陳 露，陳季旺，2，*，蔡 俊，丁文平，2，吳永寧，3（.武漢輕工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，湖北 武漢 430023；2.農(nóng)產(chǎn)品加工湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心，湖北 武漢 430023；3.國家食品安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估中心，北京 0002）

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大米鎘結(jié)合蛋白的分離純化及純度鑒定

陳 露1，陳季旺1，2，*，蔡 俊1，丁文平1，2，吳永寧1，3
（1.武漢輕工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，湖北 武漢 430023；2.農(nóng)產(chǎn)品加工湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心，湖北 武漢 430023；3.國家食品安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估中心，北京 100021）

摘 要：采用石墨爐原子吸收光譜法（graphite furnace atomic absorption spectrometry，GFAAS）測定不同品種、不同加工精度大米及大米4 種蛋白質(zhì)中的鎘含量。選用鎘含量較高的大米為實(shí)驗(yàn)原料，采用Osborne分級(jí)法提取大米中的4 種蛋白質(zhì)（清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白），以及超濾、離子交換色譜從鎘含量較高的大米蛋白中分離純化出均一純度的大米鎘結(jié)合蛋白（rice Cd-binding protein，RCBP），十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）鑒定RCBP的純度及測定分子質(zhì)量。結(jié)果表明：秈米中鎘含量高于糯米及粳米；隨著加工精度的增加，同種大米中的鎘含量依次降低。4 種大米蛋白中的鎘含量分別為0.66、0.31、0.63、0.23 μg/g，清蛋白中鎘含量最高。超濾分離大米清蛋白（rice albumin，RA）得到大米超濾清蛋白（rice ultrafiltration albumin，RUA），離子交換色譜純化RUA得到目標(biāo)鎘結(jié)合蛋白（組分c），SDS-PAGE鑒定組分c為單一條帶，分子質(zhì)量為14 kD。

關(guān)鍵詞：大米鎘結(jié)合蛋白；分離純化；離子交換色譜；分子質(zhì)量

引文格式：

陳露， 陳季旺， 蔡俊， 等.大米鎘結(jié)合蛋白的分離純化及純度鑒定［J］.食品科學(xué)， 2016， 37（13）: 60-64.DOI:10.7506/ spkx1002-6630-201613011. http://www.spkx.net.cn

CHEN Lu， CHEN Jiwang， CAI Jun， et al.Separation， purification， and purity identification of Cd-binding protein from rice［J］.Food Science， 2016， 37（13）: 60-64.（in Chinese with English abstract） DOI:10.7506/spkx1002-6630-201613011.http://www.spkx.net.cn

近年來我國出現(xiàn)的鎘污染問題有許多報(bào)道，有針對(duì)性的檢測和研究工作開展較多［1］。研究者對(duì)我國20世紀(jì)80年代確認(rèn)的南方某省的土壤鎘污染進(jìn)行了研究，檢測了蔬菜、糧食、肉類、禽蛋等樣品中的鎘含量，研究結(jié)果顯示肉類、禽蛋樣品中鎘含量均未超標(biāo)，不同種類的蔬菜鎘含量的超標(biāo)率各不相同，糧食中的大米鎘含量的超標(biāo)率高達(dá)63.5%［2］，大米中重金屬超標(biāo)已是迫切需要解決的問題［3］。

鎘可與食品成分結(jié)合呈現(xiàn)絡(luò)合態(tài)。研究發(fā)現(xiàn)污染地區(qū)貽貝體內(nèi)的鎘以與分子質(zhì)量約60 kD的蛋白質(zhì)結(jié)合形態(tài)存在［4］；大豆中的鎘與蛋白質(zhì)以結(jié)合的形態(tài)存在，其分子質(zhì)量在150～200 kD以上，約占大豆總鎘的30%。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)大豆蛋白可絡(luò)合鎘從而緩解了毒性［5］，因此，研究大米鎘結(jié)合蛋白（rice cadmium binding protein，RCBP）具有重要的現(xiàn)實(shí)意義和實(shí)際價(jià)值。

目前國內(nèi)外對(duì)鎘與不同來源的蛋白質(zhì)結(jié)合形成的鎘結(jié)合蛋白已有很多報(bào)道，已發(fā)現(xiàn)了海洋動(dòng)物［6-8］、昆蟲［9］、小鼠［10］等動(dòng)物源以及大豆［5］、亞麻籽［11］、玉米［12］、柱狀田頭菇［13］等植物源鎘結(jié)合蛋白，其中富含巰基、能螯合大量金屬離子的金屬硫蛋白的研究較多，研究方法也比較成熟。1957年，鎘結(jié)合蛋白首次由Margoshes等［14］從馬的腎臟皮質(zhì)中分離得到，分析成分發(fā)現(xiàn)該鎘結(jié)合蛋白質(zhì)中硫元素含量較高。Pedersen等［15］依次采用離子交換樹脂樹脂Q Sepharose、凝膠層析Superdex 30純化大麥蟲中的鎘結(jié)合蛋白，得到一個(gè)表觀分子質(zhì)量為7 500 D的鎘結(jié)合蛋白；Winge等［10］采用Sephadex G-75純化大鼠肝臟中的鎘結(jié)合蛋白，分析氨基酸組成發(fā)現(xiàn)該鎘結(jié)合蛋白是金屬硫蛋白。但植物源鎘結(jié)合蛋白的研究處于初步階段，有關(guān)RCBP的研究未見報(bào)道?？讘c新［16］和楊居榮［17］等的研究分析了稻谷中鎘的分布位置及大米中鎘以結(jié)合蛋白質(zhì)的方式存在，尚未分析鎘結(jié)合蛋白的理化性質(zhì)及鎘與大米蛋白的結(jié)合機(jī)理。

本實(shí)驗(yàn)通過分析不同品種及加工精度大米中的鎘含量，選用一種鎘含量較高的大米為原料。根據(jù)Osborne分級(jí)法提取大米中的4 種蛋白質(zhì)組分：清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白，分析4 種蛋白質(zhì)組分中的鎘含量。提取鎘含量較高的大米蛋白組分，經(jīng)超濾分離，離子交換色譜純化，制備出純度均一的RCBP，以期為研究RCBP的形成機(jī)理提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

X1～X5（秈米）、J1～J5（粳米）、N1～N5（糯米） 武漢市武商量販常青花園店；X6～X9（秈稻） 武漢市糧庫。

甘氨酸、考馬斯亮藍(lán)R-2 5 0、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）、NaCl、鹽酸 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；牛血清白蛋白 上海碧云天生物技術(shù)有限公司；三羥甲基氨基甲烷（tris（hydroxymethyl）metyl aminomethane，Tris） 美國Sigma公司；DEAE-Sephadex A-25 美國Pharmacia公司。所有試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

DDS-11C電導(dǎo)率儀 上海雷磁儀器廠；LD5-10型離心機(jī) 北京醫(yī)用離心機(jī)廠；LG-3型冷凍干燥機(jī) 蕪湖萬通集團(tuán)；Φ3.0 cm×30 cm玻璃層析柱 武漢集思儀器設(shè)備有限公司；HD-3紫外檢測儀、BSZ-100自動(dòng)部分收集器、HL-2S恒流泵 上海滬西分析儀器廠；FD-1冷凍干燥機(jī) 天津儀器公司；TAS-990原子吸收光譜儀（配GFH-990石墨爐） 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；Bio-Rad Mini-PROTEAN-3電泳儀（配電泳槽） 美國Bio-Rad公司；超濾裝置（膜面積為0.2 m2，截留分子質(zhì)量5 000 D） 上海亞東核級(jí)樹脂有限公司；RE52CS旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 大米及其蛋白質(zhì)中鎘含量的測定

采用石墨爐原子吸收光譜法（graphite furnace atomic absorption spectrometry，GFAAS），濕法消化［18］。

1.3.2 不同品種大米選取

選取秈米、粳米和糯米各3 種，大米去雜質(zhì)，超純水洗凈，晾干，磨碎，過80 目篩，貯藏于密封袋中，測定其鎘含量。

1.3.3 不同加工精度大米制備

碾米：分別設(shè)定不同的檢驗(yàn)精米機(jī)碾白時(shí)間，每次用天平稱取20 g糙米倒入檢驗(yàn)精米機(jī)，碾削得到精米，在這一過程中碾米時(shí)間不同，得到碾削程度不同的精米。

檢驗(yàn)：采用品紅石碳酸溶液染色法［19］對(duì)所有大米樣品進(jìn)行樣品加工精度等級(jí)判斷，分別制備出糙米、一等米、二等米和三等米，大米去雜質(zhì)，超純水洗凈，晾干，磨碎，過80 目篩，貯藏于密封袋中，測定不同加工精度大米的鎘含量。

1.3.4 4 種大米蛋白組分的提取

參考Osborne分級(jí)法提取大米中的清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白組分，具體提取步驟見圖1［20］。測定4 種大米蛋白組分的鎘含量。

1.3.5 超濾分離

采用上海亞東核級(jí)樹脂有限公司生產(chǎn)的內(nèi)壓式聚砜中空纖維超濾膜，膜面積為0.2 m2，截留分子質(zhì)量5 000 D。取4 種大米蛋白中鎘含量最高，為0.7 mg/mL大米蛋白液5 L，超濾膜對(duì)該大米蛋白液分離、濃縮，濃縮倍數(shù)為5 倍，測定超濾濃縮液中蛋白質(zhì)及鎘含量。

1.3.6 離子交換色譜純化

采用DEAE-Sephadex A-25多孔凝膠作為固定相，純化色譜條件：先用起始緩沖液進(jìn)行洗脫，起始緩沖液為pH 8.0 Tris-HCl緩沖液，洗脫體積為100 mL；再用離子濃度從0～1 mol/L NaC1、0.05 mol/L Tris-HCl緩沖液線性洗脫，洗脫體積為450 mL；最后用2 mol/L NaC1、0.05 mol/L Tris-HC1緩沖液進(jìn)行洗脫，洗脫體積為50 mL。洗脫速率為1.5 mL/min、檢測波長為280 nm。

利用連續(xù)梯度混合器，分步收集100 個(gè)組分，每個(gè)組分相當(dāng)于約1%總梯度體積，在280 nm波長處測各組分的吸光度以確定蛋白質(zhì)峰。

1.3.7 透析脫鹽

將透析袋放在3 L盛滿蒸餾水的燒杯中，置室溫下透析，每隔4～5 h更換一次燒杯中的蒸餾水，更換兩次，再隔夜透析一次，換水前后均測電導(dǎo)率，直至透析外液的電導(dǎo)率接近蒸餾水時(shí)，終止透析。

1.3.8 干燥

采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，水浴溫度設(shè)為40 ℃，蒸發(fā)濃縮除去大部分水分。先將濃縮好的樣品置于－18 ℃冷凍過夜后，置于真空冷凍干燥機(jī)中冷凍干燥。

1.3.9 SDS-PAGE分析

蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度均為10 mg/mL的提取、超濾和離子交換層析制備的RCBP分別于1.5 mL離心管中，加入5×SDS的上樣緩沖液20 μL，混勻，沸水浴10 min，冷卻待用。將10 μL樣品注入樣品池，電壓先調(diào)到60 V，40 min后改為110 V。采用12%分離膠、5%濃縮膠，用0.1%考馬斯亮藍(lán)R-250染色，10%醋酸-5%乙醇洗脫液脫色，直至蛋白條帶清晰［19］。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)應(yīng)用Excel軟件、Origin軟件及SPSS軟件進(jìn)行處理和分析。采用方差分析（analysis of variance，ANOVA），并采用Duncan's檢驗(yàn)進(jìn)行顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同品種和加工精度大米的鎘含量分析

采集15 個(gè)武漢當(dāng)?shù)厥惺鄢Ｓ么竺讟悠?，采用GFAAS法測定其鎘含量，測定結(jié)果見表1。單樣本K-S檢驗(yàn)分析大米中鎘含量得：P＞0.05，即數(shù)據(jù)呈正態(tài)分布，其鎘含量范圍為21.86～213.43 μg/kg，平均值為97.14 μg/kg，中位數(shù)為78.33 μg/kg，平均值和中位數(shù)均低于國家標(biāo)準(zhǔn)限量（200 μg/kg）［21］，20%秈米樣品鎘含量超標(biāo)。

從品種上分，粳米的鎘含量范圍為21.86～80.94 μg/kg，平均值為4 9.9 3 μ g/k g，秈米的鎘含量范圍為151.74～213.43 μg/kg，平均值為176.80 μg/kg，糯米的鎘含量范圍為26.51～108.50 μg/kg，平均值為64.72 μg/kg，根據(jù)現(xiàn)有大米樣品分析結(jié)果得出，秈米的鎘含量高于粳米和糯米，糯米的鎘含量高于粳米。

注：表中結(jié)果均以干基計(jì)。下同。

選取4 種秈米，由糙米依次加工成三等大米、二等大米和一等大米，測定其鎘含量，結(jié)果見表2。隨著加工精度的增加，同種大米中的鎘含量依次降低，不同品種的大米降低程度不同，4 種不同加工精度大米中的鎘平均值按照糙米、三等大米、二等大米、一等大米的順序分別為215.31、173.64、156.06、142.72 μg/kg，糙米和一等大米差異顯著（P＜0.05），說明加工精度在一定程度上影響了大米中的鎘含量。其中，將糙米加工到一等大米，能顯著性降低大米中鎘含量。這可能是大米中的有機(jī)鎘主要是鎘結(jié)合蛋白，蛋白質(zhì)在稻米中呈不均勻分布，在胚及糊粉層中含量較高，胚乳中較低，一等大米主要是稻米的胚乳部分，90%以上的糊粉層及胚被除去。但糙米的平均值為215.31 μg/kg，高于國家標(biāo)準(zhǔn)限量（200 μg/kg）［21］，因此選用秈糙米研究鎘結(jié)合蛋白的形成機(jī)理具有現(xiàn)實(shí)意義。本研究選取鎘含量最高的秈糙米X9為實(shí)驗(yàn)原料，提取鎘結(jié)合蛋白。

注：同行小寫字母不同表示差異顯著（P＜0.05）。

2.2 4 種大米蛋白組分中的鎘含量

根據(jù)鎘Osborne分級(jí)法提取4 種大米蛋白組分，測定鎘含量，結(jié)果見表3。鎘在4 種大米蛋白組分中的含量差異明顯，鎘含量分別為0.66、0.31、0.63、0.23 μg/g，清蛋白中鎘含量最高，其次為醇溶蛋白、球蛋白、谷蛋白。與楊居榮等［17］得出可溶于水的清蛋白中鎘的濃度較高的結(jié)論類似。該結(jié)果表明鎘更易與清蛋白和醇溶蛋白相結(jié)合，因此制備鎘結(jié)合蛋白時(shí)，對(duì)清蛋白進(jìn)行分離純化更容易得到目標(biāo)鎘結(jié)合蛋白。

表 3 4 種大米蛋白中鎘含量（x±s，n=3）Table 3 Cadmium contents in four rice proteins （x±s，n= 3）蛋白質(zhì)種類 蛋白質(zhì)質(zhì)量/g 鎘質(zhì)量/μg 鎘與蛋白質(zhì)質(zhì)量比/（μg/g）清蛋白 0.66±0.01 0.44±0.00 0.66球蛋白 0.81±0.01 0.25±0.00 0.31醇溶蛋白 0.44±0.01 0.28±0.00 0.63谷蛋白 5.19±0.02 1.19±0.01 0.23

2.3 超濾前后清蛋白的成分變化

大米清蛋白（rice albumin，RA）超濾前后蛋白質(zhì)和鎘質(zhì)量變化結(jié)果見表4。蛋白質(zhì)的損失率為6.65%，鎘的損失率為8.28%，蛋白質(zhì)和鎘的損失率未超過10%，說明超濾可用于濃縮RA。

注：同列小寫字母不同表示差異顯著（P＜0.05）。

2.4 離子交換色譜純化

采用DEAE-Sephadex A-25離子交換色譜純化大米超濾清蛋白（rice ultrafiltration albumin，RUA）中的鎘結(jié)合蛋白，RUA質(zhì)量濃度為50 mg/mL，上樣量5 mL，收集不同的組分，結(jié)果見圖2。樣品的部分收集組分在280 nm波長處的吸光度變化出現(xiàn)3 個(gè)紫外吸收峰，得到組分a、b、c。

2.5 純化各組分中蛋白質(zhì)及鎘含量分析

離子交換色譜純化RUA得到的組分a、組分b和組分c及組分經(jīng)透析脫鹽、冷凍干燥得到固體組分a、組分b和組分c。取各組分0.1 g，測定其蛋白質(zhì)質(zhì)量和鎘含量，并計(jì)算各組分中蛋白質(zhì)含量、鎘質(zhì)量及每克蛋白質(zhì)中含有的鎘質(zhì)量，結(jié)果見表5。3 個(gè)組分的蛋白質(zhì)含量差異不明顯，均為82 mg左右，而鎘含量差異明顯。組分a、組分b和組分c中，每克蛋白質(zhì)中鎘質(zhì)量分別為498.99、574.61 ng和2 309.95 ng，組分c中每克蛋白質(zhì)中鎘質(zhì)量是組分a、組分b的6 倍左右，即組分c的持鎘能力遠(yuǎn)高于組分a和組分b，因此確定組分c是目標(biāo)鎘結(jié)合蛋白，且DEAE-Sephedex A-25凝膠層析色譜可以用于RCBP的純化。

表 5 組分a、b、c中蛋白質(zhì)和鎘的質(zhì)量Table5 Contents of protein and cadmiumin fractions a， b and c樣品 蛋白質(zhì)質(zhì)量/mg 鎘質(zhì)量/ng 鎘與蛋白質(zhì)質(zhì)量比/（ng/g）a 82.05 40.91 498.99 b 81.14 46.54 574.61 c 83.32 191.73 2 309.95

2.6 SDS-PAGE分析

采用SDS-PAGE鑒定RA、RUA和組分c的純度以及測定分子質(zhì)量，RA、RUA和RCBP的SDS-PAGE圖譜如圖3、4所示。由圖3可知，RA、RUA在35、20、14 kD附近有條帶，在14 kD出現(xiàn)的條帶最清晰，RA的電泳結(jié)果與李亦蔚［22］報(bào)道的基本一致。組分c顯示出一個(gè)單一的條帶14 kD（圖4），去除了35、20 kD的蛋白質(zhì)，說明該提取、分離及純化方法能制備出純度均一的RCBP，即組分c。Thomas等［23］從鱒魚的鰓部、肝臟組織中分離出分子質(zhì)量分別為13.5 kD和14 kD的兩種非金屬硫蛋白。Meisch等［24］從菌類中提取出一種鎘結(jié)合蛋白，分子質(zhì)量約12 kD。Dohi等［25］從海螺體內(nèi)提取了分子質(zhì)量分別為8 kD和13 kD的兩種鎘結(jié)合蛋白。楊紅玉等［26］通過鎘誘導(dǎo)綠藻中的蛋白質(zhì)，成功提取了兩種分子質(zhì)量分別為12.6 kD和12.0 kD的鎘結(jié)合蛋白。RCBP的分子質(zhì)量與上述研究者研究的鎘結(jié)合蛋白的分子質(zhì)量類似，是一種低分子質(zhì)量的鎘結(jié)合蛋白。

3 結(jié) 論

分析15 種武漢當(dāng)?shù)厥惺鄢Ｓ么竺讟悠分墟k含量顯示，秈米中鎘含量高于糯米及粳米；隨著加工精度的增加，糙米和一級(jí)大米差異顯著，說明品種和加工精度明顯影響大米中的鎘含量。清蛋白中鎘濃度最高，其次為醇溶蛋白、球蛋白、谷蛋白，表明鎘更易與清蛋白結(jié)合，因此制備鎘結(jié)合蛋白時(shí)，對(duì)清蛋白進(jìn)行分離純化更容易得到目標(biāo)鎘結(jié)合蛋白。采用超濾、離子交換色譜從RA中分離純化得到目標(biāo)鎘結(jié)合蛋白（組分c），SDS-PAGE鑒定組分c為單一蛋白質(zhì)組分，其分子質(zhì)量為14 kD，說明超濾、離子交換色譜是分離純化RCBP的良好手段。

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DOI:10.7506/spkx1002-6630-201613011

中圖分類號(hào)：TS254.4

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1002-6630（2016）13-0060-05

收稿日期：2015-12-26

基金項(xiàng)目：糧食公益性行業(yè)科研專項(xiàng)（201513006-3）；武漢輕工大學(xué)重大項(xiàng)目培育專項(xiàng)（2011Z05）；武漢市國際合作項(xiàng)目（201231234466）；湖北省自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（2014CFB888）；武漢輕工大學(xué)研究生創(chuàng)新基金項(xiàng)目（2012cx012；2013cx011）

作者簡介：陳露（1991—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称窢I養(yǎng)與安全。E-mail：loiscl@126.com

*通信作者：陳季旺（1970—），男，教授，博士，研究方向?yàn)槭称窢I養(yǎng)與安全。E-mail：jiwangchen1970@126.com

Separation， Purification， and Purity Identification of Cd-Binding Protein from Rice

CHEN Lu1， CHEN Jiwang1，2，*， CAI Jun1， DING Wenping1，2， WU Yongning1，3
（1.College of Food Science and Engineering， Wuhan Polytechnic University， Wuhan 430023， China；2.Hubei Collaborative Innovation Center for Processing of Agricultural Products， Wuhan 430023， China；3.National Center for Food Safety Risk Assessment， Beijing 100021， China）

Abstract:A graphite furnace atomic absorption spectrometry （GFAAS） method was used to determine the cadmium content in rice grains from different varieties and at milling levels， as well as in four rice seed storage proteins （albumin， globulin，prolamin and glutelin） obtained through the Osborne sequential extraction method.Moreover， rice cadmium-binding protein （RCBP） was separated and purified to homogeneity by using ultrafiltration and ion exchange chromatography.The purity and molecular mass of RCBP were identified.The results showed that the cadmium content in indica rice was higher than that in glutinous rice and japonica rice and the cadmium content in rice decreased with the increase of milling level.The cadmium contents of rice albumin， globulin， prolamin， and glutelin were 0.66， 0.31， 0.63 and 0.23 μg/g， respectively.RCBP （fraction c）with high purity and good homogeneity as well as molecular mass of 14 kD was prepared from rice albumin （RA）.

Key words:rice Cd-binding protein； separation and purification； ion exchange chromatography； molecular mass