徐衛(wèi)峰，費(fèi)逸明，何丹，尹恒,2

(1.南京中醫(yī)藥大學(xué)無(wú)錫附屬醫(yī)院藥物臨床試驗(yàn)機(jī)構(gòu)，江蘇 無(wú)錫　214071；2.南京中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，江蘇 南京　210023)

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液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定大鼠血漿中千層紙素的濃度

徐衛(wèi)峰1，費(fèi)逸明1，何丹1，尹恒1,2

(1.南京中醫(yī)藥大學(xué)無(wú)錫附屬醫(yī)院藥物臨床試驗(yàn)機(jī)構(gòu)，江蘇 無(wú)錫214071；2.南京中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，江蘇 南京210023)

摘要：目的建立快速且靈敏的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)測(cè)定大鼠血漿中千層紙素的濃度。方法色譜分離采用C18色譜柱，甲醇-10 mmol·L-1醋酸銨(77∶23,V/V)為流動(dòng)相，流速1.05 mL·min-1。大鼠血漿加入β-葡萄糖醛酸酶/硫酸酯酶，37℃孵化過(guò)夜，再加入內(nèi)標(biāo)染料木素及0.1%磷酸溶液，用乙酸乙酯提取，上清液40 ℃水浴中氮?dú)饬鞔蹈?，以流?dòng)相200 μL溶解殘?jiān)M(jìn)行分析。檢測(cè)器采用四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀，離子源采用電噴霧電離離子源(ESI)，檢測(cè)方式采用選擇反應(yīng)檢測(cè)掃描(SRM)，檢測(cè)離子：千層紙素[M+H]+ 284.9→269.9，內(nèi)標(biāo)[M+H]+ 270.9→270.9。結(jié)果千層紙素在5～1 000 μg·L-1范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好，回收率大于85%，日內(nèi)和日間的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)小于15%。結(jié)論建立的LC-MS/MS法符合生物樣品分析的要求，可用于研究大鼠灌胃千層紙素后血漿中千層紙素的測(cè)定。

關(guān)鍵詞：黃芩；串聯(lián)質(zhì)譜法；千層紙素A；大鼠,Sprague-Dawley

黃芩(拉丁學(xué)名：ScutellariabaicalensisGeorgi)，別名山茶根、土金茶根，是唇形科黃芩屬多年生草本植物，根入藥，味苦、性寒，有清熱燥濕、瀉火解毒、止血等功效,主治溫?zé)岵?、上呼吸道感染、肺熱咳嗽、濕熱黃膽、肺炎、癰腫癤瘡等癥。黃芩中的主要黃酮類化合物有黃芩苷(baicalin)、黃芩苷元(baicalein)、漢黃芩素(wogonin)、漢黃芩苷(wogonoside)、千層紙素(oroxylin A)等[1-2]。研究表明,上述黃酮類化合物有較強(qiáng)的藥理活性[3-6]，其中千層紙素具有廣泛的生物活性，兼有抗炎、抗休克、抗腫瘤以及保護(hù)心腦血管等功效，是目前國(guó)內(nèi)外研究的一個(gè)熱點(diǎn)[4-11]。

由于在體內(nèi)大多數(shù)黃酮類化合物以葡萄糖醛酸結(jié)合物的形式存在，要滿足一定的靈敏度來(lái)檢測(cè)其游離原型藥物濃度存在諸多困難。有報(bào)道，通過(guò)酶水解的方式來(lái)測(cè)定原形藥物和結(jié)合藥物的總濃度，是可行的[12]。關(guān)于藥物中千層紙素的含量測(cè)定方法較為成熟，但其血藥濃度的測(cè)定有文獻(xiàn)報(bào)道采用超高效液相色譜-二極管陣列法(UPLC-DAD)[13-14]，運(yùn)用LC-MS/MS法卻鮮有報(bào)道。本文利用LC-MS/MS法，快速而靈敏地測(cè)定了灌胃給藥后大鼠血漿中千層紙素的血藥濃度,并有利于進(jìn)一步的藥代動(dòng)力學(xué)研究[15]。

1　材料

1.1藥品與試劑千層紙素對(duì)照品(上海源葉生物科技有限公司，純度>99.0%，批號(hào)：20140512)，染料木素作為內(nèi)標(biāo)(上海同田生物有限公司，純度>99.0%，批號(hào)：20140311)，β-葡萄糖醛酸酶/硫酸酯酶(美國(guó)Sigma公司，G1512，Type H-5，批號(hào)：232-606-8)，甲醇(美國(guó)Merck公司，色譜純，批號(hào)：I603010 -136)，醋酸銨(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，分析純，批號(hào)：20140603)，實(shí)驗(yàn)用水為超純水(自制)。

1.2儀器及測(cè)試條件Finnigan Surveyor LC-TSQ Quantum Ultra AM 液相色譜-三級(jí)串聯(lián)四極桿質(zhì)譜(LC-MS/MS)系統(tǒng)(Thermo Finnigan)。

色譜-質(zhì)譜條件：采用Hanbon Lichrospher C18(250 mm×4.6 mm I.D.,5 μm)色譜柱，甲醇-10 mmol·L-1醋酸銨(77∶23，V/V)為流動(dòng)相，流速1.05 mL·min-1，柱溫20℃，分流比3∶1。電噴霧離子化，正離子SRM檢測(cè)；噴口電壓5 kV，霧化氣壓35 kPa，輔助氣壓5 kPa，毛細(xì)管溫度300 ℃，CID碰撞能量-8eV；用于定量的SRM檢測(cè)離子為：千層紙素[M+H]+284.9→269.9，染料木素[M+H]+270.9→270.9。見(jiàn)圖1。

1.3實(shí)驗(yàn)動(dòng)物健康SD大鼠，雌雄各半，體重220～240 g，由南京中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)許可證號(hào)SYXK(蘇)2013-0008。

2　實(shí)驗(yàn)方法

2.1溶液制備千層紙素工作溶液：精密稱定千層紙素對(duì)照品，在量瓶中加甲醇溶解并稀釋，制成千層紙素濃度為1 g·L-1的溶液，再分別用甲醇稀釋成千層紙素濃度為0.05，0.1，0.2，0.5，1，2，5，10 mg·L-1的系列工作溶液。

內(nèi)標(biāo)溶液：精密稱定染料木素，在量瓶中加甲醇溶解并稀釋，制成染料木素濃度為200 mg·L-1的內(nèi)標(biāo)溶液。

2.2血漿樣品處理取大鼠血漿(肝素抗凝處理)200 μL置5 mL離心管中，加入β-葡萄糖醛酸酶/硫酸酯酶(100/4 U·mL-1)50 μL，渦旋混合15 s，經(jīng)過(guò)37℃孵化過(guò)夜，然后依次精密加入內(nèi)標(biāo)溶液5 μL、0.1%的磷酸100 μL，分別渦旋混合15 s，再加入乙酸乙酯2 mL，渦旋混合3 min，離心5 min(10 000 r·min-1)，分取上清液1.6 mL，置40℃水浴中用氮?dú)饬鞔蹈?，以流?dòng)相200 μL溶解殘?jiān)?，渦旋混合3 min，離心5 min(10 000 r·min-1)，取20 μL進(jìn)行LC-MS/MS分析。

圖1　千層紙素(A)和染料木素(B)的全掃描質(zhì)譜圖

(A)大鼠空白血漿；(B)大鼠空白血漿中添加千層紙素和內(nèi)標(biāo)(濃度分別達(dá)到5 μg·L-1)；(C)大鼠灌胃千層紙素后的血漿。色譜峰：內(nèi)標(biāo)(上)，千層紙素(下)。

圖2LC-MS/MS法測(cè)定大鼠血漿中千層紙素的典型色譜圖

2.3方法特異性考察取大鼠空白血漿、添加千層紙素和內(nèi)標(biāo)的血漿、給藥后血漿樣品各200 μL按“血漿樣品處理”項(xiàng)下方法進(jìn)行處理，測(cè)定結(jié)果如圖2。千層紙素和內(nèi)標(biāo)的保留時(shí)間分別約為5.0 min和3.0 min，內(nèi)源性物質(zhì)不干擾千層紙素和內(nèi)標(biāo)色譜峰。

2.4標(biāo)準(zhǔn)曲線和定量下線取大鼠空白血漿200 μL，分別加入千層紙素系列工作溶液20 μL，制成千層紙素濃度各為5、10、20、50、100、200、500、1 000 μg·L-1的血漿樣品，按“血漿樣品處理”項(xiàng)下方法操作。通過(guò)加權(quán)(1/C2)最小二乘法進(jìn)行線性回歸，橫坐標(biāo)為千層紙素血漿濃度(μg·L-1)，縱坐標(biāo)為千層紙素與內(nèi)標(biāo)峰面積之比(Ri)。結(jié)果顯示，千層紙素血漿樣品標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為Ri=0.0029C+0.0576，r=0.996 6，線性范圍為5～1 000 μg·L-1,定量下限為5 μg·L-1。

2.5回收率試驗(yàn)取3支潔凈離心管，分別加入濃度為0.1、0.5、2 mg·L-1的千層紙素系列工作溶液20 μL，按“血漿樣品處理”項(xiàng)下方法操作，測(cè)得Rs=樣品/內(nèi)標(biāo)峰面積比。另取3支潔凈離心管，分別加入大鼠空白血漿200 μL和千層紙素系列工作溶液20 μL，制成千層紙素濃度各為10、50、200 μg·L-1的血漿樣品，按同法操作，測(cè)得Ri=樣品/內(nèi)標(biāo)峰面積比。平行做5份，按照回收率R(%)=(Ri/Rs)×100%計(jì)算，3個(gè)不同濃度水平下的千層紙素回收率均大于85%。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1　大鼠血漿中千層紙素的回收率(n=5)

2.6精密度和準(zhǔn)確度另取3支潔凈離心管，分別加入大鼠空白血漿200 μL和千層紙素系列工作溶液20 μL，制成千層紙素濃度各為10、50、200 μg·L-1的血漿樣品，按“血漿樣品處理”項(xiàng)下方法進(jìn)行測(cè)定，平行做5份，考察血漿樣品中測(cè)定千層紙素的精密度和準(zhǔn)確度，所得結(jié)果表明該檢測(cè)方法的精密度和準(zhǔn)確度均良好。見(jiàn)表2。

2.7基質(zhì)效應(yīng)的考察取6只大鼠的空白血漿，不加內(nèi)標(biāo)，按“血漿樣品處理”項(xiàng)下操作，揮干后加適量千層紙素工作溶液，加流動(dòng)相200 μL溶解殘?jiān)?，制成濃度?0、50、200 μg·L-1的溶液，每個(gè)濃度進(jìn)樣5次，得到峰面積B；再用相同比例溶劑配制成濃度為10、50、200 μg·L-1的千層紙素溶液后進(jìn)樣，得到峰面積為A。待測(cè)物的基質(zhì)效應(yīng)(%)=B/A×100%，內(nèi)標(biāo)亦按上法考察。計(jì)算B/A均在85%～115%范圍內(nèi)，表明基質(zhì)效應(yīng)對(duì)本法無(wú)干擾。

2.8血漿樣品穩(wěn)定性考察不同條件下千層紙素濃度各為10、50、200 μg·L-1的血漿樣品的穩(wěn)定性。結(jié)果顯示，千層紙素血漿樣品在室溫(18℃)條件下保存12 h的濃度降低小于5%，在冷凍(-20℃)條件下放置2周無(wú)明顯損失并且經(jīng)3次反復(fù)凍融后測(cè)定千層紙素穩(wěn)定性良好。

2.9動(dòng)物實(shí)驗(yàn)分組及過(guò)程取SD大鼠6只，雌雄各半，實(shí)驗(yàn)前10 h禁食但可飲水，按40 mg·kg-1劑量灌胃給藥。于給藥前0 min及給藥后10、40 min，1.5、3、5、8、12、24、30、36、48、54、60 h由眼眶后靜脈叢取血約0.4 mL，在肝素化離心管中離心獲取血漿樣品，于-20 ℃條件下保存待分析。

3　結(jié)果

3.1方法學(xué)評(píng)價(jià)本實(shí)驗(yàn)采用LC-MS/MS對(duì)血漿中千層紙素濃度進(jìn)行測(cè)定。血漿中內(nèi)源性雜質(zhì)無(wú)干擾，回收率>85%，日內(nèi)、日間變異系數(shù)<15%，定量下限為5 μg·L-1，標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)r>0.99，質(zhì)控樣本和凍融試驗(yàn)均符合標(biāo)準(zhǔn)。

3.2血藥濃度-時(shí)間曲線和藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)按血漿樣品測(cè)定方法對(duì)樣品進(jìn)行處理與測(cè)定，依照標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算濃度，所得血藥濃度-時(shí)間曲線如圖3，藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)見(jiàn)表3。結(jié)果顯示，大鼠灌胃給藥千層紙素后，24 h后達(dá)到最大血藥濃度，且最大血藥濃度為105.93 μg·L-1，消除半衰期約為6.6 h。

4　討論

本實(shí)驗(yàn)采用LC-MS/MS法測(cè)定大鼠灌胃后血漿中千層紙素的血藥濃度。血漿樣品經(jīng)有機(jī)溶劑提取上清液，在氮?dú)饬飨麓蹈桑粤鲃?dòng)相溶解殘?jiān)奶幚矸椒?，可以提高待測(cè)樣品的穩(wěn)定性和檢測(cè)靈敏度，大大縮短檢測(cè)時(shí)間，同時(shí)消除了內(nèi)源性雜質(zhì)的干擾。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明本法線性、回收率、精密度和準(zhǔn)確度均良好，且無(wú)基質(zhì)效應(yīng)的影響。

表2　大鼠血漿中千層紙素的精密度和準(zhǔn)確度(n=5)

圖3　大鼠按40.0 mg·kg-1灌胃千層紙素后千層紙素 平均血藥濃度-時(shí)間曲線圖表3　大鼠按40.0 mg·kg-1灌胃千層紙素后血漿中 千層紙素的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)

參數(shù)測(cè)定值 Vc/Fmg/μg·L-1 0.152019 Cmax/μg·L-1 105.9284 Tmax/h 24 t1/2/h 6.603148 AUCt/h·μg-1·L-1 2992.567 AUCi/h·μg-1·L-1 3019.155 MRT/h 19.91949

本研究的候選內(nèi)標(biāo)包括雌二醇、氫化可的松、燈盞乙素、異鼠李素和染料木素，其中結(jié)構(gòu)與千層紙素較相似的有雌二醇和染料木素。而在相同液相條件下，雌二醇與千層紙素的保留時(shí)間相似，峰重疊，故染料木素為最佳內(nèi)標(biāo)[16]。

本實(shí)驗(yàn)對(duì)灌胃給藥后大鼠血漿中千層紙素濃度進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果顯示SD大鼠口服千層紙素后，在血中迅速地轉(zhuǎn)化為葡萄糖醛酸結(jié)合物或硫酸結(jié)合物，測(cè)得的千層紙素游離藥物濃度基本低于定量下限?？紤]無(wú)法獲得千層紙素葡萄糖醛酸結(jié)合物或硫酸結(jié)合物的對(duì)照品，故加入β-葡萄糖醛酸酶/硫酸酯酶在37℃下孵化過(guò)夜后，使結(jié)合物水解為游離原型藥物，測(cè)得的千層紙素原型藥物濃度在線性范圍之內(nèi)[17]。千層紙素血藥濃度的測(cè)定區(qū)別于黃芩類其他組分的測(cè)定[18-19]，分別同時(shí)測(cè)定千層紙素的游離藥物濃度和結(jié)合藥物濃度相對(duì)困難。與文獻(xiàn)報(bào)道一致[20]，本實(shí)驗(yàn)采用了β-葡萄糖醛酸酶/硫酸酯酶水解法來(lái)處理大鼠血漿樣品，成功地采用LC-MS/MS法測(cè)定了大鼠血漿中千層紙素的血藥濃度，對(duì)人體千層紙素藥代動(dòng)力學(xué)的研究有一定參考價(jià)值。

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通信作者：尹恒，男，博士，副主任中醫(yī)師，研究方向：中醫(yī)藥臨床和藥物研究，郵箱：yh_go@126.com

doi:10.3969/j.issn.1009-6469.2016.07.010

(收稿日期：2016-02-18，修回日期：2016-05-07)

Determination of oroxylin A in rat plasma by LC-MS/MS

XU Weifeng,FEI Yiming,HE Dan,et al

(DrugClinicalTrialInstitution,WuxiHospitalAffiliatedtoNanjingUniversityofChineseMedicine,

Wuxi,Jiangsu214071,China)

Abstract:ObjectiveTo develop a rapid and sensitive liquid chromatography-tandem mass spectrometry(LC-MS/MS)method for determination of oroxylin A in rat plasma.MethodsChromatographic separation was achieved on a C18column and the mobile phase consisted of methanol and 10 mmol·L-1ammonium acetate buffer(77∶23,V/V) pumped at a flow rate of 1.05 mL·min-1.The rat plasma samples by enzymatic hydrolysis using β-glucuronidase/sulfatase under 37 ℃ for the night were partitioned with ethyl acetate and centrifuged for sample clean-up after genistin used as internal standard(I.S.) and 0.1% phosphoric acid were added.The supernatant was then evaporated to dryness,and the residue was dissolved in 200 μL of mobile phase and analyzed.The quadrupole tandem mass spectrometer with electrospray ionization ion source(ESI) was performed in the selected reaction monitoring(SRM) mode and the transitions selected for quantitation were [M+H]+ 284.9→269.9 for oroxylin A and [M+H]+ 270.9→270.9 for genistin(I.S.),respectively.ResultsA linear calibration curve for assay of oroxylin A in rat plasma was obtained in the range of 5～1 000 μg·L-1with the recoveries of at least 85% and intra-day and inter-day RSD of 15%.ConclusionThe method can be used for thedetermination of oroxylin A in rat plasma after intragastric administration.

Key words:Scutellaria baicalensis；Tandem Mass Spectrometry;Oroxylin A；Rats,Sprague-Dawley