王 瓊，唐俊妮*，湯 承，陳 娟，劉 驥，蔡自建（西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，四川 成都 610041）

?

金黃色葡萄球菌新型腸毒素sek基因在3 株食品分離菌株中的表達(dá)

王 瓊，唐俊妮*，湯 承，陳 娟，劉 驥，蔡自建
（西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，四川 成都 610041）

摘 要：目的：腸毒素sek基因在臨床分離的耐甲氧西林金黃色葡萄球菌菌株中較為流行，研究新型腸毒素sek基因的時序性表達(dá)可為食物中毒預(yù)防和疾病控制補(bǔ)充新的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。方法：本研究針對實驗室保存的食源性金黃色葡萄球菌菌株進(jìn)行21 種腸毒素基因檢測，篩選出3 株含sek基因的菌株SA005、SA008和SAB0，針對3 株菌株進(jìn)行生長曲線測定，隨后在培養(yǎng)不同時間段收集菌體提取RNA，利用實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（real time-polymerase chain reaction，real time-PCR）檢測腸毒素sek基因在12～120 h的相對表達(dá)水平。結(jié)果：基因檢測結(jié)果顯示，菌株SA005含有16S、nuc、mecA、seb、sec、sek、sex基因，SA008含有16S、nuc、mecA、sea、sek、sex基因，SAB0含有16S、nuc、sek、sex基因。3 株菌株在胰酪胨大豆肉湯培養(yǎng)基中的生長曲線趨勢較相似，18 h左右出現(xiàn)折點，之后細(xì)菌進(jìn)入生長穩(wěn)定期。3 株菌株的sek基因在12～120 h全程表達(dá)，SA005的sek基因在48 h時相對表達(dá)量最高，在84 h相對表達(dá)量最低；SA008在24 h時的相對表達(dá)量最高，在48 h相對表達(dá)量最低，在60～120 h表達(dá)量相對比較穩(wěn)定；SAB0在12～120 h之間相對表達(dá)量呈現(xiàn)拋物線趨勢，在60 h和72 h的表達(dá)量相對較高且差異不顯著（P＞0.05）。結(jié)論：3 株菌株sek表達(dá)水平存在明顯差異，相同菌株sek基因不同時間點表達(dá)也存在差異性，菌株基因背景的影響可能是造成sek基因表達(dá)差異性的關(guān)鍵。

關(guān)鍵詞：金黃色葡萄球菌；新型腸毒素；sek基因；實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)；時序性表達(dá)

引文格式：

王瓊， 唐俊妮， 湯承， 等.金黃色葡萄球菌新型腸毒素sek基因在3 株食品分離菌株中的表達(dá)［J］.食品科學(xué)， 2016， 37（13）: 140-146.DOI:10.7506/spkx1002-6630-201613025. http://www.spkx.net.cn

WANG Qiong， TANG Junni， TANG Cheng， et al.Temporal expression of staphylococcal enterotoxin k （sek） gene in three isolates from food samples［J］.Food Science， 2016， 37（13）: 140-146.（in Chinese with English abstract） DOI:10.7506/ spkx1002-6630-201613025. http://www.spkx.net.cn

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）是一種常見的食源性病原菌，能產(chǎn)生多種致病因子，如溶血素、殺白細(xì)胞素、血漿凝固酶、耐熱核酸酶以及腸毒素（staphylococcal enterotoxins，SEs）等。其中腸毒素蛋白對熱、低pH值、蛋白酶均具有一定的抵抗力。當(dāng)攝取了污染金黃色葡萄球菌的食物后，其產(chǎn)生的腸毒素仍可以在消化道內(nèi)保持一定的活性，從而引起食物中毒。中毒發(fā)生比較迅速（進(jìn)食后約2～8 h），其癥狀包括惡心、劇烈嘔吐，有時會伴隨腹瀉［1］。迄今人們已發(fā)現(xiàn)多種腸毒素血清型，通常分為經(jīng)典腸毒素（classic enterotoxins，SEA-SEE）和新型腸毒素（newly identified enterotoxins，SEG-SEX）［2-3］。

SEK是Orwin等［4］于2001年發(fā)現(xiàn)的一種新型腸毒素，由移動基因元件前噬菌體［5］和葡萄球菌基因島［6］編碼。分子質(zhì)量約為26 kD，等電點pI值在7.0～7.5之間，重組的葡萄球菌腸毒素K（staphylococcal enterotoxin K，SEK）蛋白能夠刺激CD4+和CD8+T細(xì)胞的Vβ-5.1、5.2以及6.7區(qū)域位點大量增殖［4］，并引起靈長目動物的嘔吐反應(yīng)［7］。流行病學(xué)研究還發(fā)現(xiàn)，sek基因在臨床分離菌株中較為流行，如衛(wèi)沛楠等［8］檢測了144 株食源性金黃色葡萄球菌，sek基因的檢出率為20.14%，認(rèn)為食源性菌株中seu、seg、sem和sek檢出率較高。岳麗琴等［9］采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）方法對分離自肺炎患兒的60 株金黃色葡萄球菌進(jìn)行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)sek的檢出率為最高，達(dá)到50%，他們認(rèn)為分離自肺炎患兒的金黃色葡萄球菌sek基因有較高的流行性。最新的研究發(fā)現(xiàn)，sek基因與社區(qū)獲得性耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（community-acquired methicillin-resistant S.aureus，CAMRSA）USA300、USA400密切相關(guān)［10］。Wu Dejing等［11］對99 株CA-MRSA的基因背景進(jìn)行調(diào)查分析發(fā)現(xiàn)，約88.9%的CA-MRSA中存在腸毒素基因，其中以sek基因所占比例最多，大約為62.6%，其次是seq基因（61.6%）和seb基因（60.6%）。Varshney等［12］從血液和傷口分離的金黃色葡萄球菌中發(fā)現(xiàn)，sek基因在耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（methicillin-resistant S.aureus，MRSA）中的攜帶率明顯高于甲氧西林敏感的金黃色葡萄球菌（methicillinsensitive S.aureus，MSSA）。Aguilar等［10］測序20 株臨床分離菌株的金黃色葡萄球菌腸毒素K（staphylococcal enterotoxin-like K gene，selk）基因，并與14 條已經(jīng)發(fā)表的selk基因進(jìn)行序列比對分析，發(fā)現(xiàn)sek基因至少存在6 種變體，其中一種變體在所測USA300菌株中都為保守，推測攜帶腸毒素sek基因的金黃色葡萄球菌引起的食物中毒可能比其他腸毒素更加難以治療，因此，對于腸毒素sek的研究也顯得尤為重要。

由于金黃色葡萄球菌食品源分離菌株的特異性和毒素基因存在形式的多樣性，針對不同分離菌株腸毒素基因的表達(dá)及相互影響還需要開展更多的研究。因此，本研究針對實驗室保存的食源性金黃色葡萄球菌分離菌株進(jìn)行腸毒素基因及相關(guān)基因的背景檢測，選出3 株含有sek基因的菌株作為研究對象。采用實時熒光定量PCR （real time-PCR）技術(shù)，以ftsz為內(nèi)標(biāo)基因［13-14］，探索在細(xì)菌生長不同時間段sek基因在mRNA水平上的相對表達(dá)情況以及不同菌株的表達(dá)差異，為將來進(jìn)一步尋求降低或抑制腸毒素表達(dá)的抑制劑奠定基礎(chǔ)，從而降低金黃色葡萄球菌腸毒素引起的食物中毒。

1 材料與方法

1.1 菌株、培養(yǎng)基與試劑

西南民族大學(xué)微生物實驗室－70 ℃凍存的食品源金黃色葡萄球菌分離菌株SA005、SA008和SAB0。

胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基（trypticase soy broth，TSB）、胰酪胨大豆瓊脂培養(yǎng)基（tryptose soya agar，TSA）、Baird-Parker（BP）瓊脂基礎(chǔ) 青島海博生物技術(shù)有限公司。

1×（三羥甲基氨基甲烷-乙二胺四乙酸（tris（hydroxymethyl） aminomethane-ethylene diamine tetraacetic acid tris，TE）緩沖液（10 mmol/L Tris-HCl，1 mmol/L pH 8.0乙二胺四乙酸）；PCR擴(kuò)增試劑、DL2000 Marker 日本TaKaRa公司；細(xì)菌總RNA提取試劑盒、溶菌酶 天根生化科技（北京）有限公司；RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit 美國Thermo Scientific公司；SsoAdvancedTMSYBR?Green Supermix美國Bio-Rad公司；焦碳酸二乙酯 美國Amresco公司。

1.2 儀器與設(shè)備

HZQ-F160全溫振蕩培養(yǎng)箱 上海齊欣科學(xué)儀器有限公司；Eppendorf 5804R型冷凍離心機(jī)、PHS-4C+酸度計 成都世紀(jì)方舟科技有限公司；Galanz WD800B型微波爐、DYY-6C型電泳儀 北京六一儀器廠；TSNENEN031445 PCR儀、BioSpec-nano230V核酸測定儀、CFX96熒光定量PCR儀 美國Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)菌DNA提取

取凍存的3 株金黃色葡萄球菌菌液50 μL接種于5 mL TSB營養(yǎng)肉湯中，置于37 ℃搖床過夜復(fù)蘇，于金黃色葡萄球菌選擇性BP平板上純化，挑取單菌落轉(zhuǎn)接于LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)12～16 h，取1 mL培養(yǎng)后的菌液，4 ℃、12 000 r/min離心2 min，收集菌體。參照微波加熱方法提取分離細(xì)菌基因組DNA［15］。

1.3.2 常規(guī)PCR基因引物

金黃色葡萄球菌1 6 S r D N A以及耐熱核酸酶基因n u c基因引物序列及P C R擴(kuò)增條件參考文獻(xiàn)［16］；耐甲氧西林mecA基因的引物序列及PCR擴(kuò)增條件參考文獻(xiàn)［17］。具體引物序列如下：16S-F-5′-GTGCACATCTTGACGGTACC-3′，16S-R-5′-CGAAGGGGAAGGCTCTATC-3′；nuc-F-5′-ATCATTATTGTAGGTGTATTAGC-3′，nuc-R-5′-CAGGCGTATTCGGTTTC-3′；mecA-F-5′-TGGCTCAGGTACTGCTATCC-3′，mecA-R-5′-CACCTTGTCCGTAACCTGAA-3′。

21 種不同腸毒素基因以及毒性休克綜合征毒素（toxic shock syndrom toxin，TSST）基因的常規(guī)PCR擴(kuò)增引物序列見表1，其中由本實驗設(shè)計的所有引物均參照GenBank（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/）上報道的不同腸毒素基因序列，采用Primer 6.0軟件自行設(shè)計，所有引物采用BLAST進(jìn)行特異性比對。引物序列由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

表 1 用于常規(guī)PCR的引物序列Table 1 Primer sequences for conventional PCR基因 引物序列（5′→3′） 理論長度/bp退火溫度/℃參考文獻(xiàn)SEA-F ATTAACCGAAGGTTCTGTAGA 582 55 SEA-R TTGCGTAAAAAGTCTGAATT SEB-F CCTAAACCAGATGAGTTGCAC 592 55 ［18］SEB-R CAGGCATCATGTCATACCAAA SEC-F AGATGAAGTAGTTGATGTGTATGG 454 55 ［18］SEC-R CTTCACACTTTTAGAATCAACCG SED-F GCTTGTACATATGGAGGTGTCA 263 60 ［18］SED-R GACCCATCAGAAGAATCAAACT

續(xù)表1

1.3.3 腸毒素基因PCR檢測

采用常規(guī)PCR對3 株金黃色葡萄球菌存在的毒素基因型進(jìn)行調(diào)查。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為：10×PCR Buffer （Mg2+free）2 μL，25 mmol/L MgCl21.6 μL，dNTP Mixture（2.5 mmol/L each）1.2 μL，Taq DNA聚合酶（5 U/μL）0.2 μL，20 μmol/L的上下游引物各0.5 μL，模板1 μL，滅菌超純水補(bǔ)足20 μL體系。PCR擴(kuò)增時，95 ℃預(yù)變性5 min；進(jìn)入PCR循環(huán)，95 ℃變性40 s，退火50 s（各腸毒素退火溫度詳見表1），72 ℃延伸40 s，35 個循環(huán)；72 ℃延伸7 min，4 ℃保存。

PCR產(chǎn)物瓊脂糖電泳檢測：配制1%瓊脂糖凝膠，取5 μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物上樣，80 V電泳45 min，凝膠成像系統(tǒng)觀察與貯存電泳圖片。各基因進(jìn)行PCR檢測時設(shè)有陽性對照和陰性對照，PCR擴(kuò)增獲得的陽性條帶送生工生物工程（上海）股份有限公司測序并進(jìn)行比對驗證，以確保序列的正確性。

1.3.4 3 株細(xì)菌的生長曲線測定

基于文獻(xiàn)報道多數(shù)腸毒素合成于細(xì)菌生長的對數(shù)期或是向穩(wěn)定期轉(zhuǎn)化的過程［13，21-23］，本實驗為了研究金黃色葡萄球菌SA005、SA008以及SAB0菌株在TSB中的時序性表達(dá)規(guī)律，進(jìn)行了120 h的生長監(jiān)測和取樣。首先取50 μL保存于甘油中的3 株目標(biāo)菌株的菌液，解凍后分別接種到5 mL的TSB 培養(yǎng)基中，37 ℃、150 r/min培養(yǎng)12 h，取增菌后的菌液500 μL，于4.5 mL滅菌生理鹽水中進(jìn)行10 倍梯度稀釋，取合適稀釋度的菌液進(jìn)行平板計數(shù)，每個梯度做3 次平行。根據(jù)平板計數(shù)結(jié)果，在裝有500 mL的TSB培養(yǎng)基的三角瓶中接入金黃色葡萄球菌，為了模擬實際污染情況，初始接菌量約為100～101CFU，混勻，37 ℃培養(yǎng)。在開始培養(yǎng)的0～12 h中每隔1 h取一次樣，12～24 h每隔2 h取樣一次，24～48 h每隔4 h取樣一次，48～120 h每隔12 h取樣一次，進(jìn)行菌落計數(shù)，每個測定時間點均做3 次平行。

1.3.5 RNA提取

收集SA005、SA008以及SAB0生長的12、24、36、48、60、72、84、96、108 h及120 h共10 個取樣點的培養(yǎng)菌液，4 ℃、12 000 r/min離心2 min，棄上清，收集菌體，－70 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。RNA提取時，取500 μL 1×TE重懸菌體，加入溶菌酶在37 ℃條件下過夜，然后根據(jù)細(xì)菌總RNA提取及純化試劑盒操作方法提取總RNA，所有試劑和耗材均用焦碳酸二乙酯處理，提取的RNA采用DNase I處理以去除殘留的DNA。

1.3.6 反轉(zhuǎn)錄以及熒光定量PCR

用于熒光定量PCR擴(kuò)增的sek引物序列見表2。腸毒素sek引物參照GenBank（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ genbank/）上報道的基因序列，采用Primer 6.0軟件進(jìn)行設(shè)計，引物采用BLAST進(jìn)行特異性比對，內(nèi)參基因ftsz參考文獻(xiàn)［13-14］。所有引物的合成由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。

表 2 用于熒光定量PCR的引物序列Table 2 Primer sequencesforreal-timePCR analysis基因 引物序列（5′→3′） 理論擴(kuò)增長度/bp 參考文獻(xiàn)sek-F TATATGGCGGAGTCACAGCTA 188 sek-R TTTTTAGTGCCGTTATGTCC ftsz-F TGAAGATGCAATCCAAGGTG 116 ［14］ftsz-R GTTAATGCGCCCATTTCTTT

以不同時間點提取的3 株目標(biāo)菌株總RNA為模板，應(yīng)用RevertAid First Strand cDNA合成試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。具體操作按照試劑盒說明書，反應(yīng)體系20 μL，反應(yīng)條件為42 ℃，60 min；70 ℃，5 min。得到的cDNA產(chǎn)物采用BioSpec-nano230V核酸測定儀測定核酸濃度。

熒光定量PCR反應(yīng)采用SYBR熒光定量試劑盒在CFX96 PCR儀上進(jìn)行，每個樣品各做3 次平行。熒光定量PCR的反應(yīng)體系為10 μL，包括SYBR Green Supermix 5 μL，腸毒素sek與ftsz基因正、反向引物（10 μmol/L）各0.5 μL，cDNA模板1 μL，RNase free water 3 μL。

熒光定量PCR退火溫度的探索：將上述反應(yīng)體系按照95 ℃，2 min；95 ℃，30 s、55～65 ℃（共設(shè)置8 個溫度梯度），30 s，39 個循環(huán)進(jìn)行熒光定量PCR。反應(yīng)結(jié)束后，選擇熔解曲線尖銳且Ct值較小的體系所對應(yīng)的溫度為該腸毒素的最佳退火溫度T*。然后取該T*對應(yīng)的擴(kuò)增產(chǎn)物作為模板，采用BioSpec-nano230V核酸測定儀測定核酸濃度，10 倍稀釋成8 個梯度，反應(yīng)條件為95 ℃，2 min；之后進(jìn)入循環(huán)，首先95 ℃解鏈10 s，然后退火溫度T*條件下退火30 s，一共進(jìn)行39 個循環(huán)；分別獲得腸毒素基因sek和內(nèi)參基因ftsz的熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線。針對3 株目標(biāo)菌株各取樣點反轉(zhuǎn)錄cDNA的擴(kuò)增同樣按照上述條件進(jìn)行，從而得到不同取樣點對應(yīng)的Ct值。

1.3.7 腸毒素基因sek的相對定量分析

sek基因在不同時間點的相對定量分析采用改良的2－Δ ΔCt法［21］，以腸毒素sek為目標(biāo)基因和ftsz為內(nèi)參基因，得到公式：

式中：R為目標(biāo)基因在樣本中的表達(dá)相對于對照組的相對表達(dá)量；Esek、Eftsz分別為熒光定量PCR擴(kuò)增效率的E+1。E值根據(jù)E=10－1/slope－1計算，slope為標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率；ΔCtsek為校準(zhǔn)樣本中目的基因Ct值與測試樣本中目的基因的Ct值的差值；ΔCtftsz為校準(zhǔn)樣本中內(nèi)標(biāo)基因Ct值與測試樣本中內(nèi)標(biāo)基因的Ct值的差值。

計算不同時間點sek基因的相對表達(dá)量時，先對3 株菌株的內(nèi)參基因ftsz與目標(biāo)基因sek的表達(dá)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，以3 株目標(biāo)菌株在12 h時各基因的表達(dá)作為校準(zhǔn)樣本，24～120 h各時間點基因的表達(dá)作為測試樣本，利用上述公式計算出3 株菌株的sek基因在不同取樣時間點的相對表達(dá)量。

1.4 數(shù)據(jù)分析

生長過程中不同取樣點測定的平板計數(shù)所獲得的3 個平行數(shù)據(jù)，均采用Excel軟件處理。3 株目標(biāo)菌株腸毒素基因sek和內(nèi)參基因ftsz在不同時間點的Ct值，應(yīng)用Excel軟件進(jìn)行初步整理后使用SPSS 18.0數(shù)據(jù)分析軟件處理，計量以±s表示，采用單因素方差分析（analysis of variance，ANOVA）分析組間差異性，組內(nèi)計量資料比較采用Duncan's方法，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計意義的標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 金黃色葡萄球菌SA005、SA008和SAB0相關(guān)基因背景的檢測結(jié)果

對3 株金黃色葡萄球菌SA005、SA008和SAB0進(jìn)行16S、nuc、mecA、tsst-1基因以及21 種腸毒素基因的檢測結(jié)果，如表3所示。SA005、SA008和SAB0均檢測出16S、nuc、sek和sex 4 個共同的基因。其中，SA005攜帶腸毒素基因類型是seb、sec、sek和sex；SA008除攜帶sek基因外還攜帶傳統(tǒng)腸毒素sea和新型腸毒素sex，而SAB0只攜帶sek和sex兩種新型腸毒素基因。另外SA005和SA008菌株均檢測出耐甲氧西林的mecA基因。

表 3 SA005、SA008和SAB0菌株的相關(guān)基因檢測結(jié)果Table 3 Relatedgenotypes ofS.aureusisolatesSA005， SA008and SAB0菌株名稱 基因類型SA005 16S、nuc、mecA、seb、sec、sek、sex SA008 16S、nuc、mecA、sea、sek、sex SAB0 16S、nuc、sek、sex

2.2 金黃色葡萄球菌SA005、SA008和SAB0在TSB中的生長曲線

對SA005、SA008和SAB0 3株細(xì)菌在TSB中的生長過程進(jìn)行動態(tài)取樣計數(shù)，以菌落總數(shù)的對數(shù)值為縱坐標(biāo)，時間為橫坐標(biāo)繪制3 株菌株在TSB中的生長曲線。由圖1可知，3 株菌株的變化趨勢較相似。基本是在18 h左右出現(xiàn)折點，之后細(xì)菌進(jìn)入生長的穩(wěn)定期。

2.3 內(nèi)參基因ftsz和腸毒素基因sek熒光定量PCR的標(biāo)準(zhǔn)曲線

根據(jù)ftsz和sek基因熒光定量PCR溫度優(yōu)化結(jié)果，選擇熔解曲線尖銳只產(chǎn)生特異性單峰且Ct值較小的體系所對應(yīng)的溫度為最佳退火溫度T*，ftsz和sek基因熒光擴(kuò)增的T*分別為61.4 ℃和63.3 ℃。將模板10 倍稀釋成8 個梯度，進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增，系統(tǒng)自動生成標(biāo)準(zhǔn)曲線，以核酸濃度的對數(shù)值為x軸，對應(yīng)的Ct值為y軸，得到ftsz基因標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=－3.399x+6.854，擴(kuò)增效率為E=96.9%，回歸相關(guān)系數(shù)r2=0.999；sek基因標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=－3.679x+5.005，擴(kuò)增效率為E=87%，回歸相關(guān)系數(shù)r2=0.998。

2.4 腸毒素sek基因在mRNA水平的動態(tài)變化監(jiān)測

在金黃色葡萄球菌SA005、SA008和SAB0菌株的生長過程中，收集12、24、36、48、60、72、84、96、108、120 h共10 個時間點的菌體，分別提取各取樣點細(xì)菌的總RNA，采用反轉(zhuǎn)錄-熒光定量PCR獲得不同時間點不同菌株的sek基因和ftsz基因擴(kuò)增的Ct值，結(jié)果見表4。

表 4 金黃色葡萄球菌SA005、SA008和SAB0不同取樣點sek基因與ftsz基因Ct值Table4 Ct values ofsekgene andftszgene atdifferent samplingtimepoints for SA005， SA008 and SAB0時間/h SA005 SA008 SAB0 sek ftsz sek ftsz sek ftsz 12 13.8±0.25 12.13±0.15 19.82±0.06 16.83±0.15 36.24±0.14 16.24±0.07 24 17.44±0.01 15.74±0.05 22.34±0.13 20.77±0.03 26.23±0.31 19.43±0.02 36 14.54±0.01 14.2±0.14 25.78±0.27 22.31±0.14 20.86±0.59 15.15±0.13 48 16.18±0.01 15.92±0.1 29.83±0.11 25.1±0.03 20.44±0.6 15.12±0.12 60 14.37±0.04 12.85±0.17 20.08±0.03 18.37±0.03 19.45±0.07 15.45±0.09 72 14.05±0.03 13.27±0.06 19.28±0.01 17.66±0.02 19.74±0.05 15.77±0.05 84 17.66±0.08 14.06±0.06 16.82±0.3 14.89±0.14 22.43±0.06 17.11±0.07 96 13.47±0.12 12.36±0.09 17.07±0.06 15.49±0.11 22.12±0.01 16.89±0.06 108 14.93±0.3 12.94±0.24 16.72±0.06 15.26±0.06 27.12±0.24 20.01±0.05 120 15.08±0.06 13.92±0.03 19.06±0.01 17.25±0.12 28.97±0.63 15.73±0.05

根據(jù)表4中列舉的Ct值，選擇合適內(nèi)參基因Ct值作為基準(zhǔn)，對目標(biāo)基因表達(dá)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，采用改良的2－ΔΔCt法，分析目標(biāo)基因各時間點相對于內(nèi)參基因的相對表達(dá)水平。得到金黃色葡萄球菌SA005、SA008和SAB0菌株sek基因在不同取樣時間點的相對表達(dá)量（圖2）。通過單因素ANOVA分析可知，sek基因在不同菌株中表達(dá)差異極顯著（P＜0.01）；采用Duncan's分析同一菌株不同時間點mRNA的相對表達(dá)水平時，發(fā)現(xiàn)金黃色葡萄球菌SA005在48 h時相對表達(dá)量顯著高于其他時間點的相對表達(dá)量（P＜0.05），在84 h相對表達(dá)量最低；金黃色葡萄球菌SA008在24 h時的相對表達(dá)量顯著高于其他時間點的相對表達(dá)量（P＜0.05），在48 h相對表達(dá)量最低，而在60～120 h的表達(dá)量相對比較穩(wěn)定；而SAB0在12～120 h之間相對表達(dá)量呈現(xiàn)拋物線趨勢，兩頭低，而在60 h和72 h的表達(dá)量相對較高，且差異不顯著（P＞0.05），但與其他時間點的表達(dá)量差異顯著（P＜0.05）。不同菌株之間比較時，SA005的sek基因相對表達(dá)量比其他兩株菌的表達(dá)量相對要高。

3 討 論

本研究對實驗室保存的食源性金黃色葡萄球菌分離菌株的腸毒素sek基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，篩選出3 株含有sek基因的菌株SA005、SA008和SAB0，并對3 株菌株的tsst-1基因、耐甲氧西林mecA基因以及21 種不同腸毒素基因進(jìn)行PCR檢測，獲得了SA005、SA008和SAB0 3株菌株的相關(guān)基因背景信息。從結(jié)果來看，篩選的3 株菌株基因背景具有一定的代表性，SA005含有傳統(tǒng)的腸毒素基因seb和sec，以及新型腸毒素基因sek和sex；SA008含有傳統(tǒng)的腸毒素基因sea，以及新型腸毒素基因sek和sex；SAB0只含有新型腸毒素基因sek和sex。另外SA005 和SA008菌株中同時檢測出mecA基因，這一點也吻合了前面提及的耐甲氧西林金黃色葡萄球菌中sek基因攜帶率比較高的觀點［10-12］。值得一提的是，3 株菌中同時都攜帶sek和sex基因。至于sek和sex基因是否存在關(guān)聯(lián)還需要在未來的研究工作中進(jìn)一步進(jìn)行證實。

在內(nèi)標(biāo)基因的選取上，本研究參照其他學(xué)者的研究結(jié)果選取ftsz基因作為內(nèi)參基因［13-14］，在表達(dá)的定量相對分析時，采用改良的2－ΔΔCt法對實驗結(jié)果進(jìn)行分析，分別利用熒光定量得到每種引物標(biāo)準(zhǔn)曲線以及對應(yīng)的擴(kuò)增效率值，該方法對比于傳統(tǒng)的2－ΔΔCt法，增加了對不同引物擴(kuò)增效率的校正，從而提高了分析結(jié)果的準(zhǔn)確性。

針對sek基因的相對表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)，在相同培養(yǎng)條件下，菌株自身的差異性會導(dǎo)致sek在mRNA水平表達(dá)差異性。菌株SA005和SA008除攜帶sek基因外，還攜帶有其他傳統(tǒng)的腸毒素基因（seb、sec或sea），這兩株菌株sek的表達(dá)量要高于不含任何傳統(tǒng)腸毒素基因的菌株SAB0。猜測傳統(tǒng)腸毒素基因?qū)π滦湍c毒素基因的表達(dá)可能起著促進(jìn)作用。本課題組研究結(jié)果與Aguilar等［10］結(jié)果有類似之處，他們發(fā)現(xiàn)同時攜帶seb和sek基因的菌株，SEK蛋白的表達(dá)水平顯著高于其他不含seb基因的菌株。本研究中，SA005同時攜帶腸毒素seb和sek基因，結(jié)果發(fā)現(xiàn)SA005菌株的sek基因相對表達(dá)量確實要高于SA008和 SAB0。此外，Aguilar等［10］還采用酶聯(lián)免疫方法對培養(yǎng)液上清以及生物流體中的SEK蛋白進(jìn)行特異性檢測，發(fā)現(xiàn)所有含有sek基因的受試菌株均檢測出不同程度的SEK分泌量，且分泌量最高的MRSA菌株同時也表達(dá)SEB蛋白。在本研究中，3 株菌株的sek基因在12～120 h也是全程轉(zhuǎn)錄表達(dá)，只是相對表達(dá)量存在明顯差異。

本研究存在的缺點是只針對3 株細(xì)菌生長后期（12～120 h）進(jìn)行取樣監(jiān)測，而前12 h細(xì)菌sek基因的表達(dá)情況沒有反映出來。當(dāng)初的設(shè)計是基于文獻(xiàn)報道多數(shù)腸毒素合成是在細(xì)菌生長的對數(shù)后期或穩(wěn)定期［2，13，22-24］，為了模擬食物污染較低菌量的情形，取樣時間相對延長至120 h。本課題組未來的研究工作將進(jìn)一步豐富實驗數(shù)據(jù)，并且重點關(guān)聯(lián)各不同腸毒素基因之間對表達(dá)的相互影響。

綜上，腸毒素sek基因在臨床分離的金黃色葡萄球菌菌株中較為流行，菌株基因背景的影響可能是造成sek基因表達(dá)差異性的關(guān)鍵。鑒于sek基因可能與耐甲氧西林金黃色葡萄球菌以及其他腸毒素基因關(guān)系密切，也許攜帶腸毒素sek基因的金黃色葡萄球菌引起的疾病可能比其他金黃色葡萄球菌更加難以治療。這就需要更加深入了解腸毒素sek基因以及其他新型腸毒素基因的表達(dá)規(guī)律，為將來進(jìn)一步尋求降低或抑制腸毒素表達(dá)的抑制劑奠定基礎(chǔ)，從而降低金黃色葡萄球菌腸毒素食物中毒。

參考文獻(xiàn)：

［1］ BALABAN N， RASOOLY A.Staphylococcal enterotoxins［J］.International Journal of Food Microbiology， 2000， 61（1）: 1-10.DOI:10.1016/s0168-1605（00）00377-9.

［2］ ARGUDIN M A， MENDOZA M C， RODICIO M R.Food poisoning and Staphylococcus aureus enterotoxins［J］.Toxins， 2010， 2（7）: 1751-1773.DOI:10.3390/toxins2071751.

［3］ WILSON G J， SEO K S， CARTWRIGHT R A， et al.A novel core genome-encoded superantigen contributes to lethality of communityassociated MRSA necrotizing pneumonia［J］.PLoS Pathogens， 2011，7（10）: e1002271.DOI:10.1371/journal.ppat.1002271.

［4］ ORWIN P M， LEUNG D Y， DONAHUE H L， et al.Biochemical and biological properties of staphylococcal enterotoxin K［J］.Infection and Immunity， 2001， 69（1）: 360-366.DOI:10.1128/IAI.69.1.360-366.2001.

［5］ SUMBY P， WALDOR M K.Transcription of the toxin genes present within the Staphylococcal phage phiSa3ms is intimately linked with the phage's life cycle［J］.Journal of Bacteriology， 2003， 185（23）: 6841-6851.DOI:10.1128/JB.185.23.6841-6851.2003.

［6］ NOVICK R.Mobile genetic elements and bacterial toxinoses: the superantigen-encoding pathogenicity islands of Staphylococcus aureus［J］.Plasmid， 2003， 49（2）: 93-105.DOI:10.1016/S0147-619X（02）00157-9.

［7］ OMOE K， HU D L， ONO H K， et al.Emetic potentials of newly identified staphylococcal enterotoxin-like toxins［J］.Infection and Immunity， 2013， 81（10）: 3627-3631.DOI:10.1128/IAI.00550-13.

［8］ 衛(wèi)沛楠， 呂國平， 徐保紅.食源性金黃色葡萄球菌9種腸毒素基因的多重PCR檢測［J］.現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學(xué)， 2013， 40（17）: 3269-3272.

［9］ 岳麗琴， 王俊怡， 徐小靜.金黃色葡萄球菌分離株致病基因研究［J］.臨床兒科雜志， 2013， 31（4）: 347-350.DOI:10.3969/ j.issn.1000-3606.2013.04.013.

［10］ AGUILAR J L， VARSHNEY A K， WANG X， et al.Detection and measurement of staphylococcal enterotoxin-like K （Sel-K） secretion by Staphylococcus aureus clinical isolates［J］.Journal of Clinical Microbiology， 2014， 52（7）: 2536-2543.DOI:10.1128/JCM.00387-14.

［11］ WU D J， LI X M， YANG Y H， et al.Superantigen gene profiles and presence of exfoliative toxin genes in community-acquired meticillinresistant Staphylococcus aureus isolated from Chinese children［J］.Journal of Medical Microbiology， 2011， 60（1）: 35-45.DOI:10.1099/ jmm.0.023465-0.

［12］ VARSHNEY A K， MEDIAVILLA J R， ROBIOU N， et al.Diverse enterotoxin gene profiles among clonal complexes of Staphylococcus aureus isolates from the Bronx， New York［J］.Applied and Environmental Microbiology， 2009， 75（21）: 6839-6849.DOI:10.1128/ AEM.00272-09.

［13］ DERZELLE S， DILASSER F， DUQUENNE M， et al.Differential temporal expression of the staphylococcal enterotoxins genes during cell growth［J］.Food Microbiology， 2009， 26（8）: 896-904.DOI:10.1016/j.fm.2009.06.007.

［14］ 楊靜， 楊軍， 黃繼超， 等.食源性金黃色葡萄球菌腸毒素基因的分布與時序性表達(dá)［J］.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2012， 45（19）: 4057-4066.DOI:10.3864/j.issn.0578-1752.2012.19.018.

［15］ 王瓊， 唐俊妮， 湯承， 等.一種采用微波爐加熱快速提取細(xì)菌DNA用于PCR擴(kuò)增的方法［J］.西南民族大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版）， 2015，41（2）: 150-155.DOI:10.11920/xnmdzk.2015.02.004.

［16］ TANG J N， SHI X M， SHI C L， et al.Characterization of a duplex PCR assay for the detection of enterotoxigenic strains of Staphylococcus aureus［J］.Journal of Rapid Methods and Automation in Microbiology，2006， 14（3）: 201-217.DOI:10.1111/j.1745-4581.2006.00047.x.

［17］ XU J， SHI C L， SONG M H， et al.Phenotypic and genotypic antimicrobial resistance traits of foodborne Staphylococcus aureus isolates from Shanghai［J］.Journal of Food Science， 2014， 79（4）: M635-M642.DOI:10.1111/1750-3841.12405.

［18］ WONGBOOT W， CHOMVARIN C， ENGCHANIL C， et al.Multiplex PCR for detection of superantigenic toxin genes in methicillin-sensitive and methicillin-resistant Staphylococcus aureus isolated from patients and carriers of a hospital in northeast Thailand［J］.The Southeast Asian Journal of Tropical Medicine and Public Health， 2013， 44（4）: 660-671.［19］ JARRAUD S， MOUGEL C， THIOULOUSE J， et al.Relationships between Staphylococcus aureus genetic background， virulence factors，agr groups （alleles）， and human disease［J］.Infection and Immunity，2002， 70（2）: 631-641.DOI:10.1128/IAI.70.2.631-641.2002.

［20］ SRINIVASAN V， SAWANT A A， GILLESPIE B E， et al.Prevalence of enterotoxin and toxic shock syndrome toxin genes in Staphylococcus aureus isolated from milk of cows with mastitis［J］.Foodborne Pathogens and Disease， 2006， 3（3）: 274-283.DOI:10.1089/ fpd.2006.3.274.

［21］ PFAFFL M W.A new mathematical model for relative quantification in real-time RT-PCR［J］.Nucleic Acids Research， 2001， 29（9）: e45.DOI:10.1093/nar/29.9.e45.

［22］ CZOP J K， BERGDOLL M S.Staphylococcal enterotoxin synthesis during the exponential， transitional， and stationary growth phases［J］.Infection and Immunity， 1974， 9（2）: 229-235.

［23］ TSENG C W， ZHANG S， STEWART G C.Accessory gene regulator control of staphyloccoccal enterotoxin d gene expression［J］.Journal of Bacteriology， 2004， 186（6）: 1793-1801.DOI:10.1128/JB.186.6.1793-1801.2004.

［24］ OTERO A， GARCíA M C， GARCíA M L， et al.Production of staphylococcal enterotoxins C1 and C2 and thermonuclease in ewe's milk［J］.Food Microbiology， 1987， 4（4）: 339-345.DOI:10.1016/ S0740-0020（87）80008-4.

教育部“新世紀(jì)優(yōu)秀人才支持計劃”項目（NCET-11-0847）

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201613025

中圖分類號：TS207.4

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1002-6630（2016）13-0140-07

收稿日期：2015-07-21

基金項目：國家自然科學(xué)基金面上項目（31371781）；四川省應(yīng)用基礎(chǔ)研究計劃項目（14JC0702）；

作者簡介：王瓊（1990—），女，碩士研究生，研究方向為畜產(chǎn)品加工與安全。E-mail：wangqiong528@163.com

*通信作者：唐俊妮（1971—），女，教授，博士，研究方向為食品安全與食品微生物。E-mail：junneytang@aliyun.com

Temporal Expression of Staphylococcal Enterotoxin K （sek） Gene in Three Isolates from Food Samples

WANG Qiong， TANG Junni*， TANG Cheng， CHEN Juan， LIU Ji， CAI Zijian
（College of Life Science and Technology， Southwest University for Nationalities， Chengdu 610041， China）

Abstract:Objective: The newly identified staphylococcal enterotoxin sek gene is found to be very popular in clinical methicillin-resistant S.aureus isolates.The study of sek gene temporal expression would provide some valuable information and new data for food poisoning prevention and disease control linked to this bacterium.Methods: Three strains （SA005，SA008 and SAB0） with sek gene from foodborne isolates in our lab were selected by PCR detection of 21 different SEs genes.The growth curves of three strains were monitored during the growth phase in TSB.Total RNAs from three strains were extracted at different growth periods， and a quantitative real time-PCR was developed to monitor the relative expression of sek gene.Results: The results of virulence gene detection showed that SA005 harbored 16S， nuc， mecA， seb， sec， sek and sex genes， SA008 harbored 16S， nuc， mecA， sea， sek and sex genes， and SAB0 harbored 16S， nuc， sek and sex genes.The characteristics of growth curves for three strains had similarity， which exhibited a turning point around 18 h， and then entered the stationary growth phase.mRNA expression levels were shown during all the growth phases （12-120 h）； however， there were very obvious differences among three strains and among different sampling points.The relative expression of sek gene was very high at 48 h and very low at 84 h for SA005.For SA008， it was very high at 24 h， very low at 48 h， and was stable between 60-120 h.The relative expression of sek gene in SAB0 presented a parabolic trend， with a high level at 60 h and 72 h （P > 0.05）.Conclusion: The relative expression of sek gene among three strains had a significant difference.Even in the same strain， the relative expression of sek gene was different at different time points.Strain-to-strain variations with different background genes may be the key points for different expression patterns of sek gene.

Key words:Staphylococcus aureus； newly identified enterotoxins； sek gene； real time-polymerase chain reaction （real time-PCR）； temporal expression