洪　玨　魏　凱　張　丹　張琳琳　劉　婕

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艾灸對(duì)克羅恩病大鼠穴區(qū)TRPV表達(dá)的影響*

洪玨1魏凱2張丹1張琳琳3劉婕1

1.上海市針灸經(jīng)絡(luò)研究所(上海 200030)；2.復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院博士研究生2013級(jí)(上海 200032)；3.安徽省阜陽市人民醫(yī)院(阜陽 236000)

摘要：目的觀察隔藥灸對(duì)炎癥性腸病大鼠天樞穴區(qū)TRPV1、TRPV3蛋白表達(dá)的影響，探討隔藥灸治療炎癥性腸病的穴位局部啟動(dòng)機(jī)制。方法采用雄性清潔級(jí)SD大鼠建立炎癥性腸病模型。將大鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、模型隔藥灸組、正常隔藥灸組。正常組、模型組不予任何治療；模型隔藥灸組和正常隔藥灸組均取天樞穴施以隔藥灸干預(yù)。干預(yù)結(jié)束后，采用免疫組織化學(xué)法(Immunohistochemistry)檢測(cè)各組大鼠天樞穴區(qū)TRPV1、TRPV3蛋白的表達(dá)。結(jié)果隔藥灸干預(yù)后，模型隔藥灸組TRPV1蛋白的表達(dá)水平顯著高于正常組、正常隔藥灸組(均P<0.01)以及模型組(P<0.05)；模型組與模型隔藥灸組TRPV3蛋白表達(dá)水平均顯著高于正常組(P<0.05)。結(jié)論調(diào)節(jié)穴區(qū)TRPV1、TRPV3可能是隔藥灸治療炎癥性腸病的穴位局部啟動(dòng)機(jī)制之一。

關(guān)鍵詞：針灸療法；間接灸；炎癥性腸病；TRPV

瞬時(shí)感受器電位(Transient Receptor Potential, TRP)家族能夠感受溫度變化，目前認(rèn)為TRP蛋白是哺乳類動(dòng)物軀體感覺系統(tǒng)感受溫度刺激的初級(jí)分子換能器。瞬時(shí)受體電位香草酸亞型(Transient Receptor Potential Vanilloid, TRPV)是TRP 7個(gè)亞族之一，其成員中與溫?zé)岽碳は嚓P(guān)的主要是TRPV1、TRPV2、TRPV3、TRPV4[1～5]。在艾灸療法產(chǎn)生效應(yīng)的作用中，溫?zé)岽碳な瞧渲械闹匾蛩豙6～7]。結(jié)合艾灸溫度特點(diǎn)和TRPV家族的激活溫度范圍及分布特點(diǎn)，筆者認(rèn)為TRPV家族在艾灸的局部啟動(dòng)機(jī)制中扮演著重要角色，尤其是TRPV1、TRPV3[1]。近年來，艾灸療法治療炎癥性腸病的臨床療效已被證實(shí)，然而艾灸療法的起效機(jī)制尚未闡明。本實(shí)驗(yàn)通過觀察隔藥灸對(duì)炎癥性腸病大鼠天樞穴區(qū)TRPV水平的影響，探討隔藥灸的起效機(jī)制。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體質(zhì)量為(120±20)g的雄性清潔級(jí)Sprauge-Dawley(SD)大鼠40只，由復(fù)旦大學(xué)附屬上海醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供(動(dòng)物合格證編號(hào)：2009001901205)。所有動(dòng)物購(gòu)回后室溫適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d，無不良反應(yīng)，飲食飲水正常者納入實(shí)驗(yàn)。該實(shí)驗(yàn)中所有操作均遵照動(dòng)物倫理委員會(huì)相關(guān)規(guī)定。

1.2器械、藥品和試劑

1.2.1器械與藥品特級(jí)艾絨(南陽綠瑩艾草生物制品有限公司)；自制藥粉(上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬岳陽中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院藥劑科提供)；旋渦振蕩器(Vortex，XW-80A，上海青浦瀘西儀器廠)；手握式電動(dòng)勻漿機(jī)(FLUKO，F(xiàn)6-10，德國(guó)FLUKO)；干式恒溫器(K10CD，杭州藍(lán)焰科技有限公司)；低溫冷凍離心機(jī)(1-15K，3K15，Sigma美國(guó))；生物安全柜(TYPE B2，Sigma美國(guó))；紫外殺毒車(ZXC型，上海躍進(jìn)醫(yī)用光學(xué)器械廠)。

1.2.2試劑三硝基苯磺酸(Trinitrobenzene Sulfonic Acid, TNBS)(美國(guó)Sigma公司)；無水乙醇(上海振興化工一廠)；Masson染色試劑盒(上海仁寶醫(yī)用試劑研究有限公司)。焦碳酸二乙酯(DEPC)(上海生物工程技術(shù)公司)；DEPC處理水(上海賽百盛基因公司)；氯仿HPLC級(jí)(上海試劑一廠)；異丙醇HPLC級(jí)(蘇州振亞化工廠)；無水乙醇AR級(jí)(上海振興化工一廠)。

1.3炎癥性腸病模型制作[8～11]應(yīng)用TNBS灌腸制備炎癥性腸病(克羅恩病)運(yùn)動(dòng)模型。將5%的TNBS和50%的乙醇，按2：1比例混合成TNBS灌腸液。造模前，各組大鼠禁食、不禁水飼養(yǎng)24 h，造模組根據(jù)大鼠體質(zhì)量按30 mg/kg劑量予1%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，麻醉成功后取大鼠垂直倒立體位，根據(jù)大鼠體重，按0.5 mL/kg 劑量予TNBS灌腸液直腸灌注造模，每星期1次，共4次。經(jīng)病理組織學(xué)檢測(cè)驗(yàn)證模型制備成功后，第二天開始進(jìn)行治療干預(yù)。

1.4分組處理將大鼠隨機(jī)分為正常組(A組)、模型組(B組)、模型隔藥灸組(C組)、正常隔藥灸組(D組)。A組：只做與其他組相同的固定，不治療。B組：造模成功后，只做與其他組相同的固定，不治療。C組：造模成功后，取雙側(cè)天樞穴予以隔藥灸治療。將中藥粉末(附子、肉桂、丹參等)用黃酒調(diào)成糊狀，壓成直徑5 mm、厚3 mm的藥餅，選用精制艾絨約90 mg制成椎體狀艾炷，每次每穴各灸2壯，每日1次，共灸7 d。D組：取雙側(cè)天樞穴予以隔藥灸干預(yù)，方法同模型隔藥灸組。

1.5標(biāo)本采集治療結(jié)束后，大鼠24 h禁食、不禁水，根據(jù)大鼠體質(zhì)量，按照30 mg/kg的劑量予1%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，分離天樞穴區(qū)皮膚直徑約1 cm。右側(cè)天樞穴區(qū)皮膚組織以10%的中性緩沖福爾馬林溶液固定，待測(cè)。

1.6指標(biāo)檢測(cè)方法

1.6.1TRPV1、3蛋白質(zhì)檢測(cè)采用免疫組織化學(xué)法(Immunohistochemistry)檢測(cè)TRPV1、TRPV3蛋白質(zhì)水平。石蠟組織包埋，以4 μm連續(xù)切片，采用免疫組化法檢測(cè)。結(jié)果判讀：鏡下觀察，背景呈藍(lán)色，陽性呈棕黃色或棕褐色。由同一人員在統(tǒng)一設(shè)定條件下對(duì)所有標(biāo)本進(jìn)行測(cè)定。每張切片隨機(jī)選取3個(gè)視野，由分析系統(tǒng)測(cè)定每一個(gè)視野中樣本積分光密度(Integral Optical Density, IOD)，每個(gè)視野分析3次，每個(gè)指標(biāo)取3個(gè)視野的平均值。

2　結(jié)果

2.1各組大鼠結(jié)腸組織病理學(xué)觀察正常組與正常隔藥灸組大鼠結(jié)腸黏膜完好，黏膜下及肌層組織形態(tài)結(jié)構(gòu)正常，各層組織排列整齊。模型組大鼠黏膜、黏膜下及肌層組織形態(tài)結(jié)構(gòu)紊亂，結(jié)腸黏膜上皮受損，黏膜下層有纖維細(xì)胞增生、充血水腫，有增生的肉芽組織，裂隙樣潰瘍，大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。模型隔藥灸組大鼠結(jié)腸見愈合性潰瘍，輕度充血水腫，結(jié)腸黏膜下見少量纖維細(xì)胞增生，少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，黏膜、黏膜下及肌層組織形態(tài)結(jié)構(gòu)基本正常。提示模型大鼠腸道炎癥明顯，炎癥性腸病模型制備成功；模型隔藥灸組大鼠結(jié)腸炎癥和纖維增生明顯輕于模型組。

2.2TRPV1、3蛋白質(zhì)檢測(cè)結(jié)果隔藥灸干預(yù)后，模型隔藥灸組TRPV1蛋白的表達(dá)水平顯著高于正常組、正常隔藥灸組(均P<0.01)以及模型組(P<0.05)；模型組與模型隔藥灸組TRPV3蛋白表達(dá)水平均顯著高于正常組(P<0.05)。見表1。

表1各組大鼠TPRV1、3蛋白的表達(dá)

組別動(dòng)物數(shù)TRPV1TRPV3A104666.9±993.11)3544.0±1791.1B105315.8±1692.12)5450.6±3178.83)C106676.0±1898.75671.3±1317.63)D104804.7±1166.31)4714.0±1029.5

注：與C組比較，1)P<0.01，2)P<0.05；與A組比較，3)P<0.05

3　討論

艾灸是用易燃的艾絨在體表經(jīng)穴或患病部位進(jìn)行燒灼、熏烤，借助藥物溫?zé)岬拇碳?，直接或間接地施以適當(dāng)溫?zé)岽碳?，通過經(jīng)絡(luò)的傳導(dǎo)達(dá)到防病治病和養(yǎng)生的目的[12，13]。灸法在治療炎癥性腸病方面的效果已被大量臨床和實(shí)驗(yàn)報(bào)道證實(shí)[14]。然而，灸法作用的起效機(jī)制仍不明確。

TRP是一種非電壓依賴性陽離子通道，廣泛表達(dá)于多種哺乳動(dòng)物組織中，并參與多種重要的生理功能，包括肌肉收縮、遞質(zhì)釋放、細(xì)胞增值、細(xì)胞分化、基因轉(zhuǎn)錄、細(xì)胞凋亡及細(xì)胞死亡等?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)8個(gè)TRP家族成員與溫度感受相關(guān)，其中與溫?zé)岽碳は嚓P(guān)的主要是TRPV1、TRPV2、TRPV3、TRPV4、TRPM4、TRPM5[1,14]。

溫?zé)岽碳な前陌l(fā)揮防病治病和養(yǎng)生作用的一個(gè)重要途徑[15]。結(jié)合艾灸溫度特點(diǎn)和TRPV家族的激活溫度范圍及分布特點(diǎn)，筆者認(rèn)為TRPV家族在艾灸的作用機(jī)制中可能扮演著重要角色，尤其是TRPV1、TRPV2、TRPV3。熱刺激(>43 ℃)可使TRPV1激活；TRPV2與TRPV1有50%的同源性，其被激活的閾值溫度為52 ℃。TRPV3的激活溫度范圍為33℃～39℃，且反復(fù)熱刺激后，TRPV3對(duì)熱激活呈敏感化[1]。TRPV2的激活溫度比TRPV1、TRPV3要高，雖然也是隔藥灸所能達(dá)到的溫度范圍，然而艾灸溫度從室溫升高到極值需要一定時(shí)間，且為大鼠特制的艾炷燃燒時(shí)間有限。這從一定程度上影響了TRPV2的激活，從而也限制了TRPV2在艾灸過程中的作用?；诖耍緦?shí)驗(yàn)選取TRPV1、TRPV3作為隔藥灸作用基礎(chǔ)的研究對(duì)象。

大量研究證明，TRPV家族成員在神經(jīng)性炎癥、內(nèi)臟高敏感性疼痛、癌痛、呼吸道疾病的發(fā)生和發(fā)展中起到了重要的作用[16～25]。針對(duì)炎癥性腸病的前期研究也表明了結(jié)腸中的TRPV1參與了炎癥過程，并且與肥大細(xì)胞成正相關(guān)[26]。然而，作為重要的溫覺感受器，TRPV除了介導(dǎo)傷害性刺激外，其存在是否有其他積極意義？本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示，隔藥灸干預(yù)后，模型隔藥灸組TRPV1的蛋白表達(dá)水平顯著高于正常組、正常隔藥灸組以及模型組，模型組與模型隔藥灸組TRPV3蛋白表達(dá)水平均顯著高于正常組。這從一定程度上說明，TRPV1、TRPV3參與和介導(dǎo)了隔藥灸的作用過程。

研究表明TRPV家族參與了機(jī)體的多種生理、病理過程[27～28]。對(duì)TRPV水平的調(diào)節(jié)能直接或間接地影響炎癥、內(nèi)臟痛、皮膚神經(jīng)性炎癥以及癌痛的治療，因此TRPV家族已成為了醫(yī)學(xué)者關(guān)注的對(duì)象。不同的艾灸方法所能產(chǎn)生的溫度變化不盡相同，而溫覺感受器的激活條件與介導(dǎo)的病理現(xiàn)象也各不相同，進(jìn)一步研究TRPV各成員特點(diǎn)和影響因素，對(duì)選擇正確的治療方法有著重要的意義。本實(shí)驗(yàn)對(duì)TRPV的研究，提示我們可以從另一個(gè)角度來研究艾灸療法，并為臨床上如何選擇合適的艾灸方法提供了新的參考。

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*基金項(xiàng)目：上海高校選拔培養(yǎng)優(yōu)秀青年教師科研專項(xiàng)基金(No.SZY10071)；國(guó)家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項(xiàng)目(No.81202754)上海市衛(wèi)生局青年科研項(xiàng)目(No.20134Y148)

doi:10.3969/j.issn.1003-8914.2016.02.029

文章編號(hào)：1003-8914(2016)-02-0214-04

收稿日期：(本文校對(duì)：齊麗珍2015-04-10)

Effect of Indirect Moxibustion on the Expression of TRPV in Rats with Inflammatory Bowel Disease

HONG Jue1WEI Kai2ZHANG Dan1ZHANG Linlin3LIU Jie1

(1.Shanghai Research Institute of Acupuncture and Meridian, Shanghai 200030, China；2.Grade 2013 PHD Candidate, Shanghai Medical College, Fudan University, Shanghai 200032, China；3.Grdea 2013 Graduate, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, Shanghai 201203, China)

Abstract：ObjectiveTo observe the effect of indirect moxibustion on the protein expressions of TRPV1, 3 in Tianshu (ST 25) acupoint area of rats with inflammatory bowel disease (IBD), and to explore the mechanism of indirect moxibustion in treating IBD. MethodMale SD rats of clean grade were used to develop IBD models. The rats were randomized into normal group (group A) and model group (group B), model indirect moxibustion group (group C) and normal indirect moxibustion group (group D). Group A and group B didn’t receive intervention. Group C and group D received indirect moxibustion at Tianshu (ST 25). At the end of the intervention, the protein expressions of TRPV1, 3 in Tianshu (ST 25) area were detected by using immunohistochemistry. ResultAfter indirect moxibustion, the protein expression of TRPV1 of group C was significantly higher than that of group A and group D (P<0.01) and group B (P<0.05), respectively. The protein expression of TRPV3 of group B and group C were significantly higher than that of group A (P<0.05). ConclusionRegulation of TRPV1, 3 in Tianshu (ST 25) area is possibly one of the mechanisms of indirect moxibustion in treating IBD.

Key words：Acupuncture-moxibustion therapy; Indirect moxibustion; Inflammatory bowel disease; TRPV