龐倩倩，董　進

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常染色體顯性遺傳骨硬化癥Ⅱ型氯離子第七通道蛋白基因突變1例檢測

龐倩倩，董進

山西醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院(太原 030001)

關(guān)鍵詞：遺傳性骨??；骨硬化癥；基因突變；氯離子第七通道蛋白；常染色體；檢測

骨硬化癥是一類以骨密度增高，破骨細胞吸收功能障礙為主要特點的遺傳性骨病，根據(jù)其臨床表現(xiàn)和致病基因的不同可分為常染色體顯性遺傳骨硬化癥(autosomal dominant inheritance osteopetrosisADO)，常染色體隱性遺傳骨硬化癥(autosomal recessive inheritance osteopetrosis，ARO)和罕見的X染色體連鎖隱性遺傳骨硬化癥(X-linked osteopetrosis，XLO)。骨硬化癥的臨床表現(xiàn)具有廣泛的異質(zhì)性，如貧血、全血細胞減少、膿毒血癥、繼發(fā)性的肝脾腫大等。然而部分病人亦可無癥狀或癥狀較輕微，僅僅通過骨骼的影像學(xué)檢查才可以發(fā)現(xiàn)。在影像學(xué)上該疾病通常表現(xiàn)為“中心性骨硬化”和“彌漫性骨硬化”兩種類型，而這兩種類型均由于骨脆性增加而引起的骨折風(fēng)險率增加[1]。根據(jù)其臨床表現(xiàn)不同，ADO又可分為：常染色體顯性遺傳骨硬化癥良性Ⅰ型(ADO-Ⅰ)，良性Ⅱ型(ADO-Ⅱ)，良性Ⅲ型(ADO-Ⅲ)[1-2]，其中ADO-Ⅱ最為常見。該型具有典型的ADO影像學(xué)特征，主要的并發(fā)癥體現(xiàn)在骨骼系統(tǒng)，包括病理性骨折，脊柱側(cè)凸等[3]。ADO-Ⅱ主要是由位于染色體16p13，編碼氯離子第7通道蛋白(CLCN7)基因突變引起的[4]。目前國內(nèi)罕有關(guān)于該疾病基因突變的報道，且尚未建立中國人群關(guān)于該疾病的基因突變譜，因此對骨硬化病人進行基因分析具有很重要的臨床意義。

本研究擬通過對1例常染色體顯性遺傳的骨硬化癥家系進行臨床及基因?qū)W特征分析，探討該疾病的致病機制。

1資料與方法

1.1研究對象先證者，男性，18歲。2015年因“骨硬化癥”，就診于我科門診。病人第一胎，足月順產(chǎn)，出生體重、身長、出牙時間均不詳。智力未見落后。實驗室檢查結(jié)果：生化指標(biāo)未見明顯異常，全血細胞計數(shù)，血鈣，血磷，血堿性磷酸酶，血肌酐，血iPTH水平均處于正常范圍；影像學(xué)特征：頭顱正側(cè)位片示：顱骨骨皮質(zhì)密度增厚，板障增厚，顱底骨質(zhì)增厚硬化；胸腰椎正側(cè)位相示：椎體上下終板骨密度增厚，中央密度相對較低，呈“三明治”樣改變(見圖1)。家族史中未有類似癥狀。病人及其父母均被告知研究目的，并簽署知情同意書。

注：a.胸腰椎正側(cè)位相：椎體上下終板骨密度增厚，中央密度相對較低，呈“三明治”樣改變(紅色箭頭所示)；b.頭顱正位相：顱骨骨皮質(zhì)密度增厚，板障增厚，顱底骨質(zhì)增厚硬化(白色箭頭所示)。

圖1先證者影像學(xué)特征

1.2血標(biāo)本的采集及DNA的制備在遵循知情同意原則的基礎(chǔ)上，采集病人及其父母各2 mLEDTA抗凝血，用德國Qiagen全血DNA提取試劑盒提取病人及其家屬的外周血DNA。

1.3致病基因外顯子引物設(shè)計根據(jù)NCBI提供的人類基因組檢索網(wǎng)站(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gene)，對人類野生型CLCN7的基因組序列進行檢索，使用專業(yè)生物學(xué)引物設(shè)計軟件GeneRunner software對該基因的編碼外顯子及其交界區(qū)進行PCR引物設(shè)計，經(jīng)UCSC驗證，確保所有的引物都具有高度的特異性，擴增片段長度及退火溫度見表1。

表1　CLCN7基因引物序列

1.4PCR擴增測序總反應(yīng)體系30 μL：DNA模板2.6 μL，上下游引物各1.2 μL，2×Taq PCR 混合酶15 μL，ddH2O 10 μL；反應(yīng)條件：預(yù)變性 95 ℃ 5 min，變性 94 ℃ 30 s，退火56 ℃ ～62 ℃ 30 s，延伸 72℃ 1 min，循環(huán)35輪，末次延伸 72℃ 10 min。

PCR產(chǎn)物測序：PCR產(chǎn)物送專業(yè)生物公司完成測序，使用美國A&B公司(Applied Biosystems，F(xiàn)oster City，CA)ABI3770 測序儀測序。

1.5DNA序列突變分析應(yīng)用Chromas Version2.4軟件分析測序結(jié)果，將測序圖與正常的序列比對，然后應(yīng)用UCSC和dbSNP138數(shù)據(jù)庫分別與基因組DNA序列進行比對。最后應(yīng)用Human Gene Mutation Database Professional 2014(HGMD 2014)數(shù)據(jù)庫對突變體進行檢索，確定其是否為新發(fā)突變。對所有測序反應(yīng)均雙向驗證。

2結(jié)果

該家系圖及測序結(jié)果見圖2。先證者及其父母CLCN7基因突變檢測結(jié)果示：先證者為第23外顯子c.2299C>T(p.R767W)的雜合錯義突變；其父母均非該突變的攜帶者，該突變?yōu)橐蛔园l(fā)突變。經(jīng)查對2014HGMD突變數(shù)據(jù)庫，證實該突變?yōu)橐灰阎蛔?，?001年由Cleiren首次報道[5]。

注：左邊為家系圖。黑色全黑方框為先證者(II1)。I1為先證者父親，I2為先證者母親，均非雜合子。右側(cè)為CLCN7基因測序圖。先證者為第23外顯子為c.2299C>T(p.R767W)的雜合錯義突變(箭頭所示)，其父母親均非該突變攜帶者。

圖2病人家系圖及CLCN7基因測序結(jié)果

3討論

ADO-Ⅱ又名“Albers-Sch?nberg病”[6]，是一種罕見的代謝性骨病，該亞型的臨床表現(xiàn)極度特異，且外顯率不全。ADO-Ⅱ型具有典型的ADO影像學(xué)特征，如椎體上下終板骨密度增厚，中央密度相對較低“夾心椎”樣表現(xiàn)及髂骨骨密度不均勻增高，出現(xiàn)濃淡相間的同心環(huán)狀的“骨中骨”現(xiàn)象。該病主要的并發(fā)癥體現(xiàn)在骨骼系統(tǒng)，包括病理性骨折、脊柱側(cè)凸、髖骨骨關(guān)節(jié)炎和上頜骨多發(fā)骨髓炎[6]。

目前認為編碼氯離子第7通道蛋白7基因突變是引起ADO-Ⅱ的主要原因[4]。CLCN7屬于多通道膜蛋白，主要功能是通過電壓-門控通道調(diào)節(jié)Cl-/H+交換。在破骨細胞中，CLCN7位于褶皺緣和溶酶體的隔室內(nèi)，主要作用是將細胞外已通過離子交換進入細胞內(nèi)的Cl-運輸入破骨細胞的小囊泡，在小囊泡中與通過質(zhì)子泵運輸來的H+作用形成溶骨的酸性環(huán)境。破骨細胞吸收腔的低pH環(huán)境對于完成正常的骨吸收作用非常重要[7]。研究發(fā)現(xiàn)ADO-Ⅱ主要發(fā)病機制為CLCN7蛋白功能障礙，造成破骨細胞酸性環(huán)境形成受損，不足以發(fā)揮破骨細胞的骨吸收作用[4]。

本研究中先證者具有典型的骨硬化癥影像學(xué)表現(xiàn)，對該先證者進行CLCN7基因檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該病人CLCN7基因的第23外顯子c.2299C>T(p.R767W)的雜合錯義突變。該突變?yōu)橐灰阎蛔?，但在國?nèi)罕有報道。Waguespack等[8]對62例ADO病人研究后發(fā)現(xiàn)，該R767W為較常見的一種。

本研究通過輔助檢查和基因檢測的方法，確證了1例中國人群罕有報道ADO-Ⅱ病人，進一步證實了CLCN7基因c.2299C>T (p.R767W)突變與該病人ADO-Ⅱ臨床表現(xiàn)密切相關(guān)。

參考文獻：

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(本文編輯王雅潔)

通訊作者：董進，E-mail： Sdyydj@medmail.com.cn

中圖分類號：R596

文獻標(biāo)識碼：C

doi：10.3969/j.issn.1672-1349.2016.13.048

文章編號：1672-1349(2016)13-1566-03

(收稿日期：2015-05-30)