關(guān)樺楠，韓博林，瑙阿敏，王 鑫，徐麗萍，孫 璐（.哈爾濱商業(yè)大學(xué)食品工程學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 50076；.東北林業(yè)大學(xué)鹽堿地生物資源環(huán)境研究中心，黑龍江 哈爾濱 50040）

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葡萄糖氧化酶脂質(zhì)體的制備與表征

關(guān)樺楠1，2，韓博林1，瑙阿敏1，王 鑫1，徐麗萍1，孫 璐2
（1.哈爾濱商業(yè)大學(xué)食品工程學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150076；2.東北林業(yè)大學(xué)鹽堿地生物資源環(huán)境研究中心，黑龍江 哈爾濱 150040）

摘 要：以大豆卵磷脂和膽固醇作為壁材，采用薄膜蒸發(fā)-凍融法制備葡萄糖氧化酶脂質(zhì)體。以包封率作為指標(biāo)，通過單因素和正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化確定最佳制備工藝，并考察脂質(zhì)體的形貌、粒徑分布和穩(wěn)定性指標(biāo)。結(jié)果表明：最佳工藝參數(shù)為：大豆卵磷脂與膽固醇質(zhì)量比4∶1、芯材質(zhì)量5 mg（500 U）、水化時(shí)間15 min、凍融循環(huán)10 次，此條件下包封率可達(dá)到（87.7±2.1）%；粒徑分布均勻，分散性較好，平均粒徑為（164.75±2.55） μm；4 ℃和室溫（23.0±0.5）℃貯存條件下脂質(zhì)體包封率無變化，酶活性穩(wěn)定。

關(guān)鍵詞：葡萄糖氧化酶；脂質(zhì)體；穩(wěn)定性；薄膜蒸發(fā)-凍融法；表征

引文格式：

關(guān)樺楠， 韓博林， 瑙阿敏， 等.葡萄糖氧化酶脂質(zhì)體的制備與表征［J］.食品科學(xué)， 2016， 37（13）: 120-124.DOI:10.7506/ spkx1002-6630-201613021. http://www.spkx.net.cn

GUAN Huanan， HAN Bolin， NAO Amin， et al.Preparation and characterization of glucose oxidase liposomes［J］.Food Science，2016， 37（13）: 120-124.（in Chinese with English abstract） DOI:10.7506/spkx1002-6630-201613021. http://www.spkx.net.cn

葡萄糖氧化酶（glucose oxidase，GOD）是一種常見的需氧脫氫酶，在分子氧的存在下，利用氧為電子受體，特異性的催化氧化β-D-葡萄糖生成D-葡萄糖酸內(nèi)酯，同時(shí)消耗氧生成過氧化氫［1］。GOD多分布在植物、動(dòng)物和微生物中，具有專一性強(qiáng)、高效和生物相容性良好的特點(diǎn)［2］。目前，它被廣泛地應(yīng)用于食品脫氧、除菌、面粉改良和防止褐變等諸多領(lǐng)域，是最為重要的食品工業(yè)用酶之一［3-7］。然而，游離的GOD在使用中易失活和貯存穩(wěn)定性差的缺點(diǎn)嚴(yán)重的制約了其在食品工業(yè)中的深層次應(yīng)用［8］。為了解決這一問題，GOD固定化技術(shù)的探索與改良成為目前研究的熱點(diǎn)。脂質(zhì)體是由磷脂類雙分子層所構(gòu)成的一種單室或多室囊泡結(jié)構(gòu)，其結(jié)構(gòu)類似生物膜，又稱人工生物膜［9-11］。研究表明，脂質(zhì)體可作為生物活性酶載體，通過囊化作用延長(zhǎng)生物酶的壽命，有效地保持其活性［12］。常見的制備方法有薄膜法、凍融法、注入法、超聲波法和表面活性劑法等［13-17］。其中，薄膜蒸發(fā)法是將磷脂與膽固醇和藥物共溶于氯仿（或其他有機(jī)溶劑）中，通過減壓蒸發(fā)在容器內(nèi)壁形成均勻薄膜［13，18］。這種方法制備的脂質(zhì)體包裹容積較大，對(duì)脂溶性或水溶性藥物均可獲得較高的包封率，操作簡(jiǎn)單［19］。如干擾素［20］、紫杉醇［21］、紅景天苷［22］等均用此法制得脂質(zhì)體。凍融法是指快速冷凍過程中，由于冰晶的形成，使形成的脂質(zhì)體膜破裂，形成冰晶的片層與破碎的膜同時(shí)存在，在緩慢融化過程中，暴露出的脂膜互相融合重新形成脂質(zhì)體，采用此法制備的脂質(zhì)體具有均一的粒徑分布，且膜壁機(jī)械強(qiáng)度較高［23-25］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)合兩種方法的優(yōu)勢(shì)，采用薄膜蒸發(fā)-凍融聯(lián)用法制備大粒徑GOD脂質(zhì)體。通過對(duì)包封率的考察，確定脂質(zhì)體的最佳制備工藝，并對(duì)其進(jìn)行表征，評(píng)估脂質(zhì)體中GOD的穩(wěn)定性。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

葡萄糖氧化酶（100 U/mg）、魚精蛋白、大豆卵磷脂、膽固醇 美國(guó)Sigma-Aldrich公司；吐溫-20、靛藍(lán)胭脂紅（批號(hào)：20110607） 天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司。

R-201旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海申順生物科技有限公司；TU-1900雙光束紫外-可見分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；BT-9300H激光粒度分布儀 美國(guó)惠普公司；JDG-0.2凍干機(jī) 蘭州科近真空凍干技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 GOD脂質(zhì)體制備工藝的單因素試驗(yàn)

按照不同質(zhì)量比例（1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1）分別稱取大豆卵磷脂和膽固醇（作為壁材），吸取一定質(zhì)量的葡萄糖氧化酶粉末（0.05、1、3、5、10 mg）及吐溫-20共溶于10 mL的二氯甲烷中。30 ℃恒溫水浴，調(diào)節(jié)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀的轉(zhuǎn)速為100 r/min，待茄形瓶?jī)?nèi)有機(jī)溶劑除凈且內(nèi)壁出現(xiàn)均勻的蜂窩狀透明薄膜后，加入5 mL pH 7.4的磷酸鹽緩沖液，繼續(xù)水化一定時(shí)間（5、10、15、20、25 min），使薄膜溶脹水和完全，得到懸浮液后取出。微孔濾膜過濾去雜質(zhì)，將濾液置于液氮中1 min，待冷凍完全后迅速放入37 ℃的水浴鍋中，完全融化后再次放入液氮中冷凍，如此反復(fù)，經(jīng)過一定的循環(huán)次數(shù)（5、10、15、20、25 次），至樣品完全融化后，于室溫放置10 min，反復(fù)離心清洗3 次獲得GOD脂質(zhì)體，4 ℃密封保存，以包封率為指標(biāo)，選擇壁材質(zhì)量比（大豆卵磷脂與膽固醇的質(zhì)量比）、芯材質(zhì)量（GOD的質(zhì)量）、凍融次數(shù)和水化時(shí)間作為考察因素，優(yōu)化GOD脂質(zhì)體的制備工藝。

1.2.2 GOD脂質(zhì)體制備工藝的正交試驗(yàn)優(yōu)化設(shè)計(jì)

通過上述單因素優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果，分別獲得4 個(gè)因素中最適的3 個(gè)水平，采用L9（34）正交試驗(yàn)表，優(yōu)化制備工藝，以脂質(zhì)體包封率作為衡量指標(biāo)，并利用DPS 7.05軟件對(duì)正交結(jié)果進(jìn)行分析，最終確定GOD脂質(zhì)體的最佳制備工藝條件（n=5）。

1.2.3 GOD活力的測(cè)定

參照周建芹等［1］方法，采用靛藍(lán)胭脂紅褪色分光光度法繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，測(cè)定GOD活性。酶活力單位定義為：37 ℃條件下，1 min內(nèi)催化葡萄糖氧化反應(yīng)產(chǎn)生1 μg過氧化氫所需的酶量為1 U。

1.2.4 GOD脂質(zhì)體包封率的測(cè)定

采用魚精蛋白沉淀法去除體系中游離的GOD［19］。準(zhǔn)確稱取1 mg的GOD脂質(zhì)體凍干粉末和1 mL的魚精蛋白液（10 mg/mL），漩渦振蕩混合均勻，靜置5 min，加去離子水1 mL混勻，1 000 r/min離心5 min，去上清液，除去游離的酶，再加入適量甲醇，漩渦振蕩器混勻，溶脹后檢測(cè)酶活力，此即為脂質(zhì)體內(nèi)酶活力。按下式計(jì)算GOD脂質(zhì)體包封率［24］。

1.2.5 GOD脂質(zhì)體的表征

按最佳工藝制備GOD脂質(zhì)體，采用透射電子顯微鏡觀察脂質(zhì)體凍干樣品的整體表觀形貌，利用激光散射粒度儀測(cè)定GOD脂質(zhì)體的粒徑大小及分布范圍。

為了評(píng)估GOD脂質(zhì)體所包埋酶的穩(wěn)定性，根據(jù)活性包封率計(jì)算結(jié)果，選取相同含量和活性的游離酶液為參照樣品。將5 mg GOD脂質(zhì)體粉末懸浮于1 mL去離子水中并與相同含量活性的游離酶一起放置于4 ℃和室溫（23.0±0.5） ℃避光環(huán)境中，于不同的時(shí)間（0、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60 d）測(cè)定脂質(zhì)體中GOD和游離GOD的相對(duì)酶活力（即實(shí)際酶活力與初始酶活力的比值）［8］。

2 結(jié)果與分析

2.1 壁材質(zhì)量比對(duì)GOD脂質(zhì)體包封率的影響

傳統(tǒng)的脂質(zhì)體制備方法獲得的脂質(zhì)體存在包封率低、穩(wěn)定性差的特點(diǎn)，因此本實(shí)驗(yàn)選擇改良后的薄膜蒸發(fā)法-凍融聯(lián)用法來制備GOD脂質(zhì)體，采用魚精蛋白沉淀法去除游離的GOD，以檢測(cè)不到游離酶活性為標(biāo)準(zhǔn)，評(píng)估GOD脂質(zhì)體的包封率，并以此為指標(biāo)進(jìn)行單因素優(yōu)化試驗(yàn)。首先，篩選設(shè)計(jì)不同壁材質(zhì)量比（m（大豆卵磷脂）∶m（膽固醇）分別為1∶1、2∶1、3∶1、4∶1和5∶1，其中膽固醇為0.01 g）參與優(yōu)化試驗(yàn)。由圖1可知，當(dāng)壁材質(zhì)量比為3∶1、4∶1和5∶1時(shí)，包封率較大，其中當(dāng)壁材質(zhì)量比為4∶1時(shí)，包封率達(dá)到最大值81.46%。方差分析結(jié)果（表1）表明，壁材質(zhì)量比對(duì)脂質(zhì)體的包封率具有顯著影響。部分研究結(jié)果證實(shí)，膽固醇是一種兩性化合物，可以插入脂質(zhì)雙層膜間，親水性基團(tuán)趨向水相表面，脂肪鏈平行排列在脂質(zhì)雙層膜中心的烷基鏈；但是，當(dāng)膽固醇含量大于某一范圍時(shí)，它可以降低藥物分子在雙層膜間的分配，從而引起包封率的下降，這與本試驗(yàn)的結(jié)果基本相似［10］。綜上所述，選擇壁材質(zhì)量比為3∶1、4∶1和5∶1這3 個(gè)水平參與正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)。

注：*.差異顯著（P＜0.05）。下同。

2.2 芯材質(zhì)量對(duì)GOD脂質(zhì)體包封率的影響

脂質(zhì)體既可以包埋水溶性的芯材，也可以包埋脂溶性的芯材，但多項(xiàng)研究結(jié)果表明，水溶性芯材的包埋效果明顯不如脂溶性芯材［25-27］。本實(shí)驗(yàn)的芯材為溶于水相的葡萄糖氧化酶，因此選擇芯材質(zhì)量作為優(yōu)化因素。分別選擇0.05、1、3、5、10 mg的葡萄糖氧化酶進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。結(jié)果如圖2所示，當(dāng)芯材（GOD）質(zhì)量增加，包封率逐漸提高，當(dāng)GOD質(zhì)量達(dá)到5 mg時(shí)，包封率數(shù)值基本穩(wěn)定，約為74.0%。原因是當(dāng)GOD質(zhì)量超過5 mg時(shí)，超出了脂質(zhì)膜的飽和限度，造成了脂質(zhì)體的溶脹，進(jìn)而影響了包封率。方差分析（表2）表明，芯材質(zhì)量對(duì)脂質(zhì)體的包封率具有顯著性影響。因此選擇芯材質(zhì)量3（約300 U）、5（約500 U）、10 mg（約1 000 U）3 個(gè)水平參與正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)。

表 2 方差分析Table 2 Analysis of variance項(xiàng)目 平方和 自由度 均方 F值 顯著性組間 3 318.291 4 829.573 267.547 *組內(nèi) 31.007 10 3.101總數(shù) 3 349.297 14

2.3 水化時(shí)間對(duì)GOD脂質(zhì)體包封率的影響

在脂質(zhì)體的制備過程中，水化的作用是極為重要的，本實(shí)驗(yàn)中磷脂與膽固醇在形成薄膜后加入水化液，才可以使貼在內(nèi)壁的磷脂層有序的卷曲脫離形成脂質(zhì)體［26］。由圖3可知，水化時(shí)間越長(zhǎng)包封率越大，且該因素具有一定的顯著性影響（表3），但是相關(guān)研究中提到［10，27］，水化時(shí)間過長(zhǎng)容易造成壁材和芯材的氧化，綜合考慮，選擇15、20、25 min作為最適的3 個(gè)水平。

表 3 方差分析Table 3 Analysisof variance項(xiàng)目 離差平方和 自由度 均方 F值 顯著性組間 808.231 4 202.058 125.866 *組內(nèi) 16.053 10 1.605總數(shù) 824.284 14

2.4 凍融次數(shù)對(duì)GOD脂質(zhì)體包封率的影響

在循環(huán)凍融的過程中，較適宜的凍融次數(shù)，可以使脂質(zhì)體粒徑趨于均勻化，使包封率及穩(wěn)定性有所改良［11］。由表4可知，凍融次數(shù)對(duì)脂質(zhì)體的包封率具有顯著性影響。由圖4可知，隨著凍融次數(shù)的增加，脂質(zhì)體的包封率有所提高，達(dá)到最大值64.80%；而達(dá)到最大包埋程度后，隨著次數(shù)的增加，包封率有下降的趨勢(shì)。其原因可能是過多的凍融次數(shù)會(huì)造成脂質(zhì)體在冷凍形成冰晶的過程中，部分脂質(zhì)體發(fā)生分子間的碰撞，導(dǎo)致部分脂質(zhì)體球發(fā)生破裂；再有可能發(fā)生在重新緩慢融化的脂質(zhì)體，膜間相互融合的過程中，使得脂質(zhì)體的尺寸變大，包埋的GOD酶量雖然變多，但是脂質(zhì)體生物外膜會(huì)相對(duì)變薄，導(dǎo)致脂質(zhì)體更容易破裂，使得包封率降低［13］。綜合考慮，選擇凍融循環(huán)10、15、20 次作為3 個(gè)最適水平。

表4 方差分析Table 4 Analysis of variance項(xiàng)目 平方和 自由度 均方 F值 顯著性組間 3 551.429 4 887.857 224.774 *組內(nèi) 39.500 10 3.950總數(shù) 3 590.929 14

2.5 GOD脂質(zhì)體制備工藝的正交試驗(yàn)優(yōu)化

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，以包封率作為考察指標(biāo)，設(shè)定壁材質(zhì)量比（A）、芯材質(zhì)量（B）、凍融次數(shù)（C）和水化時(shí)間（D）四因素三水平進(jìn)行正交試驗(yàn)，利用正交表L9（34）進(jìn)行設(shè)計(jì)優(yōu)化分析，選擇包封率最高的配方作為制備脂質(zhì)體的最佳工藝。

表 5 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果Table 5 Orthogonal array designL9（34）withexperimentalresults試驗(yàn)號(hào) A壁材質(zhì)量比 B芯材質(zhì)量/mg C凍融次數(shù) D水化時(shí)間/min 包封率% 1 1（3∶1） 1（3） 1（10） 1（15） 63.4 2 1 2（5） 2（15） 2（20） 60.8 3 1 3（10） 3（20） 3（25） 62.8 4 2（4∶1） 1 2 3 72.4 5 2 2 3 1 79.4 6 2 3 1 2 78.6 7 3（5∶1） 1 3 2 56.8 8 3 2 1 3 81.4 9 3 3 2 1 86.3 K1187.0 192.6 223.4 229.1 K2234.4 221.6 219.5 196.2 K3224.5 227.7 199.0 216.6 k162.333 64.200 74.467 76.367 k276.800 73.867 73.167 65.400 k374.833 75.900 66.333 72.200極差R 14.467 11.700 8.134 10.967因素主次 A＞B＞D＞C最優(yōu)組合 A2B3C1D1

由表5可知，4 個(gè)因素影響包封率的次序分別為：A＞B＞D＞C，即壁材質(zhì)量比＞芯材質(zhì)量＞水化時(shí)間＞凍融次數(shù)。利用正交設(shè)計(jì)優(yōu)化獲得的最佳制備處方工藝優(yōu)化為：A2B3C1D1，即大豆卵磷脂與膽固醇質(zhì)量比4∶1、葡萄糖氧化酶質(zhì)量10 mg、凍融次數(shù)10 次、水化時(shí)間15 min。根據(jù)最佳制備工藝條件再進(jìn)行酶脂質(zhì)體的制備，并重復(fù)5 次，測(cè)定最佳工藝下的平均包封率為（87.7±2.1）%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.24%。與此前的方法相比，采用此法所制備的脂質(zhì)體較大程度提高了包封率［15-17，23］。即1 mg的凍干葡萄糖氧化酶脂質(zhì)體中平均包埋0.326 mg的葡萄糖氧化酶。

2.6 GOD脂質(zhì)體的表征

利用優(yōu)化后的工藝體系制備GOD脂質(zhì)體，平均包封率為（87.7±2.1）%，采用光學(xué)顯微鏡和激光粒度分布儀對(duì)GOD脂質(zhì)體粉末的表觀形貌和粒徑分布進(jìn)行表征。由圖5A可知，GOD脂質(zhì)體的基本呈現(xiàn)規(guī)則的圓球形，沒有明顯的聚集現(xiàn)象，且表面沒有缺陷。由圖5B可知，GOD脂質(zhì)體的粒徑分布較為均勻，主要集中（約50%的脂質(zhì)體微粒）在100～250 μm的范圍內(nèi)，有效平均粒徑約為（164.75±2.55） μm，多分散系數(shù)（polydispersity，PDI）為0.258，數(shù)值較小，分散性較好，體系較為均勻。

脂質(zhì)體作為新型藥物載體，具有類似于生物膜的磷脂雙分子層，可將脂溶性或水溶性藥物包覆于脂膜內(nèi)部，隔絕外界不良環(huán)境對(duì)藥物的影響，進(jìn)而提高所包覆藥物的穩(wěn)定性。本實(shí)驗(yàn)中，考察脂質(zhì)體內(nèi)GOD與游離的GOD在相同時(shí)間間隔內(nèi)的酶活性變化，可以有效評(píng)估脂質(zhì)體中GOD的穩(wěn)定性。由圖6可知，在4 ℃和室溫避光貯藏條件下，脂質(zhì)體中的GOD與游離GOD的相對(duì)酶活力都隨時(shí)間的延長(zhǎng)而下降。由圖6A可知，在相同的時(shí)間間隔內(nèi)脂質(zhì)體中的GOD相對(duì)酶活力比游離的GOD的高。相對(duì)酶活力的檢測(cè)初始值皆為96%，游離的GOD相對(duì)酶活力呈下降的趨勢(shì)，說明酶活性開始逐漸喪失，到達(dá)35 d時(shí)相對(duì)酶活力基本達(dá)到平衡，維持在30%。脂質(zhì)體中GOD在60 d的間隔時(shí)間內(nèi)依然維持較高的相對(duì)酶活力，達(dá)到了93%。由圖6B可知，在室溫條件下，游離的GOD在貯存40 d后，相對(duì)酶活力就已下降至25%；與此同時(shí)，脂質(zhì)體中的GOD相對(duì)酶活力仍然維持在83%。結(jié)果表明，GOD脂質(zhì)體分別在4 ℃和室溫條件下貯存60 d和40 d后，包封率基本不變，說明脂質(zhì)體沒有破裂溶出。所包覆的GOD在脂膜的保護(hù)下，能夠有效隔絕外界環(huán)境對(duì)酶活性的影響，進(jìn)而提高了酶的貯存穩(wěn)定性。

3 結(jié) 論

目前，葡萄糖氧化酶被廣泛應(yīng)用食品工業(yè)中，但是其提純過程繁瑣，加工成本偏高，且游離態(tài)的GOD穩(wěn)定性差，因此探索適合的固定化技術(shù)對(duì)葡萄糖氧化酶的應(yīng)用具有重要意義。本實(shí)驗(yàn)采用薄膜蒸發(fā)-凍融聯(lián)用法成功制備出了GOD脂質(zhì)體，并考察了脂質(zhì)體的理化性質(zhì)和穩(wěn)定性。結(jié)果表明，GOD脂質(zhì)體的最佳制備工藝為壁材質(zhì)量比4∶1、芯材質(zhì)量5 mg（500 U）、水化時(shí)間15 min、凍融循環(huán)10 次。利用此工藝所制備的脂質(zhì)體的平均包封率可達(dá)到（87.7±2.1）%；在不同溫度條件下，脂質(zhì)體中的GOD的酶活力穩(wěn)定性得到提高。

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DOI:10.7506/spkx1002-6630-201613021

中圖分類號(hào)：Q84

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1002-6630（2016）13-0120-05

收稿日期：2015-09-15

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項(xiàng)目（31201376）；中國(guó)博士后科學(xué)基金資助項(xiàng)目（2014T70304；2013M531009）；黑龍江省博士后基金資助項(xiàng)目（LBH-Z13002）；黑龍江省科學(xué)基金項(xiàng)目（C2016034）

作者簡(jiǎn)介：關(guān)樺楠（1983—），男，副教授，博士，研究方向?yàn)槭称焚|(zhì)量與安全。E-mail：guanhuanan3@163.com

Preparation and Characterization of Glucose Oxidase Liposomes

GUAN Huanan1，2， HAN Bolin1， NAO Amin1， WANG Xin1， XU Liping1， SUN Lu2
（1.College of Food Engineering， Harbin University of Commerce， Harbin 150076， China；2.Alkali Soil Natural Environmental Science Center， Northeast Forestry University， Harbin 150040， China）

Abstract:Egg phosphatidylcholine and cholesterol were used as coating materials to prepare glucose oxidase （GOD）liposomes by a thin film evaporation-freezing thawing method.Single factor experiments and orthogonal array design methods were used to optimize the preparation conditions based on encapsulation efficiency.The shape， stability and particle size distribution of liposome-encapsulated glucose oxidase were systematically investigated.The optimal process parameters were obtained as follows: mass ratio between egg phosphatidylcholine and cholesterol of 4:1， 5 mg （500 U） of GOD， hydration time of 15 min， and 10 freezing-thawing cycles.The encapsulation efficiency of GOD liposomes was up to （87.7 ± 2.1）%， with an average diameter of approximately （164.75 ± 2.55） μm under the optimized conditions.The encapsulation efficiency did not significant change at 4 ℃ and room temperature （23.0 ± 0.5） ℃， and the activity of GOD remained stable.

Key words:glucose oxidase； liposome； stability； film evaporation-freezing thawing method； characterization