石瑾秋，盧健翔，李寶艷

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·論著·

血漿miR-451水平與子宮內膜異位癥的關系

石瑾秋，盧健翔，李寶艷

目的：探討血漿微小RNA451（miR-451）與子宮內膜異位癥（EMs）的關系，并觀察miR-451對體外培養(yǎng)的子宮內膜基質細胞的增殖和遷移的作用。方法：選取2014年1月—2015年5月于深圳市羅湖區(qū)人民醫(yī)院就診的EMs患者（EMs組）54例，正常對照組59例，采血并提取血漿總RNA。采用實時熒光定量聚合酶鏈反應（real-time qPCR）檢測血漿miR-451的表達強度。通過CCK-8實驗檢測miR-451對異位子宮內膜基質細胞增殖的調控作用；采用損傷愈合實驗探討過表達miR-451后異位子宮內膜基質細胞的遷移變化。結果：EMs患者血漿miR-451表達水平低于對照組［（0.53±0.14）vs.（1.00±0.20），t=14.50，P＜0.01］；過表達miR-451后EMs基質細胞的相對遷移活性下降［（1.00±0.12）vs.（0.74±0.02），t=4.73，P=0.001］。結論：EMs患者血漿miR-451水平減低；miR-451可能通過抑制異位內膜基質細胞增殖和遷移發(fā)揮作用。

子宮內膜異位癥；微RNAs；子宮內膜；聚合酶鏈反應；miR-451

【Abstract】Objective:To analyze the level of plasmamiR-451 in patientswith endometriosis（EMs），and to investigate the effect of miR-451 on the proliferation and migration of the stromal cells cultured in vitro. M ethods：We recruited 54 cases of EMs and 59 healthy volunteers from January 2014 to May 2015 at People′s Hospital of Luohu District.Total RNA from plasma were extracted，and the expression of plasma miR-451 was analyzed with real-time qPCR.The proliferation viability of stromal cells was detected by CCK-8 assay，and migration by the wound-healing assay.Results：The level of plasma miR-451 in EMs patients was significantly lower than that in healthy volunteers［（0.53±0.14）vs.（1.00±0.20），t=14.50，P＜0.01］.Overexpression ofmiR-451 in the in vitro cultured stromal cells significantly inhibited the proliferation and migration of stromal cells［（1.00± 0.12）vs.（0.74±0.02），t=4.73，P=0.001］.Conclusions：The level of plasmamiR-451 is lowered in patients with EMs.miR-451 may participate in the pathophysiologicalmechanism of EMs by the inhibition of proliferation and migration of ectopic stromal cells.

【Keywords】Endometriosis；MicroRNAs；Endometrium；Polymerase chain reaction；miR-451 （JIntReprod Health/Fam Plan，2016，35：282-284）

子宮內膜異位癥（endometriosis，EMs）是一種常見的婦科疾病。該病是一種有侵襲行為的良性疾病，嚴重影響患者的生活質量，特別是對于育齡期婦女，該病可導致女性不孕癥，給患者造成嚴重的心理負擔［1-3］。然而，目前EMs尚缺少令人滿意的治療方法。因此，研究并發(fā)現新的治療靶點對EMs的個體化治療有重要意義。

微小RNA（microRNA，miRNA）是近年來研究較多的生物活性分子。越來越多的研究表明miRNA與EMs的發(fā)生發(fā)展密切相關［4-5］。miRNA可通過靶向作用于mRNA來調控相應蛋白的表達，其主要在細胞內發(fā)揮作用，也可透過細胞膜分泌到血漿中。因此，檢測血漿miRNA的表達即可反映細胞內調控狀態(tài)的變化。miR-451是一種EMs相關miRNA，其在多種疾病中表達發(fā)生顯著變化，如惡性腫瘤、炎癥等［6-7］。在EMs動物模型中，miR-451的表達下調［8］。然而，miR-451在EMs患者血漿中的變化尚不清楚。因此，本研究擬通過檢測EMs患者血漿中miR-451的表達，初步探討其作用機制，分析miR-451與EMs之間的相關性，為尋找EMs治療的新靶點提供實驗依據。

作者單位：518001廣東省深圳市羅湖區(qū)人民醫(yī)院婦科微創(chuàng)治療中心

通信作者：李寶艷，E-mail：szlby150@hotmail.com

1　材料與方法

1.1研究對象選取2014年1月—2015年5月于我院就診且病理學證實為EMs的患者（EMs組）54例（Ⅰ/Ⅱ期患者13例，Ⅲ/Ⅳ期患者41例），年齡（31.4±2.5）歲；另選取同期來我院體檢的健康志愿者（對照組）59例，年齡（28.5±3.8）歲。

1.2樣品收集與血漿m iRNA提取EMs患者血漿均取自月經分泌期，采用乙二胺四乙酸二鉀（EDTA-K2）抗凝管采集晨間血液，離心，分離血漿存于-80℃冰箱保存?zhèn)溆?。采用mirVanaTMPARISKit試劑盒（Thermo Fisher）按照使用說明提取血漿miRNA。加入線蟲Cel-miR-39作為內參。提取完畢后，檢測RNA濃度、稀釋至等濃度并進行后續(xù)實驗。

1.3實時熒光定量聚合酶鏈反應（real-time qPCR）檢測血漿m iR-451的表達采用TaqMan探針real-time qPCR法分別檢測各樣品中miR-451及Cel-miR-39的表達，以miR-451相對Cel-miR-39的表達作為各樣品miR-451的相對表達量。以對照組miR-451的相對表達量設為1，EMs組miR-451的表達以相對于對照組的變化倍數表示。

1.4異位子宮內膜基質細胞的分離及培養(yǎng)異位子宮內膜組織取自經病理證實為EMs的患者，經手術切除巧克力囊腫組織后修剪周圍正常組織并刮取異位內膜組織。并將組織剪碎經Ⅰ型膠原酶于37℃下消化，將懸液進行差速貼壁1 h，反復清洗并棄去未貼壁細胞。之后將貼壁細胞采用含有10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基（Thermo Fisher）繼續(xù)培養(yǎng)、傳代。

1.5CCK-8實驗將1.4中所述的EMs基質細胞消化，接種于96孔板中，待細胞貼壁后首先測定450 nm處0 h基準點吸光度值。之后采用Lipofectamine 3000（Thermo Fisher）分別將miR-451類似物及陰性對照（Scramble）通過脂質體法轉染EMs基質細胞，分別在轉染后12，24，48 h后檢測各組450 nm處吸光度值。以0 h基準點吸光度值設為1，以各組吸光度的相對值反映相對增殖活力，并繪制增殖曲線。

1.6損傷愈合實驗將細胞接種至6孔板，采用Lipofectamine 3000（Thermo Fisher）分別將miR-451類似物及陰性對照轉入EMs基質細胞中。待細胞生長至完全融合后，采用無菌Tip頭劃痕，并在18 h后拍照觀察各組細胞的遷移情況。

1.7統計學方法統計學分析采用SPSS 13.0軟件處理，定量資料用均數±標準差（±s）表示，組間均數比較采用t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1EM s患者血漿m iR-451表達下調EMs患者血漿miR-451下降至對照組的53%［（0.53±0.14）vs. （1.00±0.20），t=14.50，P＜0.01］。

2.2過表達m iR-451抑制EM s基質細胞增殖采用CCK-8實驗檢測轉染miR-451后24，48 h，EMs基質細胞的相對增殖活性較陰性對照組降低（均P＜0.01），見圖1。

圖1　過表達m iR-451后EM s基質細胞的相對增殖活性

2.3過表達m iR-451后抑制EM s基質細胞的遷移損傷愈合實驗顯示，過表達miR-451后EMs基質細胞的遷移入劃痕區(qū)的細胞數目明顯減少（見圖2A），過表達miR-451后EMs基質細胞的相對遷移活性較陰性對照組降低［（1.00±0.12）vs.（0.74±0.02），t=4.73，P=0.001］，見圖2B。

3討論

miRNA是細胞內有調控作用的非編碼小分子RNA。近來研究發(fā)現，miRNA參與多種疾病的進程，因此探討miRNA對疾病的調控作用對揭示疾病的發(fā)病機制、設計新的治療靶點有重要意義。EMs是一種常見的婦科疾病，但其發(fā)病原因未知，目前尚無特效的治療方法。本研究發(fā)現，miR-451在EMs患者血漿中降低，提示miR-451很可能在EMs中起重要的調控作用。

miRNA分子質量小，容易通透出細胞膜并釋放進入血中。因此，檢測血漿中miRNA的表達可反映出相應細胞中調控的變化。miR-451具有重要的生理功能，其表達變化與多種疾病有關，如腫瘤、炎癥等［6-7］。然而，miR-451與EMs的關系至今尚存有爭議。在人類和其他靈長類動物中，EMs可導致miR-451的下調，同時伴有靶基因YWHAZ的上調［6］。而在小鼠EMs模型中，miR-451表達缺失小鼠比野生型小鼠EMs病灶更少，提示miR-451很可能是加重EMs的因素［9］。在子宮內膜上皮細胞中過表達miR-451通過抑制遷移抑制因子（migration inhibitory factor，MIF）表達抑制上皮細胞的生存［10］。miR-451與細胞遷移、增殖等生物學過程有密切關系。以往研究表明，體外水平過表達miR-451可顯著抑制胃癌細胞遷移［11］。本研究也發(fā)現，miR-451過表達可減弱EMs基質細胞的增殖和遷移活性。因此，上述結果共同提示，miR-451在不同種屬的動物模型中可能發(fā)揮不同的作用，且miR-451在子宮內膜上皮細胞和基質細胞中所起的調控作用不同。

miR-451的靶點較多，目前已被證實的與EMs相關的靶基因包括YWHAZ、MIF和纖維蛋白原α （fibrinogenα，FGA）異構體2［6，12-13］。但是這些靶基因如何進一步調控EMs的進展尚需進一步研究。本研究發(fā)現，miR-451在EMs患者血漿中下調，并可通過抑制EMs基質細胞的增殖和遷移參與EMs的調控。綜上，miR-451是重要的EMs相關miRNA，然而miR-451在EMs中的具體調控機制仍需進一步研究證實。

［1］Benagiano G，Brosens I，Lippi D.The history of endometriosis［J］. GynecolObstet Invest，2014，78（1）：1-9.

［2］Hughes CL，FosterWG，Agarwal SK.The Impact of Endometriosis across the Lifespan of Women:Foreseeable Research and Therapeutic Prospects［J］.Biomed Res Int，2015，2015：158490.

［3］Bulun SE，Monsivais D，Kakinuma T，et al.Molecular biology of endometriosis:from aromatase to genomic abnormalities［J］.Semin Reprod Med，2015，33（3）：220-224.

［4］Fassbender A，Burney RO，O DF，et al.Update on Biomarkers for the Detection of Endometriosis［J］.Biomed Res Int，2015，2015：130854.

［5］Marí-Alexandre J，Sánchez-Izquierdo D，Gilabert-Estellés J，etal. miRNAs Regulation and Its Role as Biomarkers in Endometriosis ［J］.Int JMolSci，2016，17（1）：pii：E93.

［6］Li Y，Wang J，Dai X，et al.miR-451 regulates FoxO3 nuclear accumulation through Ywhaz in human colorectal cancer［J］.Am J TranslRes，2015，7（12）：2775-2785.

［7］Wang ZC，Lu H，Zhou Q，et al.MiR-451 inhibits synovial fibroblasts proliferation and inflammatory cytokines secretion in rheumatoid arthritis through mediating p38MAPK signaling pathway［J］.Int JClin Exp Pathol，2015，8（11）：14562-14567.

［8］Joshi NR，Su RW，Chandramouli GV，et al.Altered expression of microRNA-451 in eutopic endometrium of baboons（Papio anubis）with endometriosis［J］.Hum Reprod，2015，30（12）：2881-2891.

［9］Nothnick WB，Graham A，Holbert J，et al.miR-451 deficiency is associated with altered endometrial fibrinogen alpha chain expression and reduced endometriotic implant establishment in an experimentalmousemodel［J］.PLoSOne，2014，9（6）：e100336.

［10］Graham A，Falcone T，NothnickWB.Theexpression ofmicroRNA-451 in human endometriotic lesions is inversely related to that of macrophage migration inhibitory factor（MIF）and regulates MIF expression and modulation of epithelial cell survival［J］.Hum Reprod，2015，30（3）：642-652.

［11］榮忠厚，蘇忠學，耿文茂，等.微小RNA-451a體外抑制胃癌細胞的遷移及侵襲研究［J］.中華實驗外科雜志，2015，32（12）：3042-3045.

［12］Gargett CE，Ye L.Endometrial reconstruction from stem cells［J］. FertilSteril，2012，98（1）：11-20.

［13］Padykula HA.Regeneration in the primate uterus:the role of stem cells［J］.Ann NY Acad Sci，1991，622：47-56.

［本文編輯王琳］

The Relationship between Plasma m iR-451 and Endometriosis

SHI Jin-qiu，LU Jian-xiang，LI Bao-yan.The Minimally Invasive Center，Department of Gynecology，The People′s Hospital of Luohu District，Shenzhen 518001，China

LIBao-yan，E-mail：szlby150@hotmail.com

（2016-04-14）