楊佩穎，許文婷，劉宏根，張　欣，張　瑩，于曉宇，賈英杰

（天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，天津　300193）

消巖湯對(duì)A549/DDP細(xì)胞自噬及耐藥蛋白的影響研究*

楊佩穎，許文婷，劉宏根，張欣，張瑩，于曉宇，賈英杰

（天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，天津300193）

［目的］通過消巖湯對(duì)耐順鉑人肺腺癌細(xì)胞A549/DDP多藥耐藥及自噬蛋白的影響，探究消巖湯對(duì)耐順鉑人肺腺癌A549/DDP的耐藥逆轉(zhuǎn)作用及探討相關(guān)分子通路。［方法］建立穩(wěn)定細(xì)胞耐藥模型，連續(xù)灌胃不同濃度消巖湯10 d后，通過血清藥理學(xué)的實(shí)驗(yàn)方法，提取藥物血清，用含藥血清作用于肺腺癌細(xì)胞耐藥細(xì)胞A549/DDP，通過實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（QPT-PCR）和蛋白免疫印跡法（Werstern Blot）檢測(cè)A549/DDP耐藥、自噬相關(guān)基因的表達(dá)及相關(guān)通路蛋白的變化。［結(jié)果］高劑量消巖湯，低劑量消巖湯和生理鹽水作用于肺腺癌耐藥細(xì)胞A549/DDP，檢測(cè)A549/DDP細(xì)胞中耐藥相關(guān)蛋白P-糖蛋白（P-gp）、肺抗藥性相關(guān)蛋白（LRP）及自噬相關(guān)蛋白Beclin1，HMGB1 mRNA和蛋白表達(dá)變化，發(fā)現(xiàn)高劑量組消巖湯處理細(xì)胞株后P-gp、LRP及自噬相關(guān)蛋白Beclin1，HMGB1 mRNA和蛋白均發(fā)生降低（P＜0.05），進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)消巖湯可影響AKT1-mTOR相關(guān)基因，消巖湯明顯降低AKT1，mTOR蛋白的表達(dá)。［結(jié)論］消巖湯通過影響AKT1-mTOR分子通路進(jìn)而影響耐藥相關(guān)蛋白P-gp、LRP及自噬相關(guān)蛋白Beclin1，HMGB1基因的變化。

消巖湯；細(xì)胞自噬；耐藥；分子通路

化療在惡性腫瘤綜合治療中有舉足輕重的地位，據(jù)美國(guó)癌癥協(xié)會(huì)估計(jì)，90%以上腫瘤患者死亡在不同程度上受到耐藥的影響。在惡性腫瘤的治療過程中，腫瘤患者對(duì)化療藥物的耐藥性成為腫瘤治療的最大瓶頸之一。有些腫瘤，在治療開始時(shí)就會(huì)出現(xiàn)對(duì)藥物的高度耐受，另一些腫瘤，化療開始時(shí)有效，久用則產(chǎn)生抗藥，如小細(xì)胞肺癌等，出現(xiàn)獲得性抗藥性（Acquired resistance）稱為繼發(fā)性耐藥［1］。化療過程中產(chǎn)生耐藥性是腫瘤化療失敗的主要原因，因此克服多藥耐藥性是治療腫瘤不可回避的問題［2］。腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的耐藥性與腫瘤的發(fā)生一樣，是一個(gè)多因素、多步驟的過程。目前研究耐藥機(jī)制較為廣泛的是P-糖蛋白（P-gp）外排，大多數(shù)研究認(rèn)為化療藥物在體內(nèi)作用減少主要是因?yàn)樗幬镌诩?xì)胞內(nèi)流減少，或者由于外排增多，其中P-gp、肺抗藥性相關(guān)蛋白（LRP）是細(xì)胞膜的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，腫瘤藥物可以通過細(xì)胞膜的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白使外排增多，從而減少藥物在細(xì)胞中濃度。目前大量研究顯示，細(xì)胞自噬的變化也可導(dǎo)致細(xì)胞耐藥性的改變。自噬在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用是復(fù)雜的，是腫瘤治療的雙刃劍?；熕幬锾幚淼哪[瘤細(xì)胞可以發(fā)生死亡性自噬和保護(hù)性自噬［3］。多種抗腫瘤治療后，因腫瘤缺氧，一定程度上削弱了抗腫瘤治療的效果，從而產(chǎn)生耐藥［4］。大量實(shí)驗(yàn)證明，通過抑制細(xì)胞自噬，使腫瘤患者對(duì)抗癌藥物和放療的敏感性增加。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)通過抑制核糖核酸（RNA）干擾自噬相關(guān)基因的表達(dá)可上調(diào)自噬表達(dá)，從而逆轉(zhuǎn)乳腺癌細(xì)胞對(duì)多柔比星的耐藥性［5］。張潔等［6］發(fā)現(xiàn)對(duì)順鉑耐藥的A2780/DDP細(xì)胞中，下調(diào)自噬基因Beclin 1的表達(dá)對(duì)順鉑誘導(dǎo)的自噬激活具有抑制作用，提高了耐順鉑細(xì)胞的敏感性。在此基礎(chǔ)上，筆者將消巖湯分為低劑量組和高劑量組，并且與生理鹽水組相比較，分析消巖湯對(duì)耐藥基因和自噬基因的影響，并探索其分子機(jī)制。

1　材料與方法

1.1細(xì)胞人肺腺癌A549敏感細(xì)胞（由天津醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)中心提供），A549/DDP耐藥細(xì)胞（購(gòu)于上海博谷生物科技有限公司：博谷公司采用恒定的順鉑濃度，周期性的作用于人肺腺癌A549敏感細(xì)胞，經(jīng)過6個(gè)月的誘導(dǎo)，培育而成的耐順鉑人肺腺癌A549/DDP耐藥細(xì)胞）。

*基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81273937），天津市科委自然科學(xué)基金青年項(xiàng)目（13JCQNJC10900），天津市抗癌重大專項(xiàng)攻關(guān)計(jì)劃（12ZCDZSY15800）。

作者簡(jiǎn)介：楊佩穎（1982-），女，碩士，主治醫(yī)師，主要從事中西醫(yī)結(jié)合腫瘤治療工作。

通訊作者：賈英杰，E-mail：jiayingjie1616@sina.com。

1.2試劑、耗材及儀器Mini-PROTEAN 3 Elecreophoresis Cell、Mini Trans-Blot Module、PowerPac Basic Power Supply均來自Bio-Rad，F(xiàn)luorChem FC2 Imaging System、AlphaView系統(tǒng)軟件均來自Alpha Innotech。0.02%EDTA的配制、MTT溶液的配制，PVDF膜，辣根酶標(biāo)記二抗，ECL。

1.3A549裸鼠皮下移植瘤模型的建立A549細(xì)胞培養(yǎng)、傳代：采用人肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)549。耐DDP肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)549/DDP模型進(jìn)行培養(yǎng)并傳代，在細(xì)胞的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期收集細(xì)胞。離心5 min，磷酸鹽緩沖溶液（PBS）洗滌兩次，離心后棄上清液，離心管外周以冰袋來維持溫度在4℃左右，以此來保持瘤細(xì)胞的活性。最后用生理鹽水稀釋，把細(xì)胞濃度調(diào)整到5×106cell/mL。在高劑量組、低劑量組、生理鹽水組中每只小鼠右前腋下皮下接種0.2 mL。

1.4消巖湯含藥血清干預(yù)A549/DDP耐藥細(xì)胞1）制備消巖湯：方由黃芪、太子參、夏枯草、白花蛇舌草等藥物組成，規(guī)格每瓶100 mL。生產(chǎn)單位：本院制劑室。制備方法參照中藥藥物實(shí)驗(yàn)方法學(xué)。消巖湯（太子參、生黃芪、姜黃、郁金、白花蛇舌草等共計(jì)140 g中藥）水煎液均由天津中醫(yī)藥大學(xué)中藥提取室嚴(yán)格按回流提取法進(jìn)行提取，其終質(zhì)量濃度濃縮成每毫升相當(dāng)于原生藥材1.5 g的藥液。2）中藥灌胃：裸鼠接種A549腫瘤細(xì)胞7 d后，前3組小鼠右腋注射局部出現(xiàn)明顯皮丘，移植瘤模型建立。待前3組所有裸小鼠的皮下腫瘤的平均直徑達(dá)到約5 mm時(shí)開始消巖湯灌胃，高劑量組40 g/kg灌胃，低劑量組20 g/kg灌胃給藥，連續(xù)10 d，每日1次。3）含藥血清的制備：灌胃10d后眼眶取血法采血，37℃，無菌室內(nèi)靜置4 h，離心8 000 r/min，15 min，取淡藍(lán)色血清于2 mL EP管中，標(biāo)識(shí)組別。高速離心14 000 r/min，5 min，重復(fù)2次。分別提取上清液，分裝，56℃水浴滅活30 min，用0.22 μm微孔濾膜過濾除菌，-20℃保存。4）實(shí)驗(yàn)分組：生理鹽水組，低濃度消巖湯組，高濃度消巖湯組干預(yù)肺癌耐藥細(xì)胞株A549/DDP，72 h以后，檢測(cè)肺癌耐藥細(xì)胞株A549/DDP相關(guān)mRNA和蛋白的表達(dá)。

1.5檢測(cè)指標(biāo)

1.5.1逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）檢測(cè)相關(guān)mRNA的表達(dá)總RNA提取試劑盒、DNA第一鏈合成試劑盒均購(gòu)自北京通瑞生物有限公司。RNA完整性采用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，其透過率與純度采用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)。以O(shè)ligo-dT15為引物，參照20 μL反應(yīng)體系合成cDNA第一鏈。引物序列由北京通瑞生物有限公司合成并提供。反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性10 s；95℃5 s，64℃34 s，40個(gè)循環(huán)。每對(duì)引物設(shè)3個(gè)復(fù)孔。結(jié)果用ABIPRISM7500分析，融解曲線特異。無引物二聚體和非特異性擴(kuò)增。ABI PRISM 7500自動(dòng)生成CT值。引物：P-gp forward（5＇-AAACACCACGGGA GCA-3＇），reverse（5＇-AGTGTTAGTTGCCAGCCAT-3＇）；LRP forward（5＇-TTCTGGATTTGGTGGACGC-3＇），reverse（5＇-ACTTCTCTCCCTTGACCAC-3＇）；Beclin1forward（5＇-ATCCTCGACCGTGTCACCATCC ACG-3＇），reverse（5＇-GATGAGCTGAGTGTCCAGCTGGG-3＇）；HMGB1 forward（5＇-ATGCGCAAAGGA GATCCTA-3＇），reverse（5＇-ATTCATCATCATCTTC T-3＇）；β-actin forward（5＇-ATTCAACGGCACAGTCA AGG-3＇），reverse（5＇-GCAGAAGGGGCGGAGATGA-3＇）。

1.5.2用蛋白免疫印跡法（Western Blot法）檢測(cè)相關(guān)蛋白表達(dá)樣品處理：組織樣品加適量預(yù)冷的蛋白裂解液RIPA，勻漿，14 000 r/min離心15 min，上清液轉(zhuǎn)入新管。BCA法定測(cè)定蛋白含量。將蛋白質(zhì)混合樣品SDS-PAGE電泳：取100 μg處理好的樣品，按《分子克隆》方法進(jìn)行SDS-PAGE電泳，積層膠6%，分離膠8%，膠厚0.75 mm。濕法轉(zhuǎn)膜：膠于轉(zhuǎn)移液（含甲醇15%）中平衡10 min；從下至上分別放置濾紙、膠、PVDF膜（0.45 μm）、濾紙，夾子夾好放入倒好轉(zhuǎn)移液的轉(zhuǎn)移槽中，250 mA轉(zhuǎn)膜90 min。轉(zhuǎn)印后，將NC膜或PVDF膜與抗血清一起孵育，使第一抗體與待檢蛋白結(jié)合，再用酶標(biāo)第二抗體孵育膜，使第二抗體與第一抗體結(jié)合反應(yīng)，最后用酶的顯色底物或發(fā)光底物顯示靶蛋白條帶。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 22統(tǒng)計(jì)軟件處理，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析（One-Way ANOVA），組間兩兩比較時(shí)，若方差齊采用LSD法，若方差不齊采用Dunnett's T3法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1 PCR檢測(cè)A549/DDP細(xì)胞P-gp、LRP、Beclin1、HMGB1的表達(dá)A549/DDP細(xì)胞在鹽水，低劑量消巖湯，高劑量消巖湯72 h后收集細(xì)胞提取總RNA，PCR檢測(cè)與P-gp、LRP、Beclin1、HMGB1 mRNA表達(dá)量的變化，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。結(jié)果表明：與生理鹽水組，隨著消巖湯含藥血清藥物濃度的增加，P-gp、LRP、Beclin1、HMGB1 mRNA表達(dá)逐漸減弱，并且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。

表1PCR檢測(cè)A549/DDP細(xì)胞P-gp、LRP、Beclin1、HMGB1的表達(dá)（±s）Tab.1 PCR detection of A549/DDP cell P-gp，LRP，Beclin1，HMGB1 expression（±s）

表1PCR檢測(cè)A549/DDP細(xì)胞P-gp、LRP、Beclin1、HMGB1的表達(dá)（±s）Tab.1 PCR detection of A549/DDP cell P-gp，LRP，Beclin1，HMGB1 expression（±s）

注：與生理鹽水組比較，*P＜0.05。

組別　P-gp　LRP　Beclin1　HMGB1生理鹽水組　0.40±0.05*0.42±0.04*0.54±0.05*0.59±0.07*低劑量消巖湯組　0.23±0.04*0.21±0.02*0.24±0.04*0.38±0.04*高劑量消巖湯組　0.08±0.01*0.11±0.01*0.07±0.01*　0.09±0.10*

2.2Western Blot法檢測(cè) A549/DDP細(xì)胞 P-gp、LRP、Beclin1、HMGB1蛋白的表達(dá)A549/DDP細(xì)胞在鹽水，低劑量消巖湯，高劑量消巖湯72 h后收集細(xì)胞提取總蛋白，Western blot檢測(cè)與自噬、耐藥相關(guān)的P-gp、LRP、Beclin1、HMGB1蛋白表達(dá)量的變化。結(jié)果表明：與生理鹽水組比較，隨著消巖湯藥物濃度的增加，P-gp、LRP、Beclin1、HMGB1蛋白表達(dá)逐漸減弱，并且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見圖1。

圖1　Western Blot法檢測(cè)A549/DDP細(xì)胞P-gp、LRP、Beclin1、HMGB1蛋白的表達(dá)Fig.1　Western Blot method to detect the A549/DDP cell P-gp，LRP，Beclin1，HMGB1 protein expression

2.3Western Blot法檢測(cè) A549/DDP細(xì)胞檢測(cè)AKT1-mTOR分子通路蛋白A549/DDP細(xì)胞在生理鹽水，低劑量消巖湯，高劑量消巖湯72 h后收集細(xì)胞提取收集細(xì)胞提取總蛋白，Western blot檢測(cè)與細(xì)胞自噬相關(guān)的AKT1，mTOR的表達(dá)變化，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。結(jié)果表明：與生理鹽水組比較，隨著消巖湯藥物劑量的增加，AKT1，mTOR蛋白表達(dá)逐漸減弱，并且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。見圖2。

圖2Western Blot法檢測(cè)A549/DDP細(xì)胞AKT1-mTOR分子通路蛋白Fig.2　Western Blot method to detect the A549/DDP cells AKT1-mTOR molecular pathways protein

3　結(jié)論

不同濃度的消巖湯作用于肺腺癌耐藥細(xì)胞A549/DDP，隨著中藥濃度的增加，細(xì)胞耐藥相關(guān)蛋白P-gp、LRP蛋白表達(dá)逐漸減弱（P＜0.05），消巖湯能下調(diào)自噬相關(guān)蛋白Beclin1、HMGB1表達(dá)，從而抑制自噬發(fā)生。進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)消巖湯可影響AKT1-mTOR通路相關(guān)基因變化，筆者推測(cè)消巖湯可能通過影響AKT1-mTOR分子通路進(jìn)而影響耐藥相關(guān)蛋白P-gp、LRP及自噬相關(guān)蛋白Beclin1，HMGB1基因的變化。

4　討論

在腫瘤化療過程中，大多數(shù)患者都會(huì)產(chǎn)生不同程度的腫瘤耐藥性，影響治療效果，降低患者的生存率及臨床獲益。因此，越來越多的國(guó)內(nèi)外關(guān)注腫瘤耐藥性的發(fā)生機(jī)制及其治療策略。目前逆轉(zhuǎn)腫瘤耐藥性的研究已經(jīng)取得了一定的成果，但由于大多數(shù)逆轉(zhuǎn)劑的毒副反應(yīng)限制在臨床中的嚴(yán)格使用。中醫(yī)藥立足于辨證論治，以低毒、多靶點(diǎn)等優(yōu)勢(shì)在逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥性方面取得了可喜的成績(jī)，能明顯提高腫瘤對(duì)化療藥物敏感性。有研究通過觀察補(bǔ)腎化瘀解毒復(fù)方荷瘤動(dòng)物含藥血清對(duì)肺腺癌敏感細(xì)胞和耐藥細(xì)胞細(xì)胞毒作用，以及對(duì)細(xì)胞周期的影響和對(duì)順鉑的耐藥逆轉(zhuǎn)作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)補(bǔ)腎化瘀解毒復(fù)方使肺癌耐藥細(xì)胞MRP和GST的表達(dá)下調(diào)，增強(qiáng)TOPOⅡ含量及其活性，并進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，此復(fù)方有阻止肺癌耐藥細(xì)胞內(nèi)鈣離子（Ca2+）的內(nèi)流或釋放作用［8］，證明中藥復(fù)方聯(lián)合化療可以起到增效減毒的作用，為逆轉(zhuǎn)肺癌化療耐藥性提供客觀的實(shí)驗(yàn)依據(jù)［9］。

腫瘤的多藥耐藥機(jī)制十分復(fù)雜，主要與P-gp所介導(dǎo)的經(jīng)典機(jī)制以及LRP等介導(dǎo)的非經(jīng)典機(jī)制密切相關(guān)。Levatic J等［10］研究發(fā)現(xiàn)Akt介導(dǎo)的耐藥性可能與作用于MDR1進(jìn)而促進(jìn)P-gp的表達(dá)相關(guān)，在腫瘤細(xì)胞內(nèi)，P-gp通過利用ATP提供的能量降低細(xì)胞內(nèi)藥物的濃度從而使細(xì)胞產(chǎn)生耐藥性。LRP系構(gòu)成人體穹隆蛋白的主要成分，廣泛分布于人體的體腔上皮、巨噬細(xì)胞、血腦屏障和分泌性器官中［11］，通過降低核內(nèi)藥物濃度，消除藥物對(duì)脫氧核糖核酸（DNA）靶點(diǎn)的影響，介導(dǎo)對(duì)鉑類、烷化劑等的耐藥。有研究表明LRP在肺腺癌中的表達(dá)明顯高于癌周組織［12］。這兩種耐藥基因產(chǎn)物在肺癌耐藥研究中較多，其過度表達(dá)可產(chǎn)生耐藥現(xiàn)象。本研究消巖湯干預(yù)耐藥細(xì)胞株A549/DDP后，發(fā)現(xiàn)LRP和P-gp mRNA和蛋白水平均發(fā)生變化，并且發(fā)現(xiàn)隨著濃度增加，LRP和P-gp表達(dá)越低，并且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。表明消巖湯可以逆轉(zhuǎn)肺癌對(duì)順鉑的耐藥，分析原因認(rèn)為通過抑制細(xì)胞膜上P-gp蛋白組織對(duì)化療藥物的外排和抑制LRP及其基因的表達(dá)與轉(zhuǎn)錄，增強(qiáng)了以細(xì)胞核為靶點(diǎn)的化療藥物進(jìn)入核內(nèi)，從而達(dá)到有效的藥物濃度而成功逆轉(zhuǎn)肺癌的耐藥。

Beclin1是自噬啟動(dòng)過程的標(biāo)志［13］，具有獨(dú)特結(jié)構(gòu)序列的多功能蛋白，對(duì)凋亡和自噬都有一定的調(diào)節(jié)作用，因此抑制耐藥細(xì)胞Beclin 1的表達(dá)可能影響凋亡與細(xì)胞自噬的發(fā)生［14］。腫瘤細(xì)胞為了緩解化療應(yīng)激狀態(tài)而存活下來，必須通過自噬及時(shí)將積聚在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)的錯(cuò)誤折疊蛋白清除，這是腫瘤產(chǎn)生化療耐藥性的一種重要機(jī)制［15］。劉郁鵬等［16］研究發(fā)現(xiàn)新輔助多西他賽和順鉑方案術(shù)前化療，可影響肺腺癌組織中Beclin1的表達(dá)水平，RT-PCR法檢測(cè)結(jié)果顯示經(jīng)新輔助化療后Beclin1 mRNA水平明顯高于對(duì)照組，而Bcl-2水平明顯低于對(duì)照組，Beclin1與Bcl-2呈負(fù)相關(guān)。諸多學(xué)者發(fā)現(xiàn)細(xì)胞自噬與肺癌化療產(chǎn)生耐受相關(guān)，通過上調(diào)自噬相關(guān)基因如Beclin1，下調(diào)凋亡分子，如Caspase-3水平，使細(xì)胞耐受化療，從而逃避凋亡而存活［17］。本研究消巖湯處理A549/DDP，發(fā)現(xiàn)自噬相關(guān)蛋白Beclin1，高遷移率族蛋白B-1 （HMGB1）呈藥物依賴性表達(dá)下調(diào)，Beclin1通過與classⅢPI3K通路形成復(fù)合物參與自噬體的形成，Beclin1表達(dá)下降，影響自噬小體形成，無法啟動(dòng)自噬。Beclin1高表達(dá)增強(qiáng)自噬的活性，減少順鉑損傷腫瘤細(xì)胞的作用，從而發(fā)揮腫瘤保護(hù)作用，因此，抑制Belin1的表達(dá)可逆轉(zhuǎn)細(xì)胞耐藥，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

消巖湯具有扶正、解毒、祛瘀之功效，黃芪、太子參滋陰益氣、扶正以祛邪共為君藥。夏枯草、生牡蠣、白花蛇舌草相伍清熱解毒、軟堅(jiān)散結(jié)，為臣藥。郁金、姜黃行氣解郁、活血祛瘀，為佐藥；蜂房搜剔絡(luò)脈中之瘀毒，為使藥。消巖湯君藥黃芪的有效成分黃芪多糖能夠逆轉(zhuǎn)H22/ADM細(xì)胞株的耐藥，其機(jī)制是降低了P-gp的外排功能，下調(diào)了MDRlmRNA 和P-gp的表達(dá)。AKT1-mTOR分子通路是影響細(xì)胞增殖，耐藥和自噬的相關(guān)分子通路，許多研究證明AKT1-mTOR分子通路的激活與癌癥的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［18］。并且有研究證實(shí)姜黃素抑制腫瘤與AKT1-mTOR分子通路密切相關(guān)，通過抑制AKT1-mTOR分子通路的表達(dá)，進(jìn)而降低下游基因的表達(dá)，可顯著增強(qiáng)化療藥物的殺傷作用［19］。筆者前期發(fā)現(xiàn)消巖湯逆轉(zhuǎn)肺癌耐藥的可能機(jī)制為通過抑制P-gP及其基因的表達(dá)而阻止細(xì)胞對(duì)順鉑的輸出，從而達(dá)到有效逆轉(zhuǎn)肺癌耐藥的療效［20］，本研究為進(jìn)一步探究中藥復(fù)方消巖湯對(duì)耐順鉑人肺腺癌A549/DDP的耐藥逆轉(zhuǎn)作用及探討相關(guān)分子通路。筆者研究發(fā)現(xiàn)，在耐藥細(xì)胞株中消巖湯可以抑制AKT1和mTOR基因的表達(dá)，進(jìn)而抑制AKT1-mTOR分子通路的表達(dá)，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的死亡，而消巖湯是否直接通過抑制AKT1-mTOR分子通路導(dǎo)致耐藥基因和自噬基因的變化，仍需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證明。

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（本文編輯：馬英，高杉）

Study on the autophagy and resistance protein affected by Xiaoyan decoction in A549/DDP cells

YANG Pei-ying，XU Wen-ting，LIU Hong-gen，ZHANG Xin，ZHANG Ying，YU Xiao-yu，JIA Ying-jie
（The First Affiliated Hospital of Tianjin University of Traditional Chinese Medicine，Tianjin 300193，China）

［Objective］Through the cisplatin resistance of the human lung adenocarcinoma cells A549/DDP multi-resistant and influence of autophagy protein by Xiaoyan decoction，finding out the influence of elimination of cisplatin resistance of lung adenocarcinoma A549/DDP resistance reversal agents and explore relevant molecular pathways.［Methods］Establish a stable cell resistance model，continuous lavaging Xiaoyan decoction with different concentrations in 10 days，by serum pharmacology experiment method with drug-containing serum on lung adenocarcinoma cells resistant cells A549/DDP，through the QRT-PCR and Werstern Blot western Blot method to detect A549/DDP resistant，autophagy protein expression of related genes and related pathways.［Results］Resistance effect on lung adenocarcinoma cells A549/DDP with high dose Xiaoyan decoction，low dose Xiaoyan Decoction and normal saline，elimination saline resistance effect on lung adenocarcinoma cells A549/DDP，detecting drug-resistant related proteins in A549/DDP cell P-gp，LRP and Beclin1 protein involved in autophagy，HMGB1mRNA and protein expression changes，through the detection of A549/DDP cells drug-resistant related proteins P-gp，LRP and Beclin1 protein involved in autophagy，HMGB1mRNA and protein expression changes，high dose group of rock soup elimination processing cell lines after P-gp，LRP and Beclin1 protein involved in autophagy，both the HMGB1 mRNA and protein were lower（P＜0.05）.Further found that Xiaoyan decoction can affect the AKT1-elimination mTOR related genes and significantly reduce the AKT1，mTOR protein expression.［Conclusion］We hypothesized that Xiaoyan decoction influence elimination drug-resistant related proteins P-gp，LRP and Beclin1 protein involved in autophagy，HMGB1 genetic changes by AKT1-mTOR molecular pathways.

Xiaoyan decoction；autophagy；resistance；molecular pathway

R285.5

A

1672-1519（2016）06-0358-05

10.11656/j.issn.1672-1519.2016.06.11

2016-01-16）