丁麗玉，張丹，許瑩，吳飛2d

(1.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬岳陽(yáng)中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院,a藥劑科，b內(nèi)分泌科，上?！?00437；2.上海中醫(yī)藥大學(xué),c中藥學(xué)院，d中藥現(xiàn)代制劑技術(shù)教育部工程研究中心，上?！?01203)

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正交試驗(yàn)法優(yōu)選芪貞降糖顆粒提取工藝

丁麗玉1a，張丹1b，許瑩2c，吳飛2c2d

(1.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬岳陽(yáng)中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院,a藥劑科，b內(nèi)分泌科，上海200437；2.上海中醫(yī)藥大學(xué),c中藥學(xué)院，d中藥現(xiàn)代制劑技術(shù)教育部工程研究中心，上海201203)

摘要：目的優(yōu)選芪貞降糖顆粒的提取工藝。方法采用HPLC法測(cè)定枸櫞酸、特女貞苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量；以3個(gè)成分轉(zhuǎn)移率和出膏率為指標(biāo)，通過L9(34 )正交試驗(yàn)考察加水量、提取時(shí)間、提取次數(shù)對(duì)提取工藝的影響，并設(shè)計(jì)了驗(yàn)證試驗(yàn)。結(jié)果最佳提取工藝條件為加10倍量水提取3次，每次1.5 h。結(jié)論優(yōu)選的提取工藝穩(wěn)定可行，提取率高。

關(guān)鍵詞：正交試驗(yàn)；黃芪；女貞子；中藥工藝改進(jìn)

芪貞降糖方是上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬岳陽(yáng)中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院內(nèi)分泌科用于治療Ⅱ型糖尿病或糖調(diào)節(jié)異常的協(xié)定方，由烏梅、靈芝、黃芪和女貞子4味中藥組成，其中烏梅為君，靈芝為臣，黃芪和女貞子為佐使。配伍合理，組方精煉，臨床應(yīng)用10余年，在改善患者胰島素抵抗、調(diào)節(jié)糖代謝等方面療效顯著[1-6]。

沿襲臨床用法，本實(shí)驗(yàn)采用水提取工藝，對(duì)溶劑用量、提取時(shí)間、提取次數(shù)等因素進(jìn)行系統(tǒng)考察，以枸櫞酸、特女貞苷和毛蕊異黃酮葡萄糖苷[7]轉(zhuǎn)移率以及出膏率作為監(jiān)控指標(biāo)，采用正交試驗(yàn)法[8-9]對(duì)芪貞降糖顆粒的提取工藝進(jìn)行優(yōu)選并驗(yàn)證，得到最佳提取工藝參數(shù)，為處方的整個(gè)制劑工藝奠定基礎(chǔ)。

1　材料

1.1儀器1200型高效液相色譜儀(美國(guó)安捷倫公司)，Kromasil 100-5C18色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 μm)，F(xiàn)A2104N型電子天平(0.1 mg,上海精密科學(xué)儀器有限公司)，XP205型電子天平(0.01mg，梅特勒-托利多中國(guó)有限公司),DZF-6050型真空干燥箱(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)，TGL-18C型高速臺(tái)式離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)，HWS26型水浴鍋(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)。

1.2試藥枸櫞酸(批號(hào)100396-201302)，毛蕊異黃酮葡萄糖苷對(duì)照品(批號(hào)111920-201102)，特女貞苷對(duì)照品(批號(hào)111926-201404)：均購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所。

黃芪(批號(hào)141210，甘肅)，制烏梅(批號(hào)140913，浙江)，制女貞子(批號(hào)141125，湖南)，靈芝(批號(hào)141105，山東)：均購(gòu)自上海康橋藥業(yè)有限公司。

2　方法

2.1出膏率的測(cè)定取200 mL水煎液，減壓濃縮后轉(zhuǎn)移至已恒重的干燥蒸發(fā)皿中，水浴(105℃)蒸至近干，置真空烘箱80℃下減壓干燥至恒重，計(jì)算出膏率。

2.2枸櫞酸的含量測(cè)定

2.2.1色譜條件流動(dòng)相為0.1%磷酸溶液，流速1.0 mL·min-1，柱溫30℃，波長(zhǎng)210 nm，對(duì)照品進(jìn)樣10 μL，樣品進(jìn)樣5 μL。見圖1。

2.2.2對(duì)照品溶液的制備精密稱取枸櫞酸對(duì)照品適量，加甲醇制成濃度為0.5290 g·L-1的溶液。

2.2.3供試品溶液的制備按處方比例分別稱取烏梅、靈芝、黃芪和女貞子，以水煎煮提取，提取液高速離心5 min后，取上清液進(jìn)行HPLC測(cè)定。同法制備缺烏梅的陰性樣品。

2.2.4精密度試驗(yàn)精密吸取枸櫞酸對(duì)照品溶液10 μL，重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積。峰面積RSD為0.2%，說明進(jìn)樣精密度良好。

2.2.5線性關(guān)系考察分別精密吸取枸櫞酸對(duì)照品溶液0.5，1，2，5，10，20和50 μL，進(jìn)行HPLC分析，以進(jìn)樣質(zhì)量對(duì)峰面積進(jìn)行線性回歸，得回歸方程Y=65.222 4X+2.021 4(r=1.000 0)，表明枸櫞酸進(jìn)樣質(zhì)量在0.26～26.45 μg范圍內(nèi)與峰面積呈良好線性關(guān)系。

2.3特女貞苷的含量測(cè)定

2.3.1色譜條件流動(dòng)相為水∶甲醇(60∶40)，流速1.0 mL·min-1，柱溫30℃，波長(zhǎng)224 nm，對(duì)照品進(jìn)樣2.5 μL，樣品進(jìn)樣10 μL。見圖2。

2.3.2對(duì)照品溶液的制備精密稱取特女貞苷對(duì)照品適量，加甲醇制成濃度為0.2515 g·L-1的溶液。

2.3.3供試品溶液的制備按處方比例分別稱取烏梅、靈芝、黃芪和女貞子，以水煎煮提取，高速離心5 min后，取上清液進(jìn)行HPLC測(cè)定。同法制備缺女貞子的陰性樣品。

2.3.4精密度試驗(yàn)精密吸特女貞苷對(duì)照品溶液2.5 μL，重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積。峰面積RSD為0.2%，說明進(jìn)樣精密度良好。

2.3.5線性關(guān)系考察分別精密量取對(duì)照品溶液0.2，0.5，1，2，5和10 μL，進(jìn)行HPLC分析，以進(jìn)樣質(zhì)量對(duì)峰面積進(jìn)行線性回歸，得回歸方程Y=1164.9483X+29.2150(r=0.999 9)，表明特女貞苷進(jìn)樣質(zhì)量在0.05～2.52 μg 范圍內(nèi)與峰面積呈良好線性關(guān)系。

2.4毛蕊異黃酮葡萄糖苷的含量測(cè)定

2.4.1色譜條件[10]流動(dòng)相為乙腈(A)和0.2%甲酸溶液(B)梯度洗脫(0～13 min，13%～15% A；13～23 min，15%～20% A；23～30 min，20%～40% A；30～40 min，40%A)，流速1.0 mL·min-1，柱溫30℃，波長(zhǎng)260 nm，對(duì)照品1 μL，樣品30 μL。見圖3。

A：枸櫞酸對(duì)照品

B：供試品

C：缺烏梅陰性樣品

圖1芪貞降糖顆粒提取液中枸櫞酸測(cè)定的HPLC圖譜

A：特女貞苷對(duì)照品

B：供試品

C：缺女貞子陰性樣品

圖2芪貞降糖顆粒提取液中特女貞苷測(cè)定的HPLC圖譜

A：毛蕊異黃酮葡萄糖苷對(duì)照品

B：供試品

C：缺黃芪陰性樣品

圖3芪貞降糖顆粒提取液中毛蕊異黃酮葡萄糖苷測(cè)定的HPLC圖譜

2.4.2對(duì)照品溶液的制備精密稱取毛蕊異黃酮葡萄糖苷對(duì)照品適量，加甲醇制成濃度為56.75 mg·L-1的溶液。

2.4.3供試品溶液的制備按處方比例分別稱取烏梅、靈芝、黃芪和女貞子，以水煎煮提取，高速離心5 min后，取上清液進(jìn)行HPLC測(cè)定。同法制備缺黃芪的陰性樣品。

2.4.4精密度試驗(yàn)精密吸取枸櫞酸對(duì)照品溶液1 μL，重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積。峰面積RSD為2.8%，說明進(jìn)樣精密度良好。

2.4.5線性關(guān)系考察精密量取上述對(duì)照品溶液0.2，0.5，1，2和5 μL，進(jìn)行HPLC分析，以進(jìn)樣質(zhì)量對(duì)峰面積進(jìn)行線性回歸，得回歸方程Y=3.703 5X+1.958 2(r=1.000 0)，表明毛蕊異黃酮葡萄糖苷進(jìn)樣質(zhì)量在11.35～283.75 ng 范圍內(nèi)與峰面積呈良好線性關(guān)系。

2.5正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)分別稱取烏梅15 g、靈芝15 g、黃芪12 g和女貞子12 g，采用正交試驗(yàn)法優(yōu)選水提取工藝，以加水量、提取時(shí)間、提取次數(shù)為考察因素，每個(gè)因素設(shè)3個(gè)水平，以特女貞苷、枸櫞酸、毛蕊異黃酮葡萄糖苷轉(zhuǎn)移率和出膏率的綜合評(píng)分為考察指標(biāo)，每組平行處理2份。因素水平見表1。

表1　芪貞降糖顆粒的提取工藝正交試驗(yàn)因素水平表

3　結(jié)果

3.1正交試驗(yàn)正交試驗(yàn)結(jié)果見表2～5。

根據(jù)直觀分析結(jié)果，對(duì)4個(gè)指標(biāo)影響最大的因素是提取次數(shù)，其次為提取時(shí)間和加水倍量。枸櫞酸轉(zhuǎn)移率最佳的提取工藝為A3B3C3，毛蕊異黃酮葡萄糖苷轉(zhuǎn)移率最佳的提取工藝為A3B3C3，特女貞苷轉(zhuǎn)移率最佳的提取工藝為A3B3C2，出膏率最佳的提取工藝也是A3B3C3。

表3方差分析結(jié)果表明，提取次數(shù)對(duì)4個(gè)指標(biāo)均有顯著性影響，提取時(shí)間對(duì)毛蕊異黃酮葡萄糖苷的轉(zhuǎn)移率有顯著性影響，加水倍量對(duì)特女貞苷的轉(zhuǎn)移率有顯著性影響。

表2　正交試驗(yàn)工藝及結(jié)果

注： 4個(gè)因素(A、B、C和D)中1、2和3指的是各因素的3個(gè)水平。

表3　方差分析結(jié)果

表4　提取工藝正交試驗(yàn)綜合評(píng)分直觀分析表

表5　提取工藝正交試驗(yàn)綜合評(píng)分方差分析表

注：D為空白項(xiàng)，F(xiàn)0.05(2，2)=19.0。

綜合4組結(jié)果，最佳因素水平組合略存在分歧，為統(tǒng)一結(jié)果，以枸櫞酸、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、特女貞苷轉(zhuǎn)移率的綜合評(píng)分，對(duì)正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析。評(píng)分時(shí)以各指標(biāo)的最大值為參照將數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化處理，再根據(jù)各成分在處方中地位，烏梅是君藥，黃芪和女貞子處方中均屬佐使藥，3藥的用量接近，其活性成分的轉(zhuǎn)移情況對(duì)判斷工藝均具有重要的指導(dǎo)意義，故將枸櫞酸、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、特女貞苷的權(quán)重系數(shù)均設(shè)為0.3。綜合評(píng)分直觀及方差分析結(jié)果如下表4、5。

表4直觀分析結(jié)果表明，最佳因素水平組合為A3B3C3，對(duì)綜合指標(biāo)影響最大的因素是提取次數(shù)，其次為提取時(shí)間和加水倍量。

表5方差分析結(jié)果表明加水倍量無顯著性影響，提取次數(shù)和提取時(shí)間均差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。需要設(shè)計(jì)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)進(jìn)行最佳工藝的驗(yàn)證。

3.2驗(yàn)證試驗(yàn)對(duì)提取次數(shù)和提取時(shí)間進(jìn)行擴(kuò)大水平驗(yàn)證，同時(shí)對(duì)加水倍量進(jìn)行擴(kuò)展驗(yàn)證，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果見表6。

比較第1組和第4組，隨著提取次數(shù)增加1次，毛蕊異黃酮葡萄糖苷和特女貞苷的轉(zhuǎn)移率顯著增加，但是枸櫞酸卻有明顯下降，綜合動(dòng)力成本和工藝的可行性考慮，確定提取次數(shù)為3次。

表6　提取正交驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果表

比較第1、2和3組，隨著提取時(shí)間的繼續(xù)增加，3個(gè)指標(biāo)的轉(zhuǎn)移率未能大幅度增加，選定提取時(shí)間為1.5 h。

比較第1組和第5組，隨著提取溶劑體積的繼續(xù)增加，特女貞苷轉(zhuǎn)移率顯著增加，毛蕊異黃酮葡萄糖苷基本無變化，但是枸櫞酸有明顯下降，最后選定加水倍量為10倍。

根據(jù)正交試驗(yàn)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，確定芪貞降糖顆粒的最佳提取工藝為：加水10倍量，提取3次，每次1.5 h。

4　討論

根據(jù)新的中藥制劑質(zhì)量控制思路，需要選擇能夠特征性指示工藝可靠性的成分來監(jiān)控制劑過程中的工藝變化。本處方包含4味藥，本研究選擇其中3味重要的藥材中的水溶性良好的特征性成分結(jié)合出膏率作為正交試驗(yàn)考察的指標(biāo)，可以有效篩選出最佳的制劑工藝。

女貞子中的指標(biāo)性成分特女貞苷水溶性良好，但是提取效率不高，可能是因?yàn)榕懽铀幱貌课皇歉稍锏墓麑?shí)，質(zhì)地硬實(shí)，特女貞苷不易浸出。一些研究[11-13]在制劑時(shí)預(yù)先將女貞子雜碎或者粉碎過篩，可以有效提高提取效率。但是筆者認(rèn)為醫(yī)院制劑若與臨床用法保持一致，則首先需要保證處方成分的炮制或提取前處理方法一致，不能盲目為提高一些指標(biāo)性成分而直接更改飲片的處理工藝，除非進(jìn)行相應(yīng)的制劑臨床效果對(duì)比評(píng)價(jià)。

對(duì)于HPLC法測(cè)定毛蕊異黃酮葡萄糖苷的方法，文獻(xiàn)中已有一些報(bào)道[14-15]，主要分為等度洗脫、梯度洗脫，本文參考了李圓圓等[10]的分離條件。

之前的臨床研究中，也曾委托加工單位進(jìn)行制劑的加工，并以這些加工的顆粒進(jìn)行相關(guān)的臨床試驗(yàn)[3-6]，但是一直未有對(duì)處方比例進(jìn)行固定，也未曾系統(tǒng)考察過制劑工藝。本研究首次系統(tǒng)對(duì)提取工藝進(jìn)行考察，以正交試驗(yàn)優(yōu)化最佳提取參數(shù)并驗(yàn)證，為將芪貞降糖方開發(fā)成為標(biāo)準(zhǔn)的醫(yī)院制劑打下堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

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基金項(xiàng)目：上海市衛(wèi)計(jì)委中醫(yī)醫(yī)院中藥制劑能力提升項(xiàng)目(ZY3-JSFC-2-2017)

通信作者：吳飛，男，副研究員，研究方向：中藥制劑分析和藥物分析，E-mail:a1983d3891h@126.com

doi:10.3969/j.issn.1009-6469.2016.07.005

(收稿日期：2016-02-18，修回日期：2016-05-08)

Optimization of extraction process parameters for Qizhenjiangtang Granules by orthogonal test

DING Liyu1a,ZHANG Dan1b,XU Ying2,et al

(1a.DepartmentofPharmacy;1b.DepartmentofEndocrinology,YueyangHospitalofIntegrativeChineseandWesternMedicineAffiliatedtoShanghaiUniversityofTraditionalChineseMedicine,Shanghai200437,China;2.CollegeofChineseMaterialMedica,ShanghaiUniversityofTraditionalChineseMedicine,Shanghai201203,China)

Abstract:ObjectiveTo optimize the extraction process parameters of Qizhenjiangtang granules．MethodsHPLC was used to determine the contents of citric acid,specnuezhenide and calycosin-7-O-β-D-glycoside.With 3 component transfer ratios and solid contents as indexes,the parameters(amount of water,extraction time,times of extraction) on extraction technology were investigated by L9(34 ) orthogonal test．ResultsOptimal extraction technology conditions were as follows:extracted for 3 times with 10 folds the amount of water，1.5 h per time．ConclusionThe optimized extraction technology was stable and feasible with high extraction rate of the index components．

Key words:Orthogonal test；Astragalus membranaceus；Fructus ligustri lucidi；Technology improving(TCD)