范哲賢，楊　　霖，李孝棟（福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，福建 福州 350122）

透骨消痛膠囊中巴戟天的藥代動力學(xué)

范哲賢，楊霖，李孝棟
（福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，福建 福州 350122）

目的研究透骨消痛膠囊中巴戟天的藥代動力學(xué)。方法采用高效液相色譜法，考察藥代動力學(xué)參數(shù)，得去乙酰基車葉草苷酸的回歸方程。結(jié)果線性關(guān)系良好，精密度高，提取回收率、符合生物樣本分析的要求。結(jié)論高效液相色譜法可作為研究巴戟天中去乙?；嚾~草苷酸的有效工具。

透骨消痛膠囊；去乙?；嚾~草苷酸；藥代動力學(xué)；高效液相色譜法

膝骨性關(guān)節(jié)炎（knee osteoarthritis，KOA），是一種以關(guān)節(jié)軟骨的變性、破壞及骨質(zhì)增生為特征的慢性關(guān)節(jié)病，隨著我國進(jìn)入老齡化社會，其發(fā)病率有增加的趨勢。透骨消痛膠囊是劉獻(xiàn)祥教授的經(jīng)驗方［1-2］，為福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二人民醫(yī)院的院內(nèi)制劑，具有補腎柔肝、活血祛風(fēng)的作用。前期研究［3-5］發(fā)現(xiàn)，該膠囊用于KOA療效較好。它以巴戟天為君藥，具有抗腫瘤、強壯骨骼、抗疲勞、抗炎鎮(zhèn)痛、補血、促進(jìn)造血干細(xì)胞增殖和分化等作用［6-8］。去乙酰基車葉草苷酸是巴戟天環(huán)烯醚萜苷類成分之一，具有較強的抗炎、鎮(zhèn)痛作用，為巴戟天祛風(fēng)濕的物質(zhì)基礎(chǔ)成分［9-11］。本實驗采用HPLC法研究巴戟天在大鼠血液中的代謝和分布，為透骨消痛膠囊的作用機制研究提供實驗依據(jù)。

1材料

1.1儀器LC-20AT型高效液相色譜儀（日本島津公司）；AR-2140十萬分之一電子天平（梅特勒-托利多儀器上海有限公司）；FA2004N電子天平（上海精密科學(xué)儀器有限公司）；VXH-3型微型旋渦混合器（上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠）；TDL80-2B型高速離心機、TDL-4型低速臺式離心機（上海安亭科學(xué)儀器廠）；KQ-500E型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；采血管 （江蘇康健醫(yī)療用品有限公司，批號：120101）。

1.2試藥透骨消痛膠囊（福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二人民醫(yī)院院內(nèi)制劑，批號：20141017）；去乙?；嚾~草苷酸對照品（上海將來實業(yè)有限公司，批號：JL14022530）；甲醇（國藥集團化學(xué)試劑有限公司，色譜純，批號：20140323103）；其它試劑均為分析純。

1.3動物清潔級健康雄性SD大鼠，體質(zhì)量（250± 10）g，上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司提供，許可證號：SCXK（滬）2012-0002。

2透骨消痛膠囊灌胃溶液配制

稱取透骨消痛膠囊內(nèi)容物3.7 g置于100 mL瓶中，加純化水超聲，使內(nèi)容物形成均勻的混懸狀態(tài)，用純化水定容，搖勻，即得相當(dāng)于成人每日臨床劑量的藥物溶液。

3給藥方法與血樣采集

取大鼠60只，按體質(zhì)量隨機分為10組，每組6只。1組灌胃生理鹽水，其余9組灌胃透骨消痛膠囊內(nèi)容物溶液，按10 mg/kg劑量灌胃給藥，在給藥后30、45 min，1、2、4、6、8、10、24 h，通過眼眶采血2.5 mL，置于含乙二胺四乙酸的采血管中，3 800 r/min離心10 min，吸取上清液血漿，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

4高效液相色譜法

4.1色譜條件色譜柱：Vision HT C18（4.6 mm× 250 mm，5 μm）；去乙酰基車葉草苷酸流動相：甲醇-0.1%磷酸水溶液（5∶95）；檢測波長：237 nm；流速：1.0 mL/min；柱溫：25℃。

4.2血漿樣品預(yù)處理取血漿樣品100 μL置1.5 mL具塞塑料離心管中，加甲醇200 μL，渦旋2 min混勻，14 000 r/min離心 10 min，取上清液作為HPLC檢測樣品，進(jìn)樣10 μL。

4.3線性關(guān)系精密稱取去乙?；嚾~草苷酸對照品2.09 mg，置10 mL瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，即得去乙?；嚾~草苷酸209 μg/mL的對照品儲備液。用甲醇梯度稀釋，得去乙酰基車葉草苷酸濃度分別為 4.18、20.9、41.8、83.6、104.5、209.0 μg/mL的對照品溶液。取大鼠空白血漿100 μL，加入上述系列對照品溶液200 μL，按4.2項操作，以血漿樣品質(zhì)量濃度（C）為橫坐標(biāo)，峰面積（Y）為縱坐標(biāo)作圖，得去乙酰基車葉草苷酸的回歸方程：

Y＝19166C＋11125r＝0.9995

結(jié)果表明，混合藥物總質(zhì)量濃度在 （2.79～139.33）μg/mL，線性關(guān)系良好。4.4方法專屬性取大鼠空白血漿100 μL，按4.2項操作。將濃度為41.8 μg/mL的去乙酰基車葉草苷酸對照品溶液加入空白血漿中，同法操作。取受試大鼠給藥后收集的血漿樣品，同法操作，結(jié)果見圖1～圖3。結(jié)果表明大鼠血漿中的內(nèi)源性物質(zhì)不干擾去乙酰基車葉草苷酸成分的測定。

4.5精密度實驗制備去乙?；嚾~草苷酸低、中、高3種濃度（5.57、27.87、69.67 μg/mL）的樣品，每個濃度平行做5份，按4.2項操作，測定日內(nèi)精密度和日間精密度，結(jié)果低、中、高3種濃度去乙?；嚾~草苷酸的日內(nèi)精密度和日間精密度RSD分別為0.09%、0.53%、1.13%和3.62%、1.48%、1.03%。

4.6提取回收率和方法回收率實驗制備低、中、高3種濃度的樣品，按4.2項操作，測定各成分的峰面積，并與相應(yīng)濃度對照品甲醇溶液測得的峰面積相比，計算樣品的提取回收率，每個濃度平行做5份，結(jié)果低、中、高3種濃度水平去乙?；嚾~草苷酸的萃取回收率分別為113.24%（RSD為3.65%）、98.42%（RSD為3.65%）、109.95%（RSD為8.57%）。將各個樣品測得的峰面積代入回歸方程計算濃度，所得濃度與實際濃度的比值即為方法回收率，結(jié)果低、中、高3種濃度水平去乙酰基車葉草苷酸的方法回收率分別為105.36%（RSD為3.58%）、109.59% （RSD為1.67%）、95.05%（RSD為4.39%）。

4.7樣品穩(wěn)定性考察制備低、中、高3種濃度的樣品，按4.2項操作，于室溫下放置3 d，每日吸取10 μL樣品測定1次，計算其3天的穩(wěn)定性，結(jié)果低、中、高3種濃度水平去乙?；嚾~草苷酸的RSD分別為1.32%、1.59%、0.49%。

4.8藥代動力學(xué)參數(shù)大鼠灌胃口服透骨消痛膠囊后不同時間點血漿中去乙?；嚾~草苷酸平均血藥濃度-時間曲線見圖4。結(jié)合DAS2.0軟件確定房室模型，計算去乙酰基車葉草苷酸在大鼠體內(nèi)各藥代動力學(xué)參數(shù)，結(jié)果表明，大鼠口服透骨消痛膠囊后其藥時曲線符合單室模型，藥動學(xué)參數(shù)見表1。

表1　　去乙酰基車葉草苷酸的藥代動力學(xué)參數(shù)（±s）

表1　　去乙?；嚾~草苷酸的藥代動力學(xué)參數(shù)（±s）

藥動學(xué)參數(shù)吸收速率常數(shù)（Ka）消除半衰期（T1/2）達(dá)峰時間（Tmax）最大血藥濃度（Cmax）血藥濃度-時間曲線下面積（AUC0～24）清除率（CL/F）表觀分布容積（V/F）單位h-1 h h μg/L mg·h/L參數(shù)值0.89±0.02 1.73±0.22 2.09±0.03 2.27±0.45 10.64±0.69 L/（kg·h）L/kg 1.29±0.21 3.86±0.39

由表1 Ka＝0.89/h、T1/2＝1.73 h可知，吸收入血快，分布迅速。因Tmax＝2.09 h，說明經(jīng)過2.09 h達(dá)到最大血藥濃度Cmax＝2.27 μg/mL，T1/2＝1.73 h，CL/F＝1.29 L/（kg·h）。所以，藥物消除較慢，總濃度維持時間較長。

5討論

本實驗采用HPLC法，線性關(guān)系良好，精密度高，提取回收率和方法回收率，符合生物樣本分析的要求，為大鼠血漿中去乙酰基車葉草苷酸濃度分析及藥代動力學(xué)研究提供了一種較好的檢測方法。

［1］林木南，劉獻(xiàn)祥.透骨消痛方治療膝骨性關(guān)節(jié)炎30例［J］.福建中醫(yī)藥，2005，36（4）：15-16.

［2］黃云梅，陳文列，林如輝，等.透骨消痛膠囊促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖和分化［J］.中國組織工程研究，2013，17（33）：5923-5928.

［3］陳燕，肖曉金，包俠萍，等.透骨消痛方鎮(zhèn)痛抗炎作用實驗研究［J］.中醫(yī)學(xué)報，2013，28（11）：1675-1676.

［4］吳廣文，褚劍鋒，許惠鳳，等.透骨消痛膠囊含藥血清對退變關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞表達(dá)TNF-α、IL-1β的影響［J］.世界中西醫(yī)結(jié)合雜志，2012，7（4）：295-298.

［5］吳廣文，葉錦霞，許惠鳳，等.透骨消痛膠囊對KOA大鼠關(guān)節(jié)軟骨uPA系統(tǒng)相關(guān)調(diào)節(jié)因子的影響 ［J］.世界中西醫(yī)結(jié)合雜志，2015，10（1）：22-26.

［6］林美珍，鄭松，田惠橋.巴戟天研究現(xiàn)狀與展望［J］.亞熱帶植物科學(xué)，2010，39（4）：74-78.

［7］高兆錦，鄭云霞.巴戟天有效成分及其藥理作用分析［J］.中國保健營養(yǎng)，2013，23（1）：435-436.

［8］祝海燕.中藥巴戟天的藥理作用研究概況 ［J］.浙江臨床醫(yī)學(xué)，2013，15（8）：1240-1242.

［9］王玉磊，黃世敬，遲德軍，等.巴戟天中主要環(huán)烯醚萜苷的穩(wěn)定性研究［J］.中國實驗方劑學(xué)雜志，2011，17（21）：65-68.

［10］吳凌鳳，曾令杰.巴戟天化學(xué)成分與質(zhì)量控制研究進(jìn)展［J］.廣東藥學(xué)院學(xué)報，2012，28（1）：98-101.

［11］王玉磊，崔翰明，黃世敬，等.HPLC測定不同產(chǎn)地和批次巴戟天中主要環(huán)烯醚萜苷含量［J］.中藥材，2011，34（8）：1187-1190.

R285.5

B

1000-338X（2016）03-0014-02

2016-04-25

福建中醫(yī)藥大學(xué)重點學(xué)科專項（X2014099-學(xué)科）

范哲賢（1990—），男，2014級中藥學(xué)專業(yè)碩士研究生，主要從事中藥制劑及質(zhì)量控制研究

李孝棟（1969—），男，教授。E-mail：lxdtcm@163.com