于延珍，張　麗,2，曹　為，鄭　立,3，孫承君,3，蔣鳳華*

(1. 國家海洋局 第一海洋研究所海洋生態(tài)研究中心，山東 青島 266061；2. 山東省科學院海洋儀器儀表研究所，山東 青島 266001；3. 青島海洋科學與技術國家實驗室 海洋生態(tài)與環(huán)境科學功能實驗室，山東 青島 266237)

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四溴雙酚A(TBBPA)對叉鞭金藻的毒性效應研究*

于延珍1，張麗1,2，曹為1，鄭立1,3，孫承君1,3，蔣鳳華1*

(1. 國家海洋局 第一海洋研究所海洋生態(tài)研究中心，山東 青島 266061；2. 山東省科學院海洋儀器儀表研究所，山東 青島 266001；3. 青島海洋科學與技術國家實驗室 海洋生態(tài)與環(huán)境科學功能實驗室，山東 青島 266237)

以叉鞭金藻(Dicrateriainornata)為研究對象，分析了不同質量濃度四溴雙酚A(TBBPA)污染下微藻光合色素含量、可溶性蛋白含量、超氧化物歧化酶(SOD)活性和丙二醛(MDA)含量，以及細胞形態(tài)和細胞內部結構的變化。研究結果顯示：在TBBPA較低質量濃度(0.5和2.0 mg/L)污染條件下，叉鞭金藻的葉綠素a(Chl-a)、葉綠素c(Chl-c)和類胡蘿卜素(Car)含量顯著高于對照組，其含量第24小時達最大值；較高質量濃度(4.0和8.0 mg/L)污染條件下，3種色素含量則顯著低于對照組，其含量在第24小時達最小值。實驗期間各實驗組叉鞭金藻的可溶性蛋白含量、SOD活性和MDA含量主要被誘導；4.0 mg/L的TBBPA作用叉鞭金藻96 h后，藻細胞表面形態(tài)和內部亞顯微結構均發(fā)生變化，與光合色素含量降低、MDA含量增加相一致。

叉鞭金藻；四溴雙酚A；光合色素；可溶性蛋白；SOD；MDA

四溴雙酚A(Tetrabromobisphenol A，TBBPA)是目前市場上全球產量最大的含溴阻燃劑之一，通常被用作環(huán)氧樹脂、不飽和聚氧脂、紡織品和泡沫等材料的阻燃劑。據(jù)報道，我國每年制造含有TBBPA的產品高達7 500 t[1]。溴化阻燃劑可以通過滲出或者揮發(fā)等方式進入到環(huán)境中，能夠吸附到沉積物和土壤的表面，很容易通過地表徑流和大氣濕沉降等方式進入河口和海洋，成為土壤和水環(huán)境污染關注的焦點[2]?？諝?、沉積物、海洋生物體內以及水中等均已發(fā)現(xiàn)TBBPA的存在[3-6]。TBBPA所具有的親脂性、難降解性和高富集性等特點，進入海洋后會通過生物富集和放大作用影響海洋生物體的正常生理活動。近年來有關TBBPA的毒理學研究報道主要集中在對水生動物的毒性研究方面，結果表明TBBPA具有甲狀腺干擾效應[7-9]，可以抑制斑馬魚胚胎的發(fā)育并降低幼年斑馬魚的存活率[10]。

微藻作為初級生產者參與海洋食物鏈和食物網(wǎng)的構建，其種類多樣性和生物量影響著海洋生態(tài)系統(tǒng)結構的穩(wěn)定性及功能[11]。微藻具有污染毒物敏感、繁殖快和對毒性物質敏感等特點，將其用于污染物毒性研究可在較短時間內得到污染物對其種群及世代的影響，因而常被選為毒性測試生物[12]。本文以常見餌料藻叉鞭金藻(Dicrateriainornata)為實驗生物進行TBBPA污染脅迫實驗，分析光合色素含量、可溶性蛋白含量、超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase，SOD)活性及丙二醛(Malondialdehyde，MDA)含量在96 h之內的變化情況，結合細胞形態(tài)和細胞器的變化，探討TBBPA對叉鞭金藻的毒性效應，從而為TBBPA的海洋生態(tài)毒性評價和污染效應研究等提供基礎資料。

1　材料與方法

1.1實驗微藻的培養(yǎng)

試驗用叉鞭金藻(Dicrateriainornata)由國家海洋局第一海洋研究所提供。海水取自青島石老人附近近岸海域，經(jīng)0.45 μm濾膜過濾后煮沸消毒，冷卻后配制f/2培養(yǎng)液用于微藻培養(yǎng)實驗。以白色日光燈作為光源，光暗比為12 h∶12 h，光強約為4 500 lx，培養(yǎng)溫度為(20±0.2) ℃。先用1∶5的HCl浸泡處理培養(yǎng)實驗的三角瓶，然后超純水洗凈，最后蒸汽(121 ℃，15 min)滅菌。培養(yǎng)期間每天定時人工搖動三角瓶3次，并隨機調換位置以盡可能使光照均勻。

1.2TBBPA脅迫實驗

根據(jù)前期實驗結果，TBBPA對叉鞭金藻的96 h NOEC(96 h無可觀測效應濃度)是1.0 mg/L，96 h-EC50(96 h半最大效應濃度)是5.71 mg/L[13]，在本實驗中設置的TBBPA質量濃度分別為對照，0.5，2.0，4.0和8.0 mg/L。以二甲基亞砜(DMSO)為助溶劑配制TBBPA母液，以f/2培養(yǎng)液稀釋至實驗濃度。對照組為含有0.2%(V/V)DMSO的培養(yǎng)液(該濃度下DMSO對于叉鞭金藻的生長無顯著效應)。

在第0，12，24，48，72和96小時時取樣，第0小時取6個平行，其余時間每個質量濃度取3個平行，因而將處于指數(shù)生長期的叉鞭金藻分別接種于81個250 mL三角瓶中。初始細胞密度為1×105～2×105個/mL，加入f/2培養(yǎng)液定容至150 mL。樣品處理時，其中1 mL藻液加入魯格試劑固定，顯微鏡計數(shù)法測定藻細胞密度；10 mL藻液離心(6 000 r/min，10 min)收集藻細胞，-80 ℃保存，用于測定光合色素含量；其余樣品離心(6 000 r/min，10 min)收集藻細胞，-80 ℃保存，用于測定可溶性蛋白含量、SOD活性和MDA含量。

將處于指數(shù)生長期的叉鞭金藻同時接種于4個1 L三角瓶中，定容至800 mL，在同樣條件下培養(yǎng)96 h后，離心(3 000 r/min，5 min)收集藻細胞，進行細胞形態(tài)和亞顯微結構觀測。

1.3光合色素含量的測定

測定光合色素的藻細胞加入5 mL 90%丙酮溶液，振蕩混勻，置于黑暗低溫處(4 ℃)24 h，然后離心(6 000 r/min，10 min)，以90%丙酮溶液作為參比，測定上清液在440，630，644，662，664和750 nm波長處的吸光值，計算葉綠素a(Chl-a)、葉綠素c(Chl-c)和類胡蘿卜素(Car)的濃度[14]，并換算為單位細胞密度下的濃度。

1.4粗酶液的制備及酶活性的測定

將藻細胞懸浮于預冷的2 mL磷酸鹽緩沖液中，冰浴下超聲波破碎5 min (工作3 s，間歇5 s)，離心(4 ℃，6 000 r/min，10 min)，上清液即為粗酶液，-80 ℃保存。

以牛血清蛋白為標準，采用考馬斯亮藍G-250法測量可溶性蛋白含量。SOD活性和MDA含量分別采用SOD試劑盒(A001-1)和MDA試劑盒(A003-1) (南京建成生物工程研究所)進行測量，其操作過程嚴格按照說明進行，最后將結果換算為單位細胞密度下的活性或含量。

1.5細胞形態(tài)和亞顯微結構觀察

藻細胞用2%戊二醛(pH=7.2磷酸緩沖液配制)前固定，1% 鋨酸(pH=7.2磷酸緩沖液配制)后固定，磷酸緩沖液清洗后，一部分細胞用梯度酒精脫水、臨界點干燥后，通過導電膠帶粘于樣品臺上，噴金后置于掃描電鏡下觀察細胞形態(tài)；另一部分藻細胞用梯度丙酮脫水，環(huán)氧丙烷置換，環(huán)氧樹脂包埋，切片后，用透射電鏡觀察細胞亞顯微結構，所有的前處理及電鏡觀察工作在中國科學院生物能源與過程研究所電鏡室完成。

1.6數(shù)據(jù)分析

本研究實驗結果以平均值±標準偏差(Mean±SD)表示，用Origin 8.5軟件繪圖。采用SPSS 18.0軟件，以單因素方差分析(One-way ANOVA)方法對對照組和實驗組的數(shù)據(jù)進行差異性顯著分析，0.01

2　結果與分析

2.1不同質量濃度的TBBPA對叉鞭金藻光合色素含量的影響

由圖1可見，0.5和2.0 mg/L質量濃度組中3種色素含量隨時間延長呈先升高后降低的趨勢，而4.0和8.0 mg/L質量濃度組中3種色素含量隨時間延長先降低后升高，均在第24小時時達最大值或最小值。與對照組相比較，0.5 mg/L質量濃度組Chl-a和Chl-c在24～72 h被顯著誘導(p<0.01)，2.0 mg/L質量濃度組Chl-a和Chl-c在實驗期間均被顯著誘導(p<0.01或p<0.05)，2個質量濃度組Car在24～96 h被顯著誘導(p<0.01或p<0.05)；4.0 mg/L質量濃度組中Chl-a和Car含量在24～72 h被顯著抑制(p<0.01或p<0.05)，Chl-c含量則只在第24小時被顯著抑制(p<0.05)；8.0 mg/L質量濃度組中Chl-a和Car含量在實驗期間則一直顯著低于對照組，Chl-c含量在第24小時和第48小時被顯著抑制(p<0.01或p<0.05)。

圖1　不同質量濃度TBBPA作用下，不同時間段叉鞭金藻Chl-a,Chl-c,Car含量隨時間的變化Fig.1　Contents of Chl-a,Chl-c,Car in Dicrateria inornata under different concentrations of TBBPA

2.2不同質量濃度TBBPA對叉鞭金藻可溶性蛋白含量、SOD活性和MDA含量的影響

由圖2可見，各實驗組叉鞭金藻的可溶性蛋白含量隨時間呈現(xiàn)升高-降低-升高的趨勢，第12小時達最大值，第48小時或第72小時達最小值。除了0.5 mg/L質量濃度組在第12小時和4 mg/L質量濃度組在第96小時，蛋白含量與對照組無顯著差異，其余時間實驗組蛋白含量均被顯著誘導(p<0.05或p<0.01)。

圖2　在不同質量濃度TBBPA作用下，不同時間段的叉鞭金藻可溶性蛋白含量、SOD活性和MDA含量變化Fig.2　Soluble protein contents, SOD activities and MDA contents in Dicrateria inornata under the different concentrations of TBBPA

由圖2b可見，各實驗組SOD活性隨時間延長呈先升高后降低的趨勢，在第12小時達最大值。0.5 mg/L質量濃度組SOD活性在第96小時顯著高于對照組(p<0.05)；除了2.0 mg/L質量濃度組在第48小時和4.0 mg/L質量濃度組在第96小時時SOD活性與對照組無顯著差異，其余時間在較高質量濃度(>2.0 mg/L)TBBPA作用下，叉鞭金藻SOD活性均顯著高于對照組(p<0.05或者p<0.01)。

TBBPA作用下叉鞭金藻MDA含量隨時間變化趨勢與可溶性蛋白含量相同，同樣呈升高-降低-升高的變化趨勢，第12小時達最大值，第48小時達最小值。0.5 mg/L質量濃度組MDA含量在第24小時顯著高于對照組(p<0.01)；除了第72小時，2.0 mg/L質量濃度組MDA含量其余時間顯著高于對照組(p<0.05)；4.0 mg/L時質量濃度組MDA含量在第24小時和第96小時顯著高于對照組(p<0.01)，而第48小時MDA含量顯著低于對照組(p<0.05)；8.0 mg/L質量濃度組MDA含量在24～96 h期間一直顯著高于對照組(p<0.01)。各實驗組MDA含量達最小值后，隨時間增加而增加，呈現(xiàn)時間-效應關系。96 h內叉鞭金藻MDA含量隨TBBPA濃度增加而線性增加(n=15，r=0.96，p<0.000 1)，表現(xiàn)為劑量-效應關系。

對TBBPA脅迫后叉鞭金藻的3個參數(shù)進行相關性分析。結果表明，在第12小時和第72小時，可溶性蛋白含量和SOD活性呈線性正相關性(r=0.95和0.88，n=15，p<0.05)，而SOD和MDA在第96小時時呈正相關(r=0.979，n=15，p<0.051)。

2.3不同質量濃度TBBPA對叉鞭金藻細胞形態(tài)和亞顯微結構的影響

由圖3可見，對照組的細胞普遍較規(guī)整，而實驗組叉鞭金藻細胞表面出現(xiàn)分泌物，隨TBBPA質量濃度增加表層分泌物增多，且細胞表面呈現(xiàn)出一些小的空洞，表面變形，顯得松散，可能是TBBPA污染引起了細胞內部結構的改變，從而影響到細胞形態(tài)的變化。

圖3　處理96 h后不同質量濃度TBBPA對叉鞭金藻細胞形態(tài)的影響Fig.3　The effect of different concentrations of TBBPA on the cellular morphology of Dicrateria inornata after 96 h

圖4為對照組以及0.5和4.0 mg/L TBBPA處理96 h后叉鞭金藻的透射電鏡照片。由圖4可見，對照組叉鞭金藻細胞呈球形，各細胞器較清晰均勻分布在基質中，葉綠體較大，類囊體片層清晰、排列整齊；經(jīng)TBBPA處理后，細胞基質變渾濁，葉綠體皺縮，類囊體排列散亂，基粒片層稀疏，分布不均，突起緊貼細胞外膜，與掃描電鏡下所見的突起囊泡相對應。

圖4　處理96 h后不同質量濃度TBBPA對叉鞭金藻亞顯微結構的影響Fig.4　The effect of different concentrations of TBBPA on the ultrastructure of Dicrateria inornata after 96 h

3　討　論

光合色素在光合作用中參與吸收、傳遞光能，其含量變化能反映植物生長發(fā)育正常情況。本實驗結果顯示，當TBBPA的質量濃度低于2.0 mg/L時，叉鞭金藻的3種光合色素含量顯著高于對照組；質量濃度高于2.0 mg/L時，叉鞭金藻的光合色素含量則顯著低于對照組。相關研究表明小球藻在除草劑(100 μg/L阿特拉津或10 mg/L草銨膦)的作用下，Chl-a和總葉綠素的含量顯著低于對照組[15]。這可能是細胞在不利的環(huán)境下，能夠增加光合作用相關的基因表達合成光合色素，吸收光能、將CO2轉化為碳水化合物，為細胞新陳代謝提供物質基礎；而當環(huán)境脅迫超過細胞的耐受限度，抑制光合作用相關的基因表達，表現(xiàn)為光合色素含量下降[15]。本文透射電鏡觀察顯示，較高質量濃度TBBPA作用96 h后，細胞內部葉綠體皺縮，與葉綠素含量降低相一致。

可溶性蛋白是反映細胞生理狀態(tài)的重要指標，其含量增加是脅迫環(huán)境下細胞滲透調節(jié)的重要手段，有助于維持藻細胞的新陳代謝，提高微藻的耐受性[16]。小球藻在吲哚乙酸、聚丙烯酸的刺激下，以及三角褐指藻在2-甲基乙酰乙酸乙酯(EMA)作用下蛋白含量均顯著增加[17-18]。本文研究結果顯示叉鞭金藻可溶性蛋白含量隨著TBBPA質量濃度增加而增加，與文獻結果相一致[16-18]。

SOD是生物體內重要的抗氧化酶，是清除自由基的首要物質，防止氧自由基對細胞造成的損害并修復受損細胞[19]。Yang等[18]研究表明，7 mmol/L 2-甲基乙酰乙酸乙酯作用3 d后三角褐指藻的SOD活性顯著增加；銅綠微囊藻在低濃度(0.005%)小檗堿的作用下SOD活性顯著增加，而在高濃度(0.010%,0.020%和0.030%)時SOD活性顯著降低，且在第24小時到達最大值，隨后含量開始下降[20]。本研究結果顯示，在TBBPA作用下叉鞭金藻的SOD活性在第12小時達最大值后降低,實驗期間主要表現(xiàn)為被誘導,表明微藻細胞能夠調節(jié)自身的抗氧化防御系統(tǒng)來抵御外界環(huán)境脅迫,是環(huán)境適應性增強的表現(xiàn)。

MDA是由膜脂質過氧化后形成的產物，通過分析其含量變化可以衡量機體膜脂質過氧化程度,從而間接測定膜系統(tǒng)受氧化損傷程度[21]。Sabatini等[22]將柵列藻和小球藻暴露在含銅離子(62～414 μmol/L)的培養(yǎng)液中一周，結果顯示，兩種藻的MDA含量隨銅離子濃度增加而增加。本研究結果顯示，不同質量濃度TBBPA作用下，叉鞭金藻的MDA含量達最小值后，隨時間增加而增加，并且第96小時時MDA含量隨TBBPA質量濃度升高而線性增加，可能是藻細胞剛受到污染脅迫時抗氧化系統(tǒng)不足以清除所產生的活性氧,表現(xiàn)為MDA含量增加；在抗氧化系統(tǒng)達最大清除活性氧時，MDA含量最低；然后隨TBBPA脅迫時間延長，脂質過氧化速率大于活性氧清除速率，過氧化產物逐漸積累，MDA含量表現(xiàn)為升高的趨勢，這與掃描電鏡觀察到的高質量濃度TBBPA作用下細胞外部有分泌物，細胞表面變形并且出現(xiàn)一些小的空洞相一致。

TBBPA脅迫下叉鞭金藻的可溶性蛋白含量和SOD活性之間存在正相關性，表明微藻細胞可以通過調節(jié)可溶性蛋白和SOD酶共同作用來對抗外界不利因素的變化；隨著污染時間延長或者質量濃度增加，細胞過氧化產物MDA逐漸累積，細胞形態(tài)和亞顯微結構也受到損傷，抑制細胞分裂增殖，進而影響到藻的生長。

綜上所述，在TBBPA污染下，叉鞭金藻的生理生化指標以及細胞形態(tài)和亞顯微結構等均受到影響，表明污染物脅迫下對細胞的完整性及內部結構產生影響。本研究結果表明在微藻生長尚未受到明顯影響時，光合色素含量、可溶性蛋白、SOD活性和MDA含量等指標在較短時間內均表現(xiàn)出明顯變化。目前海水中的TBBPA質量濃度較低，因而尚不會對微藻產生顯著的毒性效應。但是，低質量濃度TBBPA對海洋微藻的長期慢性毒性效應有待于進一步深入研究。

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Toxic Effects of Tetrabromobisphenol A (TBBPA) onDicrateriainornata

YU Yan-zhen1, ZHANG Li1，2, CAO Wei1, ZHENG Li1,3, SUN Cheng-jun1,3, JIANG Feng-hua1

(1.MarineEcologyCenter,theFirstInstituteofOceanography,SOA,Qingdao 266061, China;2.InstituteofOceanographicInstrumentation,ShandongAcademyofSciences,Qingdao 266001, China;3.LaboratoryofMarineEcologyandEnvironmentalScience,QingdaoNationalLaboratoryforMarineScienceandTechnology, Qingdao 266237, China)

To study the toxic effect of Tetrabromobisphenol A (TBBPA) on marine microalgae,Dicrateriainornatawas exposed to five different concentrations (0, 0.5, 2.0, 4.0 and 8.0 mg/L) of TBBPA. The contents of photosynthetic pigments, soluble protein, and Malondialdehyde (MDA), and activities of Superoxide Dismutase (SOD) were monitored within 96 hours. In addition, the cellular morphology and substructure were observed after exposure 96 h. The results showed that three pigments (chlorophyllaandc, and carotene) in lower-concentration groups (0.5 and 2.0 mg/L) were obriously higher than those of the control, and their contents reached highest values at 24 h. While they were remarkably lower than those of the control in higher-concentration groups (4.0 and 8.0 mg/L), and their contents showed lowest values at 24 h. Significant induction was observed in most cases in all the test groups for soluble protein content, SOD activity, and MDA content. MDA content increased with increasing of TBBPA concentration at 96 h. The changes of cellular morphology and substructure were observed after exposure of high concentration TBBPA (4.0 mg/L), which was consistent with the decrease of photosynthetic pigments contents and the increase of MDA contents.

Dicrateriainornata; TBBPA; photosynthetic pigment; soluble protein; SOD; MDA

January 6,2016

2016-01-06

海洋公益性行業(yè)科研專項——新型持久性有機污染物監(jiān)測與風險評估體系研究示范(201105013)；中央級公益性科研院所基本科研業(yè)務費專項資金——以植物為載體的石油降解固定化菌劑的研制及其應用(2015T05)；泰山學者海外創(chuàng)新人才項目

于延珍(1990-)，男，山東招遠人，碩士研究生，主要從事海洋生物學方面研究.E-mail:yuyanzhen19901113@163.com

蔣鳳華(1977-)，女，山東夏津人，副研究員，博士，主要從事海洋生態(tài)污染效應方面研究.E-mail:jiangfh@fio.org.cn

(王佳實編輯)

X171.5

A

1671-6647(2016)03-0421-09

10.3969/j.issn.1671-6647.2016.03.012