×buffer 4 μL，dNTP 1.6 μL，MQW補(bǔ)足20 μL。通過設(shè)置溫度梯度，對退火溫度進(jìn)行優(yōu)化，反應(yīng)條件為：預(yù)變性98℃ 5 min；變性98℃ 10 s，退火30～55℃ 15 s，延伸72℃30 s，35個循環(huán)；延伸72℃ 10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖電泳檢測，符合預(yù)期大小的片段進(jìn)行回收加A并連接pGEM T-easy載體，陽性克隆送華大基因測序。

圖1 組裝PCR引物示意圖

1.3 amiRNA植物表達(dá)構(gòu)建

以改造的pCAMBIA1301為框架構(gòu)建表達(dá)載體，將測序正確的帶有 pre-amiR-scl6的 T載體以及pCAMBIA1301質(zhì)粒同時用BamHⅠ和XbaⅠ進(jìn)行雙酶切，回收線性化的表達(dá)載體和pre-amiR-scl6片段，利用T4連接酶過夜連接 （圖2），并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α。獲得的陽性克隆提取質(zhì)粒，用BamHⅠ和XbaⅠ進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證。

2 結(jié)果與分析

2.1 DlSCL6基因amiRNA前體序列設(shè)計

利用WMD3設(shè)計DlSCL6基因的amiRNA，共得到57條候選的miRNA序列。選擇最優(yōu)的amiRNA（序列為：TATGGCATTAAACTCGAACGG），利用psRNAtarget在線軟件進(jìn)行評價，結(jié)果顯示，Expectation（E）為1.0，Target Accessibility（UPE）為16.944，顯示該amiRNA與靶基因結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合的可信度較高。將amiRNA提交WMD3在線程序，設(shè)計出4條以RS300為模板的重疊PCR引物，根據(jù)RS300模板序列和引物序列，推導(dǎo)完整的前體序列，并在兩端添加酶切位點(diǎn)，命名為pre-amiR-scl6。preamiR-scl6完整序列及其 miRNA和miRNA?位置見圖3。

圖2 amiRNA表達(dá)載體構(gòu)建示意圖

圖3 pre-amiR-scl6序列

利用mfold軟件分析合成的pre-amiR-scl6序列的二級結(jié)構(gòu)，結(jié)果表明，除替換的 amiRNA及amiRNA?序列外，其它都與擬南芥amiR159a前體結(jié)構(gòu)類似 （圖4），具有典型的 miRNA前體發(fā)卡環(huán)結(jié)構(gòu)。

圖4 pre-amiR-slc6折疊后的頸環(huán)結(jié)構(gòu)

2.2 重疊PCR合成pre-amiR-scl6序列

根據(jù)pre-amiR-scl6序列，設(shè)計出的10條重疊PCR引物 （表1），除P10外，均在60 nt以內(nèi)。利用TAKARA高保真酶，進(jìn)行重疊PCR擴(kuò)增。首先摸索合適的退火溫度，設(shè)置溫度范圍30～55℃，依次每隔5℃為1個設(shè)定溫度，PCR結(jié)果檢測如圖5所示，在30℃時可得到特異性較好且大小符合預(yù)期的條帶 （約0.4 kb）。回收目的條帶，連接至pGEM T-easy載體，并測序。測序結(jié)果比對顯示，該序列與設(shè)計的pre-amiR-scl6序列完全一致 （396 bp），表明成功獲得了DlSCL6基因的amiRNA的前體pre-amiR-scl6的序列。

表1 pre-amiR-scl6合成用到的重疊引物

2.3 pre-amiR-scl6植物表達(dá)載體構(gòu)建與檢測

為了研究amiRNA的功能，進(jìn)行了pre-amiR-scl6表達(dá)載體的構(gòu)建。將經(jīng)BamHⅠ （GGATCC ）和XbaⅠ （TCTAGA ）雙酶切后回收的pCAMBIA1301 和 pre-amiR-scl6片段過夜連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，在含有潮霉素的LB培養(yǎng)基平板上進(jìn)行篩選。獲得的陽性克隆提取質(zhì)粒，經(jīng)BamHⅠ和XbaⅠ雙酶切檢測，5個克隆中的2個在預(yù)期位置出現(xiàn)條帶（改造的pCMABIA1301載體約9 kb，前體序列preamiR-scl6約0.4 kb）（圖6），表明植物表達(dá)載體構(gòu)建成功。

圖5 pre-amiR-scl6 PCR合成電泳檢測圖

圖6 植物表達(dá)載體酶切檢測圖

3 討論

miRNA在植物生長發(fā)育中的調(diào)控作用越來越受到研究者的關(guān)注，但植物中并非所有基因都受到miRNA的調(diào)控。對于非miRNA調(diào)控的基因，可以參考miRNA的作用機(jī)理設(shè)計開發(fā)amiRNA，實(shí)現(xiàn)對其精準(zhǔn)控制。相對于其它基因沉默技術(shù)，amiRNA具有較高的準(zhǔn)確性和較低的脫靶率，因此在基因沉默研究中，amiRNA的應(yīng)用越來越廣泛。自首例amiRNA在擬南芥中應(yīng)用［9］發(fā)表以來，越來越多的amiRNA研究工作得到了開展［10-11］。尤其是WMD3網(wǎng)站的開放為設(shè)計開發(fā)amiRNA提供了便利，WMD3可以根據(jù)靶基因序列，設(shè)計出所有符合要求的amiRNA，并根據(jù)序列的優(yōu)劣進(jìn)行排序。研究人員可以根據(jù)建議或個人需求選擇合適的amiRNA，并選擇提供的4種載體中的一種為模板設(shè)計重疊PCR引物，用于合成相應(yīng)的amiRNA前體。然而，利用網(wǎng)站推薦的方法，操作過程比較繁瑣，且耗時較長。

為了提高工作效率，同時降低成本，本研究對該方法進(jìn)行了改進(jìn)。首先根據(jù)WMD3設(shè)計的重疊引物和模板序列，推導(dǎo)出amiRNA的前體序列，將并其分解成末端具有10堿基重疊的10條短片度引物，奇數(shù)引物為正向序列，偶數(shù)引物為反向互補(bǔ)序列。為了降低引物的合成成本，單條引物長度盡量控制在60 nt以內(nèi)。在進(jìn)行重疊PCR時，2—8號引物只作為模板，加入量要少，而1和10號引物既是模板，又是擴(kuò)增引物，適當(dāng)加大加入量。通過對重疊PCR擴(kuò)增時退火溫度的研究，發(fā)現(xiàn)較低溫度比較容易擴(kuò)增出目的條帶。利用改進(jìn)的重疊PCR法，只需進(jìn)行一次PCR反應(yīng)和一次回收和測序，便可以獲得設(shè)計的amiRNA前體序列，大大簡化了原有的操作程序，省去了尋找或購買模板載體的麻煩，大大縮短了amiRNA前體合成的時間周期。

SCL6是植物特有轉(zhuǎn)錄因子家族GRAS家族的一員，在維持植物頂端分生組織正常功能中發(fā)揮重要作用。對擬南芥研究表明，SCL6-Ⅱ，SCL6-Ⅲ和SCL6-Ⅳ的突變導(dǎo)致側(cè)芽數(shù)量較少，初生根變短等癥狀［12-13］。本研究構(gòu)建了麻竹DlSCL6基因amiRNA的植物表達(dá)載體，為進(jìn)一步驗(yàn)證amiRNA活性和研究麻竹中SCL6的表達(dá)調(diào)控奠定了基礎(chǔ)。

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Synthesis and Expression Vector Construction of amiRNA Precursor for DlSCL6 in Dendrocalamus latiflorus

Chen Dongliang1，2Sun Huayu2Li Lichao2Zhao Hansheng2Gao Zhimin2
（1 Beijing Key Laboratory of Agricultural Genetic Resources and Biotechnology，Beijing Agro-Biotechnology Research Center，Beijing Academy of Agriculture and Forestry Sciences，Beijing 100097，China 2 International Center for Bamboo and Rattan，Key Laboratory on the Science and Technology of Bamboo and Rattan，Beijing 100102，China）

Web MicroRNA Designer（WMD3）is a professional website specially used for sequence design of plant artificial miRNA and its precursor.Overlap PCR method was used for the synthesis of amiRNA precursor sequence，which involved multiple PCR purifications and recovery processes with complicated steps and a longer period.In this study，sequences of plant artificial miRNA and its precursor for DlSCL6 in Dendrocalamus latiflorus were designed according to WMD3 and an improved method of overlapping PCR was used for quickly cloning of the precursor sequence.Based on the frame of pCMABIA1301 vector，the expression vector of amiRNA precursor for DlSCL6 was constructed，which laid a foundation for further study in the expression regulation of SCL6 using amiRNA.

Dendrocalamus latiflorus，amiRNA，overlap PCR，construction of expression vector

10.13640/j.cnki.wbr.2016.02.001

國家林業(yè)公益性行業(yè)科研專項(xiàng)經(jīng)費(fèi)項(xiàng)目 （編號：201504106）；“十二五”國家科技支撐計劃專題 （編號：2012BAD23B0504）。

陳東亮，男，博士，助理研究員，研究方向?yàn)榛ɑ芊肿佑N。E-mail：dlchen1984@126.com。

高志民，男，研究員，博士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)橹裉偕L發(fā)育的分子基礎(chǔ)。E-mail：gaozhimin@icbr.ac.cn。