岳冬梅，閻　冰，馬軼文，王益民，孟慶楠

（1.天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津，300193；2.天津市濱海新區(qū)塘沽婦產(chǎn)醫(yī)院，天津300451）

不同濃度葛根素溶液對(duì)人皮膚成纖維細(xì)胞生物學(xué)效應(yīng)的影響*

岳冬梅1，閻冰1，馬軼文2，王益民1，孟慶楠1

（1.天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津，300193；2.天津市濱海新區(qū)塘沽婦產(chǎn)醫(yī)院，天津300451）

［目的］觀察不同濃度的葛根素溶液對(duì)人皮膚成纖維細(xì)胞（HDF）生物學(xué)效應(yīng)的影響。［方法］體外培養(yǎng)人皮膚成纖維細(xì)胞，選用葛根素溶液100、200、300、400、500 μg/mL五個(gè)不同的藥物濃度，觀測(cè)葛根素溶液在5個(gè)藥物濃度下對(duì)HDF的生物學(xué)效應(yīng)的影響。［結(jié)果］與對(duì)照組相比較，藥物濃度為100、200、300、400 μg/mL的葛根素溶液，對(duì)體外培養(yǎng)的HDF的生物學(xué)效應(yīng)無(wú)影響（P＞0.05）；藥物濃度為500 μg/mL的葛根素溶液，對(duì)體外培養(yǎng)的HDF的增殖有抑制作用（P＜0.05），且對(duì)HDF的細(xì)胞膜有一定的損傷作用（P＜0.05）。［結(jié)論］藥物濃度500 μg/mL的葛根素溶液對(duì)體外培養(yǎng)的HDF有抑制增殖和細(xì)胞膜損傷的作用，此藥物濃度可作為干預(yù)HDF的作用劑量，對(duì)瘢痕組織的治療將起到一定作用。

葛根素；人皮膚成纖維細(xì)胞；藥物濃度；生物學(xué)效應(yīng)

葛根素為黃酮類化合物，是豆科植物野葛或甘葛藤的有效成分之一，主要用于治療心腦血管系統(tǒng)疾病等［1-2］。研究報(bào)道［3］葛根素溶液在藥物濃度80～400 μg/mL下，作用于人胚肺成纖維細(xì)胞24～72 h，此時(shí)間范圍內(nèi)，葛根素在依賴時(shí)間和劑量的前提下可抑制其增生（P＜0.05），本研究借鑒前人經(jīng)驗(yàn)，選用體外培養(yǎng)人皮膚成纖維細(xì)胞（HDF）的方法，選用葛根素從低到高五個(gè)不同的藥物濃度作研究，觀測(cè)葛根素注射液在濃度遞增的情況下對(duì)人皮膚成纖維細(xì)胞的增殖活性、細(xì)胞膜、氧化損傷產(chǎn)生的影響，對(duì)比分析前后實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇出最佳藥物劑量，為后序的研究提供參考。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)細(xì)胞人皮膚成纖維細(xì)胞株（HDF，美國(guó)

ATCC公司）。

1.2實(shí)驗(yàn)試劑葛根素注射液（濃度：5 g/L，山東萊陽(yáng)生物化學(xué)制藥廠）；；優(yōu)級(jí)胎牛血清（FBS）、胰酶（美國(guó)Gibco公司）、DMEM低糖培養(yǎng)粉（美國(guó)Gibco

公司）；四甲基偶氮唑鹽（MTT，美國(guó)Sigma公司）；二甲基亞砜（DMSO，美國(guó)Sigma公司）；乳酸脫氫酶（LDH）試劑盒（中生北控生物有限公司）；超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒、丙二醛（MDA）試劑盒（南京建成生物工程有限公司）。

1.3檢測(cè)儀器酶標(biāo)儀（奧地利SUNRISE）；全自動(dòng)生化分析儀（日本日立公司）。

1.4實(shí)驗(yàn)分組空白組（只含培養(yǎng)基）、對(duì)照組（培養(yǎng)基+細(xì)胞）、葛根素組。葛根素組藥物濃度依次為：100 μg/mL（1組）、200 μg/mL（2組）、300 μg/mL （3組）、400 μg/mL（4組）、500 μg/mL（5組），共設(shè)5個(gè)濃度組。

1.5檢測(cè)指標(biāo)主要檢測(cè)HDF的形態(tài)學(xué)變化、MTT、LDH、SOD、MDA值。

1.6細(xì)胞培養(yǎng)及指標(biāo)檢測(cè)

1.6.1HDF的培養(yǎng)對(duì)HDF進(jìn)行復(fù)蘇，將其轉(zhuǎn)移到細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，用含10%胎牛血清（FBS）的DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，放置于37℃、含5%二氧化碳（CO2）的培養(yǎng)箱中，待細(xì)胞鋪滿瓶壁時(shí)，用0.25%胰蛋白酶，對(duì)HDF進(jìn)行消化并傳代，采用處在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期（LP）的細(xì)胞進(jìn)行本次實(shí)驗(yàn)。

1.6.2檢測(cè)細(xì)胞MTT值用混合消化液消化80%融合生長(zhǎng)的HDF，收集處理后的細(xì)胞，用含有10% FBS的DMEM培養(yǎng)基接種于96孔板，密度為2× 104/每孔，每孔100 μL，正常培養(yǎng)12 h后，使細(xì)胞貼壁。實(shí)驗(yàn)設(shè)空白組、對(duì)照組、葛根素藥物組。藥物組每組各加入葛根素注射液（原濃度5 g/L）2、4、6、8、10 μL，令葛根素溶液的藥物濃度，依次為：100 μg/mL （1組）、200μg/mL（2組）、300μg/mL（3組）、400μg/mL （4組）、500 μg/mL（5組），共設(shè)5個(gè)濃度組，每組包含12個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)48 h后，移出培養(yǎng)液，換入磷酸鹽緩沖溶液（PBS液，pH7.2-7.4），100 μL/孔，清洗2遍，移出PBS液，并于每孔中加入MTT（5 g/L）20 μL，孵育4 h后，將MTT溶液移出，在每個(gè)孔中，加入二甲基亞砜（DMSO）150 μL，為使結(jié)晶物徹底溶解，將96孔板放于搖床上，低速振搖10 min，待結(jié)晶物完全溶解后，用酶標(biāo)儀于570 nm波長(zhǎng)檢測(cè)各組的光密度值（Optical Density，OD值）。

1.6.3檢測(cè)細(xì)胞LDH、SOD、MDA值將HDF以細(xì)胞密度5×104/mL種植于24孔板，分為空白組、對(duì)照組、5個(gè)不同濃度藥物組（同上），每組12個(gè)復(fù)孔，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)48 h后，取細(xì)胞上清液，使用LDH試劑盒，在全自動(dòng)生化儀上檢測(cè)細(xì)胞外的LDH值；使用SOD試劑盒，檢測(cè)細(xì)胞外的SOD值；使用MDA試劑盒，檢測(cè)細(xì)胞外的MDA值。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS18.0分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±ss）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD法，P< 0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1藥物干預(yù)下HDF的生長(zhǎng)狀態(tài)和形態(tài)學(xué)的改變使用倒置顯微鏡，觀測(cè)到對(duì)照組HDF的形狀為長(zhǎng)梭形，葛根素注射液組（藥物組）HDF的間隙，相比對(duì)照組有所增大，HDF生長(zhǎng)的略顯緩慢。

2.2不同濃度的葛根素溶液對(duì)HDF增殖的影響結(jié)果見(jiàn)表1。

表1　不同濃度的葛根素溶液對(duì)HDF增殖的影響（±ss）Tab.1　Effects of puerarin solution of different concentrations on HDF proliferation（±ss）

表1　不同濃度的葛根素溶液對(duì)HDF增殖的影響（±ss）Tab.1　Effects of puerarin solution of different concentrations on HDF proliferation（±ss）

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05。

組別　OD值空白組　0.075±0.022對(duì)照組　0.125±0.02 1組　0.131±0.028 2組　0.142±0.041 3組　0.127±0.028 4組　0.112±0.018 5組　0.105±0.013* n 藥物濃度（μg/mL）12 12 12 12 12 12 12 0 0 100 200 300 400 500

由表1可見(jiàn)，與對(duì)照組細(xì)胞的OD值相比較，葛根素溶液的藥物濃度依次為100、200、300、400μg/mL時(shí)，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與對(duì)照組的OD值相比較，當(dāng)葛根素溶液的藥物濃度達(dá)到500 μg/mL時(shí)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），顯示藥物濃度500 μg/mL的葛根素溶液，對(duì)體外培養(yǎng)的HDF具有抑制增殖的作用。

2.3不同濃度的葛根素溶液對(duì)HDF乳酸脫氫酶的影響結(jié)果見(jiàn)表2。

表2　不同濃度的葛根素溶液對(duì)HDF乳酸脫氫酶的影響（±ss）Tab.2　Effects of puerarin solution of different concentrations on LDH of HDF（±ss）

表2　不同濃度的葛根素溶液對(duì)HDF乳酸脫氫酶的影響（±ss）Tab.2　Effects of puerarin solution of different concentrations on LDH of HDF（±ss）

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05。

組別空白組對(duì)照組1組2組3組4組5組n 12 12 12 12 12 12 12藥物濃度（μg/mL）　LDH值（U/L）0 40.92±2.50 0 52.92±2.81 100　53.58±2.56 200　54.83±3.58 300　55.58±3.23 400　56.38±3.22 500　60.92±2.59*

乳酸脫氫酶（LDH）是穩(wěn)定的胞漿酶，它存在于所有的細(xì)胞當(dāng)中，當(dāng)細(xì)胞膜收到損傷時(shí)，它會(huì)快速釋放到細(xì)胞培養(yǎng)液中。由表2可見(jiàn)，與對(duì)照組細(xì)胞的LDH值相比較，葛根素溶液的藥物濃度依次為100、200、300、400 μg/mL時(shí)，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；與對(duì)照組的LDH值相比較，當(dāng)葛根素溶液的藥物濃度達(dá)到500μg/mL時(shí)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），顯示藥物濃度500 μg/mL的葛根素溶液，對(duì)體外培養(yǎng)的HDF的細(xì)胞膜具有一定的損傷作用。

2.4不同濃度的葛根素溶液對(duì)HDF氧化損傷的影響結(jié)果見(jiàn)表3。

表3　不同濃度的葛根素溶液對(duì)HDF氧化損傷的影響（±ss）Tab.3　Effects of puerarin solution of different concentrations on oxidative damage of HDF（±ss）

表3　不同濃度的葛根素溶液對(duì)HDF氧化損傷的影響（±ss）Tab.3　Effects of puerarin solution of different concentrations on oxidative damage of HDF（±ss）

組別空白組對(duì)照組組組組組組n 12 12 12 12 12 12 12藥物濃度（μg/mL） SOD值（U/L）MDA值（μmol/L）0 15.23±2.26　0.65±0.023 0 20.17±1.92　0.89±0.024 100　21.32±2.28　0.92±0.031 200　20.42±1.41　0.91±0.028 300　21.27±1.58　0.89±0.027 400　20.67±2.18　0.91±0.025 500　22.15±2.13　0.92±0.026 1 2 3 4 5

由表3可見(jiàn)，與對(duì)照組細(xì)胞的SOD值、MDA值相比較，葛根素溶液的藥物濃度依次為100、200、300、400、500μg/mL時(shí)，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。細(xì)胞的SOD值、MDA值代表了細(xì)胞的氧化損傷狀態(tài)，顯示上述藥物濃度的葛根素溶液，對(duì)體外培養(yǎng)的HDF的氧化損傷無(wú)影響。

3　結(jié)論

與對(duì)照組相比較，藥物濃度500 μg/mL的葛根素溶液，對(duì)體外培養(yǎng)的HDF的增殖有抑制作用，對(duì)細(xì)胞膜有一定的損傷作用。

4　討論

中醫(yī)記載，葛根具有退熱發(fā)汗、解肌、止瀉、止渴等作用效果，其藥理活性較強(qiáng)，安全性高，且自然資源豐富、價(jià)格低廉，因此其臨床應(yīng)用越來(lái)越廣泛［4］。葛根素之于葛根，其成分更加單純，藥效精專，藥理活性也相對(duì)較強(qiáng)，現(xiàn)已普遍應(yīng)用于心腦血管等疾病的治療，葛根素還可抑制醛糖還原酶（AR）的活性［5］，又可抑制脂質(zhì)（Lipide）的過(guò)氧化改變，促使超氧離子的自由基得到消除，因此可用其保護(hù)血管內(nèi)皮，具體應(yīng)用時(shí)應(yīng)藥理作用與臨床相結(jié)合［6-8］。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：與對(duì)照組比較，葛根素溶液的藥物濃度為100、200、300、400 μg/mL時(shí)，對(duì)人皮膚成纖維細(xì)胞的增殖、細(xì)胞膜、氧化損傷無(wú)影響（P＞0.05）；當(dāng)葛根素溶液的藥物濃度為500 μg/mL時(shí)，在一定程度上可以抑制HDF的增殖，對(duì)其細(xì)胞膜有一定程度的損傷作用（P＜0.05）。顯示葛根素對(duì)HDF的生物學(xué)效應(yīng)與藥物濃度相關(guān)，藥物濃度不同，其作用效果也不同。本實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)，與之前的研究報(bào)道（80～400 μg/mL藥物濃度葛根素，可抑制人胚肺成纖維細(xì)胞的增生，呈時(shí)間和劑量依賴性）所得的實(shí)驗(yàn)結(jié)論不同，分析可能是細(xì)胞種類不同，對(duì)葛根素藥理作用的敏感性不同，實(shí)驗(yàn)結(jié)果有所差異［9-11］。

人皮膚成纖維細(xì)胞（HDF）是皮膚真皮網(wǎng)織層（reticular layer of dermis）中最重要的細(xì)胞，是皮膚受損后的主要修復(fù)細(xì)胞，在瘢痕組織（scar tissue）的形成中起到重要作用［12］?？梢赃x擇藥物濃度500 μg/mL的葛根素溶液，作為干預(yù)HDF增殖的作用劑量，對(duì)瘢痕組織的治療將起到一定作用?？蓪?duì)葛根素進(jìn)一步進(jìn)行瘢痕組織治療效果的研究。

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（本文編輯：高杉，張震之）

Biological effects of different concentrations of Puerarin solution on human skin fibroblast

YUE Dong-mei1，YAN Bing1，MA Yi-wen2，WANG Yi-min1，MENG Qing-nan1
（1.Tianjin University of Traditional Chinese Medicine，Tianjin 300193，China；2.Tanggu Maternity Hospital of Tianjin Binhai New Area，Tianjin 300451，China）

［Objective］To observe biological effects of different concentrations of puerarin solution on proliferation of human skin fibroblasts（HDF）.［Methods］Cultivated human skin fibroblasts in vitro，observed biological effects of puerarin solutions of 100，200，300，400，500 μg/mL five different drug concentrations on HDF.［Results］Compared with control group，drug concentration of 100，200，300，400 μg/mL of puerarin solution had no influence on biological effects of HDF.Drug concentration of 500 μg/mL of puerarin solution inhibited proliferation of HDF，had a certain damage on cell membranes of HDF.［Conclusion］Puerarin solution of 500 μg/mL can inhibit proliferation of HDF and have damage on cell membranes of HDF cultured in vitro，this drug concentration can be used as the dose of HDF intervention，will play a role in treatment of scar tissue.

Puerarin；human skin fibroblasts；drug concentration；biological effect

R285.5

A

1672-1519（2016）05-0311-03

10.11656/j.issn.1672-1519.2016.05.14

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（30873467）。

岳冬梅（1988-），女，碩士研究生，主要從事中醫(yī)工程學(xué)研究。

孟慶楠，E-mail：mqn1234@163.com；王益民，E-mail: ylzmyh@163.com。

2015-11-28）