畢曉軍，李健，范連慧，劉龍，何龍

(沈陽軍區(qū)總醫(yī)院泌尿外科，遼寧 沈陽　110016)

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表柔比星對膀胱癌細(xì)胞中miR-21表達(dá)的影響

畢曉軍，李健，范連慧，劉龍，何龍

(沈陽軍區(qū)總醫(yī)院泌尿外科，遼寧 沈陽110016)

摘要：目的表柔比星是膀胱灌注輔助治療膀胱癌的常用藥物，該研究主要通過研究表柔比星對膀胱癌細(xì)胞中miR-21表達(dá)的影響，從而探討表柔比星治療膀胱癌的作用機(jī)制。方法該研究通過向膀胱腫瘤細(xì)胞中加入不同濃度表柔比星培養(yǎng)細(xì)胞后，檢測細(xì)胞中miR-21表達(dá)量的變化情況。結(jié)果隨著表柔比星濃度的增加，膀胱癌細(xì)胞5637中的miR-21的表達(dá)水平下降。觀察組不同濃度與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，隨著表柔比星濃度的增加，人膀胱癌5637細(xì)胞中的miRNA-21的表達(dá)水平下降，即呈劑量依賴趨勢。結(jié)論表柔比星能夠抑制膀胱癌細(xì)胞中miR-21的表達(dá)，并呈濃度依賴趨勢。

關(guān)鍵詞：膀胱腫瘤;表柔比星;微RNAs

膀胱癌是指發(fā)生在膀胱黏膜上的惡性腫瘤。是泌尿系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，也是全身十大常見腫瘤之一。占我國泌尿生殖系腫瘤發(fā)病率的第1位，膀胱腫瘤具有較高的復(fù)發(fā)率和侵襲能力，多以浸潤方式生長。近年來隨著人口老齡化等膀胱癌的發(fā)病率和死亡率呈逐年上級趨勢[1]。MicroRNAs(miRNAs，微小RNA)是一類在病毒、植物和動物等生物體中廣泛存在的進(jìn)化上保守的內(nèi)源性非編碼蛋白質(zhì)小RNA。在RNA的降解以及蛋白抑制方面有著非常重要的作用，從而影響細(xì)胞的增值、分化和凋亡等過程[2]。已有研究表明miR-21在膀胱癌中存在過表達(dá)。目前非肌層浸潤性膀胱癌多以經(jīng)尿道膀胱腫瘤電切術(shù)術(shù)后輔助表柔比星灌注化療為主。本文通過研究表柔比星與microRNA的關(guān)系的基礎(chǔ)研究，希望在分子生物學(xué)水平找到一條新的預(yù)防膀胱癌復(fù)發(fā)的道路。

1　資料與方法

1.1材料5637細(xì)胞株購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所細(xì)胞庫，所有細(xì)胞采用貼壁細(xì)胞法培養(yǎng)、傳代及保留，取對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行試驗。表柔比星購于浙江海正藥業(yè)股份有限公司，PCR試劑盒及逆轉(zhuǎn)錄試劑盒均購于大連Takara公司。引物由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司設(shè)計并合成，simiR-21及si-negative control均由上海吉瑪制。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)培養(yǎng)于含10%小牛血清的RPMI-1640，在95 %濕度、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%、條件下培養(yǎng)。將5×105的5637細(xì)胞接種至6孔板中，用2 mL的培養(yǎng)液(含10%血清和抗生素)培養(yǎng)。24 h后，向各組細(xì)胞中加入表柔比星，用PBS作為對照。各組別的藥物終濃度分別為0.0、0.25、 0.5、1.0、2.0 mg·L-1培養(yǎng)48 h后，裂解細(xì)胞并分析其miR-21的表達(dá)。

1.3qRT-PCR檢測用TRIzol試劑提取5637細(xì)胞系總RNA，用miR-21檢測試劑盒檢測miR-21表達(dá)水平。 首先取10 ng總RNA與3 μL逆轉(zhuǎn)錄酶混合，在15 μL反應(yīng)體系中，16 ℃ 30 min，42℃ 30 min，85 ℃ 5 min，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。然后將逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA150倍稀釋，取2 μL稀釋的cDNA150與2 μL TaqMan引物混合，在20 μL反應(yīng)體系中，95℃變性10 min；95℃ 15 s，60 ℃ 60 s，40個循環(huán)。細(xì)胞中miRNA表達(dá)用U6 snRNA為內(nèi)對照，相對miRNA表達(dá)水平用2-ΔΔCt計算改變倍數(shù)，相對miRNA表達(dá)水平用2-ΔCt計算改變倍數(shù)。

1.4統(tǒng)計學(xué)方法所有實驗結(jié)果數(shù)據(jù)均采用SPSS 13.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1miRNA-21及內(nèi)參U6的基因表達(dá)譜目的基因(miRNA-21)的溶解擴(kuò)增曲線見(圖1)，溶解曲線見(圖2)；內(nèi)參基因(U6)的擴(kuò)增曲線見(圖3)，溶解曲線見(圖4)。

圖1　miR-21的擴(kuò)增曲線

圖2　miR-21的溶解曲線

圖3　U6擴(kuò)增曲線

圖4　U6溶解曲線

2.2加入不同濃度表柔比星后，5637細(xì)胞中miR-21的表達(dá)水平變化觀察組中表柔比星終濃度分別為0.0、0.25、0.5、1.0、2.0 mg·L-1，對照組用PBS溶液培養(yǎng)細(xì)胞，應(yīng)用RT-PCR法檢測上述標(biāo)本中miRNA-21的表達(dá)水平。隨著表柔比星濃度的增加，膀胱癌細(xì)胞5637中的miR-21的表達(dá)水平下降。觀察組不同濃度與對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(表1)。對所得結(jié)果作直線回歸的統(tǒng)計推斷，可建立回歸方程，對回歸方程作假設(shè)檢驗，F(xiàn)=24.924，作出統(tǒng)計推斷，得P<0.01，回歸方程差異有統(tǒng)計學(xué)意義，可確定表柔比星濃度與miR-21之間有直線回歸關(guān)系。即觀察組用不同濃度表柔比星培養(yǎng)，在一定濃度內(nèi)隨著表柔比星濃度的增加，人膀胱癌5637細(xì)胞中的miRNA-21的表達(dá)水平下降，即呈劑量依賴趨勢(圖5)。

表1　不同濃度表柔比星轉(zhuǎn)染后，各組細(xì)胞中 miR-21的表達(dá)水平

圖5　不同濃度表柔比星對膀胱癌HTB-9細(xì)胞 miRNA-21的表達(dá)水平

3　討論

miRNA是在存在于廣泛動植物體內(nèi)的一種非編碼小RNA，包含大約1 000個短小核苷酸片段和18～25個長核苷酸片段的非編碼RNA，在轉(zhuǎn)錄后控制水平與特定信使RNA轉(zhuǎn)錄物的互補(bǔ)序列結(jié)合來調(diào)控基因表達(dá)[3-4]?？烧{(diào)控人類基因的60%。一種miRNA可有多種靶點，許多種miRNA也可有一個共同靶點[5]。主要參與基因轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)控，通過與其目標(biāo)mRNA分子的非編碼區(qū)域互補(bǔ)匹配降解靶mRNA或抑制其翻譯。在被miRNA調(diào)控的基因中，大約有50%的基因與腫瘤相關(guān)基因區(qū)或脆弱基因區(qū)相關(guān)聯(lián)[6]。不同腫瘤組織中，miRNA呈現(xiàn)不同基因序列。Let-7家族的多種成員在多種腫瘤組織中呈抑制性表達(dá)。體內(nèi)、外模型試驗提示let-7可以使腫瘤維持現(xiàn)狀或抑制腫瘤生長。腫瘤幾乎對所有化療藥物都可以產(chǎn)生抵抗。研究表明，miRNA能調(diào)解腫瘤細(xì)胞的化療敏感性。Blower等[7]采用轉(zhuǎn)染miRNA和反義核酸抑制的方法，發(fā)現(xiàn)let-7i、miR-16、miR-21影響化療藥物的療效高達(dá)4倍。通過體外試驗研究藥物抵抗的機(jī)制，可以幫助我們提高臨床治療水平。

miRNA通過轉(zhuǎn)錄后調(diào)控機(jī)制廣泛參與了各種生命活動進(jìn)程。miRNA-21對腫瘤的致癌作用具有普遍性，在膀胱癌中也扮演重要角色，其主要定位于細(xì)胞核，呈高度表達(dá)，并在膀胱癌細(xì)胞分級機(jī)臨床分期中扮演重要角色。miRNA-21是最常見的表達(dá)上調(diào)miRNA，具有促進(jìn)細(xì)胞增殖，抑制細(xì)胞凋亡，進(jìn)而加速腫瘤生長轉(zhuǎn)移的作用。與膀胱癌密切相關(guān)的細(xì)胞凋亡因子4(PDCD4)和抑癌基因(PTEN)及TPM1，多項研究發(fā)現(xiàn)miRNA-21可對其進(jìn)行調(diào)控，從而證明miRNA-21與膀胱癌關(guān)系密切[8-10]。戰(zhàn)鵬等[11]通過免疫組織化學(xué)法發(fā)現(xiàn)miRNA-21在膀胱癌組織中的表達(dá)明顯高于膀胱正常組織，并隨著臨床分期和細(xì)胞分級增高，miRNA-21的陽性表達(dá)率逐漸升高，說明其表達(dá)與膀胱癌的惡性程度和嚴(yán)重性呈正相關(guān)，與年齡和性別無關(guān)。

本研究采用RT-PCR方法檢測了不同濃度表柔比星條件下膀胱癌5637細(xì)胞中miRNA-21的表達(dá)水平，研究結(jié)果顯示表柔比星能夠有效的降低膀胱癌細(xì)胞5637中的miR-21的表達(dá)，并且呈Dose dependent 趨勢。不但從再次證實了膀胱癌細(xì)胞中miRNA-21的表達(dá)高于正常組織，更從分子生物學(xué)水平證實了表柔比星在抑制膀胱癌復(fù)發(fā)方面的有效性。

膀胱癌術(shù)后早期復(fù)發(fā)或進(jìn)展是導(dǎo)致膀胱癌預(yù)后不佳的重要因素[12]。雖然目前已發(fā)現(xiàn)較多膀胱癌的復(fù)發(fā)原因，并通過聯(lián)合用藥等多種方法治療膀胱癌，雖可在一定程度上抑制膀胱癌的復(fù)發(fā)，但臨床效果欠佳。在臨床治療過程或治療結(jié)束后，膀胱癌往往復(fù)發(fā)。目前關(guān)于抗腫瘤的藥物機(jī)制多集中在抗腫瘤藥物對細(xì)胞周期的影響，并且對其機(jī)制的解釋往往不能使人信服。本實驗首次關(guān)注了抗腫瘤藥物對膀胱癌相關(guān)基因表達(dá)影響。根據(jù)本實驗研究結(jié)果分析，表柔比星能抑制miR-21的表達(dá)，并呈濃度依賴趨勢。因此，給將來研究新的抗腫瘤藥物提供了一種新的途徑，可以在分子生物學(xué)水平上驗證抗腫瘤藥物的有效性。

參考文獻(xiàn)

[1]Cheung G,Sahai A,Billia M,et al.Recent advances in the diagnosis and treatment of bladder cancer[J].BMC Med,2013,11:13.

[2] Chen PS,Su JL,Hung MC.Dysregulation of MicroRNAs in cancer[J].J Biomed Sci,2012,19(1):90.

[3]桂瑞豐,胡文輝.miRNA在肝癌患者血清中的表達(dá)及意義[J].安徽醫(yī)藥,2016,20(1):126-128.

[4]Jin B,Liu Y,Wang H.Antagonism of miRNA-21 sensitizes human gastric cancer cells to paclitaxel[J].Cell Biochem Biophys,2015,72(1):275-282.

[5]Friedman RC,Farh KK,Burge CB，et al.Most mammalian mRNAs are conserved targets of microRNAs[J].Genome Res,2009,19(1):92-105.

[6]Wu S,Huang S,Ding J,et al.Multiple microRNAs modulate p21Cip1/Waf1 expression by directly targeting its 3’ untranslated region[J].Oncogene,2010,29(15):2302-2308.

[7]Blower PE，Chung JH，Verducci JS，et al．MicroRNAs modulate the chemosensitivity of tumor cells[J].Mol Cancer Ther,2008,7(1)：1-9．

[8]Li T，Li D，Sha J，et al．MicroRNA-21 directly targets MARCKS and promotes apoptosis resistance and invasion in prostate cancer cells[J].Biochem Biophys Res Commun，2009,383(3):280.

[9]Huang GL，Zhang XH，Guo GL，et al．Clinical significance of miRNA-21 expression in breast cancer[J].Oncol Rep，2009,21(3):673.

[10] 鄢文,靳文,王昂,宋維舒,等.貝伐單抗聯(lián)合培美曲塞維持治療對晚期非鱗狀非小細(xì)胞肺癌患者循環(huán)microRNA-19以及白細(xì)胞介素-27表達(dá)的影響[J].安徽醫(yī)藥,2015,19(9):1786-1790.

[11] 戰(zhàn)鵬，張明.微小RNA-21在膀胱癌中的表達(dá)和臨場意義[J].中國老年學(xué)雜志，2012,22(32):4872-4873.

[12] Palou J，Algaba F，Vera I，et al．Protein expression patterns of ezrin are predictors of progression in T1 G3 bladder tumours treated with nonmaintenance bacillus Calmette-Guérin[J].Eur Urol,2009,56(5):829-836.

◇藥物分析◇

作者簡介：畢曉軍，男，碩士研究生

通信作者：何龍，男，副主任醫(yī)師，研究方向：膀胱腫瘤，E-mai：helongyh@vip.qq.com

doi:10.3969/j.issn.1009-6469.2016.07.012

(收稿日期：2016-01-04，修回日期：2016-04-11)

Effect of epirubicin on the expression of miR-21 in bladder cancer cells

BI Xiaojun，LI Jian，F(xiàn)AN Lianhui，et al

(DepartmentofUrologySurgery,GeneralHospitalofShenyangMilitaryRegion,Shenyang,Liaoning110016,China)

Abstract:ObjectiveEpirubicin is a commonly used drug for assisted bladder perfusion treatment of bladder cancer.This study is to explore the mechanism of epirubicin in the treatment of bladder cancer by studying the effect of epirubicin on the expression of miR-21 in bladder cancer cells.MethodsThe expressive levels of miR-21 were detected by adding different concentrations of epirubicin in cultured cells to bladder cancer cells.ResultsThe expression level of miR-21 in bladder cancer cell 5637 was decreased with the increase of epirubicin.The difference was statistically significant between the observed groups with different concentrations and the control group(P<0.05).With epirubicin concentration increased,the expression level of miRNA-21 in human bladder cancer 5637 cells decreased,i.e.in a dose dependent trend.ConclusionsEpirubicin can inhibit the expression of miR-21 in bladder cancer cells,which shows a dose-dependent trend.

Key words:Urinary Bladder Neoplasms;Epirubicin;MicroRNAs