王千　吳偉偉　張浩　萬喆　李若瑜　王愛平　劉偉

(北京大學(xué)第一醫(yī)院皮膚性病科 北京大學(xué)真菌和真菌病研究中心 皮膚病分子診斷北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100034)

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舍他康唑?qū)ΤＲ娕R床分離念珠菌屬菌株的體外抗菌活性研究

王千吳偉偉張浩萬喆李若瑜王愛平劉偉

(北京大學(xué)第一醫(yī)院皮膚性病科 北京大學(xué)真菌和真菌病研究中心 皮膚病分子診斷北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100034)

目的了解舍他康唑?qū)ΤＲ娕R床分離念珠菌屬菌株的體外抗菌活性。方法參照美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì) (Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI)制定的M27-A3方案測(cè)定舍他康唑?qū)?12株念珠菌的MIC值。結(jié)果 舍他康唑?qū)?12株念珠菌在24 h的MIC GM為0.18 μg/mL，MIC范圍為≤0.03～16 μg/mL，MIC50和MIC90分別為0.125 μg/mL、1 μg/mL。對(duì)念珠菌屬各菌種的MIC GM從低到高依次為白念珠菌0.08 μg/mL，光滑念珠菌0.158 μg/mL，近平滑念珠菌0.318 μg/mL，熱帶念珠菌為0.425 μg/mL,克柔念珠菌為1.414 μg/mL。結(jié)論舍他康唑?qū)ΤＲ娕R床分離念珠菌屬菌株均有較好的體外抗菌活性。

舍他康唑；念珠菌屬；體外；敏感性試驗(yàn)

[Chin J Mycol，2016，11(3):153-155]

舍他康唑是一種新型咪唑類抗真菌藥物，具有廣譜抗菌活性，能夠有效抑制皮膚癬菌、念珠菌、帚霉及革蘭陽性菌，并且還有良好的抗炎活性[1]。國(guó)內(nèi)目前已有使用美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)(Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI)標(biāo)準(zhǔn)化方法檢測(cè)舍他康唑?qū)ζつw癬菌體外抗菌活性的報(bào)道[2]，但缺乏該方法測(cè)定舍他康唑?qū)δ钪榫捏w外抗菌活性的數(shù)據(jù)。為了解舍他康唑?qū)ξ覈?guó)臨床常見致病性念珠菌的體外抗菌活性，本研究參照CLSI制定的M27-A3 (酵母菌)微量液基稀釋法測(cè)定了舍他康唑?qū)Ψ蛛x自我國(guó)的112株念珠菌的體外抗菌活性。部分內(nèi)容已在2015年5月澳大利亞墨爾本舉辦的第19屆國(guó)際人與動(dòng)物真菌大會(huì) (19thcongress of the International Society for Human and animal Mycology)上進(jìn)行了交流。

1　材料與方法

1.1受試菌

受試菌株來自于北京大學(xué)真菌和真菌病研究中心保藏菌株，試驗(yàn)用菌株均為臨床分離株。念珠菌菌株均采用ChroMagarCandida瓊脂顯色培養(yǎng)基及API 20CAUX酵母鑒定系統(tǒng)鑒定。共112株，其中白念珠菌40株、光滑念珠菌28株、近平滑念珠菌23株、熱帶念珠菌17株、克柔念珠菌4株。質(zhì)控菌株為近平滑念珠菌ATCC 22019和克柔念珠菌ATCC 6258。

1.2受試藥物

硝酸舍他康唑純品由西班牙Ferrer Interquim,S.A提供。編碼：6191065；批號(hào)：A14405A；生產(chǎn)日期：2014年7月；分析日期：2014年8月27日。

1.3體外抗菌活性測(cè)定[3]

培養(yǎng)基制備按照CLSI方案要求采用RPMI-1640液體培養(yǎng)基，以終濃度為0.165 mol/L的MOPS為緩沖液，調(diào)整培養(yǎng)基在25℃時(shí)pH值為7.10±0.1。

藥物溶液的制備稱取舍他康唑的藥粉溶解在DMSO (二甲基亞砜)中制成濃度1 600 μg/mL的藥物原液，藥物儲(chǔ)存液于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

藥敏板配置用RPMI-1640培養(yǎng)基稀釋50倍至2倍于藥物的終濃度 (范圍為0.031～16 μg/mL)。取0.1 mL各濃度藥液分別加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板第1到第10列各孔，取0.1 mL不含藥物的培養(yǎng)基加入第11列作為生長(zhǎng)對(duì)照 (陽性對(duì)照)，取0.2 mL培養(yǎng)基加入第12列作為陰性對(duì)照。配制好的藥敏板儲(chǔ)存在-20℃?zhèn)溆谩?/p>

菌懸液制備和接種受試菌株接種于馬鈴薯葡萄糖瓊脂 (potato dextrose agar，PDA)培養(yǎng)基上35℃培養(yǎng)24～48 h。用無菌棉簽蘸取菌落溶于生理鹽水中，混勻后調(diào)整菌懸液濃度至0.5麥?zhǔn)蠁挝唬瑢?duì)應(yīng)孢子濃度為 (1～5)×106CFU/mL，將此菌懸液用RPMI-1640先稀釋20倍，再稀釋50倍得到2倍終濃度菌懸液。將配置好的藥敏板取出室溫下融化，96孔培養(yǎng)板除12列外，其余各孔均加入100 μL菌懸液，將培養(yǎng)板置于35℃恒溫培養(yǎng)。

孵育及結(jié)果判讀將接種后的藥敏板于35℃條件下孵育，分別在24 h和48 h讀取最低抑菌濃度 (minimal inhibitory concentration，MIC)。舍他康唑的MIC定義參考其他唑類藥物，即與生長(zhǎng)對(duì)照相比，真菌生長(zhǎng)50%受抑制孔中的最低藥物濃度。由于M27-A3方案中沒有規(guī)定舍他康唑的判讀時(shí)間，參照該方案中檢測(cè)三唑類藥物對(duì)念珠菌的抗菌活性時(shí)的規(guī)定，若24 h生長(zhǎng)對(duì)照生長(zhǎng)良好，則選取24 h MIC為標(biāo)準(zhǔn)，若生長(zhǎng)不完全，則延長(zhǎng)至48 h讀取結(jié)果。故以24 h孵育時(shí)間為標(biāo)準(zhǔn)，但是，為與國(guó)內(nèi)外同行的結(jié)果進(jìn)行比較，將24 h和48 h的結(jié)果都進(jìn)行了記錄。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS Version 21進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，得到MIC范圍、MIC幾何均數(shù) (geometric mean，GM)、MIC50和MIC90。

2　結(jié)　　果

舍他康唑?qū)?12株念珠菌在不同時(shí)間點(diǎn)各個(gè)菌種的MIC范圍及GM結(jié)果見表1。

表1舍他康唑?qū)?12株念珠菌在24 h和48 h各個(gè)菌種的MIC及GM (μg/mL)

Tab.1MIC & GM values of sertaconazole against 112 ofCandidaspp.at 24 hour and 48 hour

菌株(株數(shù))孵育時(shí)間MIC范圍MIC50MIC90GM白念珠菌(40)24h≤0.03～20.060.250.08048h≤0.03～40.12510.216光滑念珠菌(28)24h0.03～20.1250.50.15848h0.25～20.510.725近平滑念珠菌(23)24h0.125～160.250.50.31848h0.125～160.510.599熱帶念珠菌(17)24h0.125～20.2510.42548h0.25～20.520.722克柔念珠菌(4)24h1～2121.41448h1～4141.682合計(jì)(112)24h≤0.03～160.12510.18048h≤0.03～160.520.466

在24 h，舍他康唑?qū)δ钪榫腗IC GM為0.18 μg/mL，MIC范圍為≤0.03～16 μg/mL，MIC50和MIC90分別為0.125 μg/mL、1 μg/mL。對(duì)白念珠菌的GM為0.08 μg/mL，對(duì)光滑念珠菌為0.158 μg/mL，對(duì)近平滑念珠菌為0.318 μg/mL，對(duì)熱帶念珠菌為0.425 μg/mL，對(duì)克柔念珠菌為1.414 μg/mL。

在48 h，舍他康唑?qū)δ钪榫腗IC GM為0.466 μg/mL，MIC范圍為≤0.03～16 μg/mL，MIC50和MIC90分別為0.5 μg/mL、2 μg/mL。對(duì)白念珠菌的GM為0.216 μg/mL，對(duì)光滑念珠菌為0.725 μg/mL，對(duì)近平滑念珠菌為0.599 μg/mL，對(duì)熱帶念珠菌為0.722 μg/mL，對(duì)克柔念珠菌為1.682 μg/mL。

在試驗(yàn)中觀察到舍他康唑不能完全抑制念珠菌的生長(zhǎng)，存在拖尾現(xiàn)象，并且孵育時(shí)間對(duì)MIC有明顯影響，48 h的MIC顯著高于24 h的MIC，GM升高了2.6倍，尤其對(duì)光滑念珠菌，48 h的GM相比24 h的GM升高了5倍。

另外，舍他康唑?qū)Ψ颠蚰退幍陌啄钪榫肮饣钪榫腗IC結(jié)果顯示，3株氟康唑耐藥 (MIC≥8 μg/mL)的白念珠菌的MIC范圍是0.03～2 μg/mL，GM為0.391 μg/mL。2株氟康唑耐藥 (MIC≥64 μg/mL)的光滑念珠菌MIC范圍是1～2 μg/mL，GM為1.414 μg/mL。2株氟康唑耐藥 (MIC≥8 μg/mL)的近平滑念珠菌，1株對(duì)舍他康唑同樣耐藥，另1株的MIC為0.125 μg/mL。

3　討　　論

舍他康唑?qū)儆谶溥蝾惪拐婢帲哂幸志蜌⒕p重作用機(jī)制。主要通過抑制真菌細(xì)胞色素P450依賴酶—羊毛固醇14α-去甲基化酶發(fā)揮作用，一方面阻斷真菌細(xì)胞膜麥角固醇的生物合成，導(dǎo)致膜麥角固醇缺乏；另一方面甲基化的羊毛固醇在真菌細(xì)胞內(nèi)積聚，真菌細(xì)胞生長(zhǎng)受到抑制或者死亡。此外，舍他康唑在高濃度時(shí)可以直接結(jié)合到細(xì)胞膜中，從而導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)容物外流，引起真菌細(xì)胞的死亡[4]。

舍他康唑具有廣譜抗菌活性，對(duì)皮膚癬菌、念珠菌、隱球菌、馬拉色菌、曲霉、賽多孢霉和帚霉均有抗菌活性，尤其對(duì)皮膚癬菌和念珠菌抗菌活性最強(qiáng)。國(guó)外有關(guān)舍他康唑?qū)δ钪榫鷮袤w外抗菌活性的研究大多是在CLSI抗真菌藥敏標(biāo)準(zhǔn)方案發(fā)布之前進(jìn)行的。試驗(yàn)方法多種多樣，包括微量液基稀釋法、紙片擴(kuò)散法、瓊脂稀釋擴(kuò)散法。并且試驗(yàn)時(shí)使用的培養(yǎng)基、孵育時(shí)間及結(jié)果判讀標(biāo)準(zhǔn)也都不盡相同。

Carrillo等[5]采用改良沙氏培養(yǎng)基微量稀釋法檢測(cè)舍他康唑等對(duì)150株念珠菌的體外抗菌活性，舍他康唑的抗菌活性優(yōu)于益康唑及聯(lián)苯芐唑，近平滑念珠菌對(duì)舍他康唑最敏感，熱帶念珠菌對(duì)其最不敏感。Carrillo等[6]采用紙片擴(kuò)散法檢測(cè)了來自陰道和皮膚的酵母菌 (183株)對(duì)10種抗真菌藥物的敏感性，結(jié)果顯示舍他康唑?qū)湍妇拿舾新蕿?7.4%，僅1株菌耐藥 (0.5%)。此外，對(duì)舍他康唑敏感的酵母菌中包括10株氟康唑耐藥菌及1株伊曲康唑耐藥菌。Palacin[7]采用瓊脂擴(kuò)散法檢測(cè)舍他康唑?qū)Ψ蛛x自陰道的酵母菌 (94株)中的白念珠菌的MIC90為0.06 μg/mL,對(duì)光滑念珠菌和近平滑念珠菌均為0.25 μg/mL,對(duì)克柔念珠菌為1 μg/mL,對(duì)熱帶念珠菌為2 μg/mL。與氟康唑、酮康唑、芬替康唑、克霉唑和伊曲康唑相比，舍他康唑是抗菌活性較好的藥物，尤其對(duì)光滑念珠菌效果最好。這些結(jié)果表明，舍他康唑?qū)δ钪榫鷮儆休^好的體外抗菌活性，優(yōu)于益康唑、聯(lián)苯芐唑、氟康唑、酮康唑等常用的局部抗真菌藥物。然而，由于試驗(yàn)方法不統(tǒng)一，所以不同實(shí)驗(yàn)室的結(jié)果可比性較差。

Carrillo等[8]采用CLSI微量液基稀釋法對(duì)100株分離自甲的臨床分離株進(jìn)行體外抗菌活性檢測(cè)，結(jié)果顯示舍他康唑?qū)δ钪榫鷮俚腗IC的GM分別為克柔念珠菌0.03 μg/mL、白念珠菌0.153 μg/mL、近平滑念珠菌0.27 μg/mL、光滑念珠菌0.63 μg/mL、熱帶念珠菌1.41 μg/mL。該研究并未明確指出孵育時(shí)間，其藥敏數(shù)據(jù)與本研究48 h的結(jié)果相近，但克柔念珠菌的MIC明顯低于我們的MIC值，雙方所使用的克柔念珠菌的個(gè)數(shù)都比較少，可能是由于菌株本身的差異所致。

本研究在國(guó)內(nèi)首次使用CLSI標(biāo)準(zhǔn)化藥敏方案檢測(cè)舍他康唑?qū)ΤＲ娔钪榫鷮俚捏w外抗菌活性，結(jié)果顯示舍他康唑?qū)Ψ蛛x自中國(guó)的常見念珠菌屬的菌株有良好的體外抗菌活性。

[2]萬喆,王愛平,陳偉,等.6種抗真菌藥物對(duì)皮膚癬菌體外抗真菌活性評(píng)價(jià)[J].中國(guó)真菌學(xué)雜志,2009，4(4):211-213.

[3]Clinical and Laboratory Standards Institute.Reference method for broth dilution antifungal susceptibility testing of yeasts;Approved Standard—Third Edition.CLSI document M27-A3[S].Wayne,PA:Clinical and Laboratory Standards Institute，2008.

[4]王愛平,李若瑜.抗真菌藥物舍他康唑[J].中國(guó)真菌學(xué)雜志,2011，6(1):61-64.

[5]Carrillo-Munoz AJ,Torres-Rodriguez JM.Invitroantifungal activity of sertaconazole,econazole,and bifonazole againstCandidaspp[J].J Antimicrob Chemother，1995,36(4):713-716.

[7]Palacín C,Tarragó C,Agut J,et al.Invitroactivity of sertaconazole,fluconazole,ketoconazole,fenticonazole,clotrimazole and itraconazole against pathogenic vaginal yeast isolates[J].Methods Find Exp Clin Pharmacol,2001,23(2):61-64.

Invitroantifungal activity of sertaconazole against clinical isolates ofCandidaspp.

WANG Qian，WU Wei-wei，ZHANG Hao，WAN Zhe，LI Ruo-yu，WANG Ai-ping，LIU Wei

(Desect1mentofDermatology&Venereology,PekingUniversityFirstHospital,ResearchCenterforMedicalMycology,BeijingKeyLaboratoryofMolecularDiagnosisonDermatoses,PekingUniversity,Beijing100034)

ObjectiveTo investigate theinvitroantifungal activity of sertaconazole against the clinical strains ofCandidaspp.isolated from China.MethodsMinimal inhibitory concentration (MIC) of sertaconazole against 112 strains were tested by using CLSI (Clinical and Laboratory Standards Institute)broth microdilution method M27-A3.ResultsThe overall geometric mean 24 h MIC of sertaconazole was 0.18 μg/mL with a MIC range of ≤0.03～16 μg/mL,MIC50and MIC90of sertaconazole were 0.125 μg/mL,1 μg/mL,respectively.In the same time,the geometric mean MIC was 0.080 μg/mL forC.albicans,0.158 μg/mL forC.glabrata,0.318 μg/mL forC.parapsilosis,0.425 μg/mL forC.tropicalis,1.414 μg/mL forC.krusei.ConclusionSertaconazole is active against pathogenicCandidaspp..

sertaconazole;Candidaspp.；invitro；susceptibility tests

2015-05-29[本文編輯]施慧

中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)會(huì)--皮膚病研究基金；國(guó)家自然科學(xué)基金 (81471925)

王千，女 (漢族)，博士研究生在讀.E-mail:a13934240453@163.com

劉偉，E-mail:liuwei@bjmu.edu.cn;王愛平，E-mail:wangap@medmail.com.cn

R 978.5

A

1673-3827(2016)11-0153-03