李 歡，李 婷，詹云超，杜翠紅*（集美大學食品與生物工程學院，水產(chǎn)品深加工技術(shù)國家地方聯(lián)合工程研究中心，福建 廈門 361021）

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白姑魚胰蛋白酶的分離純化及其性質(zhì)分析

李 歡，李 婷，詹云超，杜翠紅*
（集美大學食品與生物工程學院，水產(chǎn)品深加工技術(shù)國家地方聯(lián)合工程研究中心，福建 廈門 361021）

摘 要：本研究從白姑魚幽門垂組織中提取胰蛋白酶粗酶，然后經(jīng)硫酸銨分級沉淀、DEAE-Sepharose Fast Flow陰離子交換層析及Sephacryl S-200凝膠過濾層析等分離純化技術(shù)，得到一種陰離子型胰蛋白酶（命名為：Trypsin A），并對該陰離子型胰蛋白酶進行鑒定及性質(zhì)分析。結(jié)果表明：Trypsin A的分子質(zhì)量約為28 kD，其最適反應(yīng)溫度為50 ℃，能在低于65 ℃條件下保持穩(wěn)定；最適pH值為9.5，酸堿耐受范圍為pH 9.5～11.0；Western blotting分析表明，白姑魚陰離子型胰蛋白酶可以與抗鯽魚胰蛋白酶抗體反應(yīng)，符合胰蛋白酶活性區(qū)域的高度保守性；絲氨酸類蛋白酶抑制劑對白姑魚胰蛋白酶具有抑制作用。

關(guān)鍵詞：白姑魚；胰蛋白酶；分離純化；酶學性質(zhì)

引文格式：

李歡， 李婷， 詹云超， 等.白姑魚胰蛋白酶的分離純化及其性質(zhì)分析［J］.食品科學， 2016， 37（13）: 168-172.DOI:10.7506/ spkx1002-6630-201613030. http://www.spkx.net.cn

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白姑魚（Argyrosomus argentatus，英文名：white croaker）為鱸形目石首魚科白姑魚屬，生活在海洋中下層。在我國南海、東海及黃海南部都有分布，但產(chǎn)量并不高。其肉厚而細嫩，是海洋經(jīng)濟型食用魚，魚干用于出口日本等國。作為魚內(nèi)臟主要的內(nèi)源性水解酶，胰蛋白酶的研究在國內(nèi)外已有報道，如日本的Sappasith等［1-3］分別分離純化出竹夾魚（Pomatomus saltatrix）和金槍魚（Thunnus albacores和Thunnus tonggol）的胰蛋白酶，并研究了其酶學性質(zhì)；Liu［4］、Lu Baoju［5］和呂英濤［6］等也分別分離純化出了點帶石斑魚（Epinephelus coioides）、鱖魚（Siniperca chuatsi）和鳀魚（Engraulis japonicus）的胰蛋白酶，并作了研究。但是關(guān)于白姑魚的胰蛋白酶研究尚未見報道。

根據(jù)已有相關(guān)文獻報道，內(nèi)源性水解酶對于魚類的自溶過程起到關(guān)鍵作用［7-8］，其中胰蛋白酶的活性最高，對魚類自溶影響最大［6］。而魚類自溶現(xiàn)象的產(chǎn)生會大大影響其在貯存和加工過程中的品質(zhì)，從而影響口感并降低經(jīng)濟價值。基于以上原因，本研究以白姑魚內(nèi)臟為原料，通過硫酸銨分級沉淀、DEAE-Sepharose Fast Flow陰離子交換層析及Sephacryl S-200凝膠過濾層析等分離純化技術(shù)，純化得到一種陰離子型胰蛋白酶（命名為：Trypsin A），并對該酶的酶學性質(zhì)進行初步研究，以期為該酶的應(yīng)用、白姑魚的貯存和加工工藝的改善提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鮮活白姑魚 廈門集美菜市場。

干酪素 西隴化工股份有限公司；Tris-base和十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS） 美國Sigma公司；蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標準品 日本TaKaRa公司；陰離子交換層析樹脂（DEAE-Sepharose Fast Flow）和凝膠過濾層析樹脂（Sephacryl S-200 HR） 美國GE Healthcare公司。

1.2 儀器與設(shè)備

垂直電泳槽、BioLogic LP蛋白質(zhì)純化層析系統(tǒng)美國Bio-Rad公司；Lambda 35可見-紫外分光光度計美國Perkin Elmer公司；Starter 2100 pH 計 美國Ohaus公司；Avanti J-26S XP高速冷凍離心機 美國Beckman公司；RIOS 8超純水系統(tǒng)、10 000 MWCO離心濃縮裝置 美國Millipore公司；G:BOX凝膠成像裝置 英國Syngene公司；FP-6200熒光分光光度計 日本Jasco公司；PT-MR 2100組織搗碎機 瑞士Kinematica公司。

1.3 方法

1.3.1 胰蛋白酶粗酶的提取

對鮮活的白姑魚敲擊頭部致其死亡，放入－20 ℃冰箱充分冷卻，取其幽門垂組織用蒸餾水沖洗干凈，去脂肪及結(jié)締組織后切碎并稱質(zhì)量，按料液比為1∶1（即100 g組織加入100 mL溶液）加入緩沖液A（20 mmol/L Tris-HCl，pH 7.5），將懸浮液用組織搗碎機搗碎4～5 次（15 s/次）。在4 ℃、12 000 r/min離心20 min，棄掉沉淀，收集上清液，對上清進行硫酸銨分級沉淀，4 ℃、12 000 r/min離心10 min，收集硫酸銨飽和度在30%～70%之間的餾分，用少量緩沖液A溶解沉淀并對其進行透析，得到的溶液即為粗酶液。

1.3.2 胰蛋白酶的純化

將粗酶液上樣于預(yù)先用緩沖液A平衡的DEAESepharose Fast Flow陰離子交換層析柱（1 cm×10 cm），并用緩沖液A以1 mL/min 流速充分淋洗，然后用含有NaCl濃度范圍為0.05～0.5 mol/L的緩沖液A進行梯度洗脫，洗脫液總體積為200 mL，以每管3 mL進行收集，并分別測其A280 nm值和酶活力，繪制洗脫曲線，將活性峰合并，采用超濾離心管進行超濾濃縮，得到部分純化的胰蛋白酶。

用緩沖液A平衡凝膠過濾層析柱Sephacryl S-200 HR （1.5 cm×98 cm）后，將述上部分純化的胰蛋白酶上樣于該柱，然后以緩沖液A以流速1 mL/min進行洗脫，每管收集3 mL。并分別測其A280 nm值和酶活力，收集酶活峰即為純化的白姑魚陰離子型胰蛋白酶（命名為Trypsin A）。冷凍干燥，－20 ℃保存。

1.3.3 胰蛋白酶活性測定

本研究主要采用以酪蛋白為底物測定反應(yīng)液的A280 nm值，獲得胰蛋白酶的活性，用于胰蛋白酶的分離純化過程及pH值和溫度對其酶活力影響的研究［9-10］。酶活力定義：在特定條件（25 ℃，其他為最適條件）下，在1 min內(nèi)能轉(zhuǎn)化酪蛋白中1 μmol酪氨酸的酶量為1個酶活力單位。

1.3.4 白姑魚胰蛋白酶的性質(zhì)研究

1.3.4.1 白姑魚胰蛋白酶的分子質(zhì)量和純度的鑒定

通過十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDSPAGE）［11］和Western blotting分析鑒定所純化的白姑魚胰蛋白酶的分子質(zhì)量和純度。

1.3.4.2 白姑魚陰離子型胰蛋白酶的最適pH值和酸堿穩(wěn)定性研究

將經(jīng)冷凍干燥的酶用不同pH值緩沖液進行溶解：檸檬酸鈉緩沖液（pH 3.0～5.5）、磷酸鹽緩沖液（pH 6.0～7.0）、Tris-HCl緩沖液（pH 7.5～9.0）、NaHCO3-NaOH 緩沖液（pH 9.5～11.0），緩沖液濃度均為0.1 mol/L，以酪蛋白為底物測定酶的活力。酸堿穩(wěn)定性的測定：將酶液在室溫條件下放置于上述各pH值的緩沖液中30 min后，按照酶活力測定方法測定其酶活力，具體操作見參考文獻［4］方法。

1.3.4.3 白姑魚陰離子型胰蛋白酶的最適溫度和熱穩(wěn)定性研究

在上述酶活力測定方法不改變的條件下，溫度在30～60 ℃的范圍內(nèi)，10 ℃梯度增加變化，測定該酶的最適作用溫度。溫度穩(wěn)定性研究：將酶分別在 30、40、50、55、60、65、70 ℃條件下孵育30 min，測定其酶活力。

1.3.4.4 白姑魚胰蛋白酶底物特異性的測定

以熒光標記的不同小肽為底物測定胰蛋白酶酶解液的熒光值［5］，以檢測其底物特異性。以熒光底物Boc-Phe-Ser-Arg-MCA為對照，通過比較其他來源的胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、氨肽酶等熒光底物酶解液的熒光值大小，以確定白姑魚胰蛋白酶的底物特異性。

1.3.4.5 蛋白酶抑制劑對白姑魚陰離子型胰蛋白酶的影響

根據(jù)不同種類的絲氨酸蛋白酶抑制劑乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）、苯甲基磺酰氟（phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF）、1，10-鄰菲咯啉（1，10-phenanthroline）、胃蛋白酶抑制劑（pepstatin）、苯甲醚（benzamidine）、Pefabloc SC和大豆胰蛋白酶抑制劑（soybean trypsin inhibitor ，STI）有效終濃度和初濃度，計算各抑制劑需加入的量，然后分別加入至純化的胰蛋白酶溶液中，此混合物在室溫下（20～25 ℃）放置15 min后，用上述酶活力測定方法分別測定酶的酶活力，對照為不加抑制劑的酶液。

2 結(jié)果與分析

2.1 白姑魚胰蛋白酶的分離純化

對胰蛋白酶粗提液進行硫酸銨分級沉淀，收集硫酸銨飽和度在30%～70%之間的餾分，加入適當緩沖液溶解后，進行透析。然后進行DEAE-Sepharose Fast Flow陰離子層析。由圖1可知，經(jīng)過DEAE-Sepharose Fast Flow陰離子柱層析，出現(xiàn)對應(yīng)的淋洗峰和洗脫峰，即粗酶液被分成未吸附部分和吸附部分。其中，吸附部分即為陰離子型的胰蛋白酶（命名為Trypsin A）。

經(jīng)過DEAE-Sepharose Fast Flow柱層析，分別對洗脫峰（第53～60管）中的酶液進行SDS-PAGE檢測，由圖2可知，從53～60 管，蛋白條帶越來越少，純化效果越來越明顯。

由圖2可知，第53～58管的酶液中仍存在少量雜蛋白，將其混合后上樣于Sephacryl S-200 HR凝膠過濾層析柱。過此柱后分離效果如圖3所示，洗脫峰的酶液蛋白條帶越來越單一，白姑魚胰蛋白酶Trypsin A得到了純化。

2.2 白姑魚胰蛋白酶Trypsin A的SDS-PAGE檢測及其Western blotting鑒定

將分離純化的白姑魚胰蛋白酶Trypsin A同時進行SDS-PAGE檢測和Western blotting鑒定。其中，Western blotting所用的一抗是兔抗鯽魚胰蛋白酶多克隆抗體。由圖4可知，白姑魚胰蛋白酶Trypsin A的分子質(zhì)量為28 kD，白姑魚胰蛋白酶可以與抗鯽魚胰蛋白酶抗體呈陽性反應(yīng)。

2.3 白姑魚胰蛋白酶Trypsin A的性質(zhì)研究

2.3.1 白姑魚胰蛋白酶Trypsin A的最適pH值和pH值穩(wěn)定性

不同pH值對白姑魚陰離子型胰蛋白酶的活力影響如圖5所示，Trypsin A在pH 9.5左右時表現(xiàn)出的最大酶活力。當pH值低于9.5時，酶活力顯著下降。Trypsin A在不同pH值的緩沖液中，室溫下經(jīng)過 30 min水浴孵育處理后，對pH值的穩(wěn)定性如圖5所示，穩(wěn)定性范圍為9.5～11.0，在pH值小于8.0條件下，酶活力非常不穩(wěn)定。

魚類胰蛋白酶通常屬于堿性蛋白系［12］，在酸性環(huán)境下，酶會因為表面電荷分布的改變而不能和底物有效地結(jié)合［13］。白姑魚體內(nèi)胰蛋白酶的pH值活力適應(yīng)范圍與大西洋鱈魚（Gadus morhua）［14］、鯉魚（Cyprinus carpio）［15］、金槍魚（Thunnus tonggol）［3］以及大西洋鮭魚（Salmo salar）［16］等魚體內(nèi)胰蛋白酶類似，高于彈丸魚（Balistes capriscus）［17］胰蛋白酶的最適pH值。

2.3.2 白姑魚胰蛋白酶Trypsin A的最適溫度和溫度穩(wěn)定性

白姑魚胰蛋白酶Trypsin A的溫度范圍如圖6所示，選擇溫度范圍為 30～70 ℃，Trypsin A的最適溫度為 50 ℃。當酶在65 ℃以下水浴中經(jīng)過 30 min的加熱處理后，它們的活性仍能很好地保持。當溫度大于65 ℃時，酶活力會急劇下降，熱穩(wěn)定性變差。

白姑魚胰蛋白酶的最適溫度與已報道的格陵蘭鱈魚（Gadus ogac）［18］、大西洋狐鰹魚（Sarda）［19］、沙丁魚（Sardinops sagax caerulea）［20］等魚胰蛋白酶相似，而高于鯉魚（Cyprinus carpio）［15］和鳳尾魚（Engraulis encrasicholus）［21］胰蛋白酶的最適溫度，低于羅非魚（Oreochromis mossambicus）［22］和草魚（Ctenopharyngodon idellus）［23］胰蛋白酶的最適溫度。魚體內(nèi)胰蛋白酶的最適溫度可能與它們的棲息環(huán)境和生活習性有關(guān)。

2.3.3 白姑魚胰蛋白酶Trypsin A的底物特異性

表 1 白姑魚胰蛋白酶TrypsinA的底物特異性Table 1 Substrate specificity oftrypsinA熒光底物（10 μmol/L） 相對酶活力/% Boc-Phe-Ser-Arg-MCA 100 Boc-Gln-Arg-Arg-MCA 77.5±2.3 Boc-Val-Pro-Arg-MCA 122.8±3.0 Boc-Leu-Arg-Arg-MCA 75.4±1.1 Boc-Leu-Lys-Arg-MCA 60.3±2.8 Boc-Glu-Lys-Lys-MCA 8.7±2.0 Z-Phe-Arg-MCA 112.6±0.9 Suc-Leu-Leu-Val-Tyr-MCA 0 Arg-MCA 18.7±0.6 Ala-MCA 0 Met-MCA 0

白姑魚胰蛋白酶與各熒光底物反應(yīng)的結(jié)果如表1所示，與其他熒光底物相比，胰蛋白酶對絲氨酸蛋白酶底物Boc-Val-Pro-Arg-MCA的分解能力最強，與鯉魚（Cyprinus carpio）［15］和狗母魚（Saurida wanieso）［24］的肌原纖維結(jié)合型絲氨酸蛋白酶（myofibril-bound serine proteinase，MBSP）的最適熒光底物不一樣。當P1位的氨基酸為Arg時，明顯強于此位置為Lys，且P2位或P3位的氨基酸殘基對酶仍有很大的影響。有研究［24］表明，胰蛋白酶對Arg的分解效率為Lys的2～10 倍。胰蛋白酶對組織蛋白酶底物Z-Phe-Arg-MCA的分解能力比Boc-Phe-Ser-Arg-MCA稍高。但胰蛋白酶對胰凝乳蛋白酶底物Suc-Leu-Leu-Val-Tyr-MCA和氨肽酶（Arg-MCA、Ala-MCA、Met-MCA）幾乎不分解。由此可見，白姑魚胰蛋白酶Trypsin A的底物特異性與其他魚類胰蛋白酶的基本一致，但是對于組織蛋白酶底物Z-Phe-Arg-MCA的活性明顯偏高，可能是白姑魚胰蛋白酶不同于其他魚類胰蛋白酶的特異性質(zhì)，有待進一步實驗驗證。

2.3.4 不同抑制劑對白姑魚胰蛋白酶Trypsin A活性的影響

表 2 蛋白酶抑制劑對白姑魚胰蛋白酶Trypsin A的影響Table 2 Effectsof proteinaseinhibitors on the activity of trypsin A抑制劑 濃度/（mmol/L） 相對酶活力/% 無0 100 Pefabloc SC 1 0 STI 0.001 0 PMSF 1 5.1±0.8苯甲醚 5 15.1±2.6 Pepstatin 0.02 98.9±1.0 1，10-鄰菲咯啉 10 98.5±1.4 EDTA 10 89.7±3.1

不同的蛋白酶抑制劑對白姑魚胰蛋白酶活性的影響見表2，絲氨酸蛋白酶抑制劑Pefabloc SC和STI在較低濃度時能完全抑制白姑魚胰蛋白酶的活性，苯甲醚和PMSF對胰蛋白酶活性也幾乎完全抑制。天冬氨酸蛋白酶抑制Pepstatin及金屬蛋白酶抑制劑EDTA、1，10-鄰菲咯啉對白姑魚胰蛋白酶作用效果不明顯。由此可知，表2中蛋白酶抑制劑對白姑魚胰蛋白酶Trypsin A的抑制作用與其他魚類胰蛋白酶的基本一致，與胰凝乳蛋白酶的有差異，例如蒙特利沙丁魚（Sardinops sagax caerulea）［20］、加州對蝦（Penaeus californiensis）［25］和烏賊（Sepia?officinalis）［26］。但是EDTA對Trypsin A的活性卻有10%的抑制，可能是白姑魚胰蛋白酶的特殊現(xiàn)象，有待進一步研究。

3 結(jié) 論

白姑魚胰蛋白酶作為內(nèi)源性蛋白水解酶之一，活性高，在白姑魚的自溶作用中起主要作用。本研究從白姑魚的幽門垂組織中提取胰蛋白酶粗酶，并通過DEAESepharose Fast Flow和Sephacryl S-200 HR柱層析，純化得到一種陰離子型胰蛋白酶Trypsin A，并對其酶學性質(zhì)進行初步研究。結(jié)果表明，Trypsin A的分子質(zhì)量為28 kD，其最適反應(yīng)溫度為50 ℃，且在溫度小于65 ℃條件下仍具有很高的酶活力；最適pH值為9.5，pH值的耐受范圍為9.5～11.0；該酶對熒光底物P1位的Arg和Lys殘基有分解作用，且優(yōu)先分解Arg殘基，對于胰凝乳蛋白酶底物（Suc-Leu-Leu-Val-Tyr-MCA）和氨肽酶底物（Ala-MCA 和Met-MCA）不分解。絲氨酸類蛋白酶抑制劑對該酶具有強烈抑制作用。本研究結(jié)果可為白姑魚內(nèi)源性水解酶的應(yīng)用、白姑魚的貯存和加工工藝的改善提供依據(jù)。

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DOI:10.7506/spkx1002-6630-201613030

中圖分類號：TS264.2

文獻標志碼：A

文章編號：1002-6630（2016）13-0168-05

收稿日期：2015-08-23

基金項目：廈門市海洋漁業(yè)局（南方海洋中心）項目（14CZP03HJ04）；福建省科技廳引導性項目（2016N0020）

作者簡介：李歡（1989—），男，碩士研究生，研究方向為食品科學。E-mail：18030221708@163.com

*通信作者：杜翠紅（1967—），女，教授，博士，研究方向為食品生物技術(shù)。E-mail：cuihongdu@jmu.edu.cn

Purification and Characterization of Trypsin from White Croaker （Argyrosomus argentatus）

LI Huan， LI Ting， ZHAN Yunchao， DU Cuihong*
（National & Local Joint Engineering Research Center of Processing Techonology for Aquatic Products， College of Food and Biological Engineering， Jimei University， Xiamen 361021， China）

Abstract:An anionic trypsin （named as trypsin A） from the pyloric caeca of white croaker （Argyrosomus argentatus） was purified by ammonium precipitation， DEAE-Sepharose Fast Flow anion exchange chromatography and Sephacryl S-200 gel filtration chromatography.The characteristics of trypsin A were investigated.The results showed that trypsin A migrated as a single protein band with a molecular weight of about 28 kD in SDS-PAGE.Trypsin A exhibited its optimal temperature at 50 ℃ and was stable below 65 ℃.Trypsin A revealed its optimal pH at 9.5 and was stable in the pH range from 9.5 to 11.0.The purified trypsin A was analyzed by western blotting using anti-common carp trypsin antibody， and the result showed that the active region of the trypsin was highly conservative.Serine proteinase inhibitors were effective against trypsin A.

Key words:white croaker； trypsin； separation and purification； enzymatic characteristics