王守云, 霍韜光, 封　聰, 姜　泓, 馮雪松*

(1.中國醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院,遼寧 沈陽 110122;　2.中國醫(yī)科大學(xué) 公共衛(wèi)生學(xué)院,遼寧 沈陽 110122)

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LC-MS/MS 測定小鼠肝臟中甘草次酸含量

王守云1, 霍韜光2, 封聰2, 姜泓2, 馮雪松1*

(1.中國醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院,遼寧 沈陽 110122;2.中國醫(yī)科大學(xué) 公共衛(wèi)生學(xué)院,遼寧 沈陽 110122)

建立了LC-MS/MS測定小鼠肝臟中甘草次酸含量的方法. 本法以咖啡酸為內(nèi)標(biāo)物質(zhì)，采用多反應(yīng)監(jiān)測模式，對肝臟中甘草次酸進(jìn)行含量測定. 所建方法靈敏、準(zhǔn)確、可靠，具有線性范圍寬、專屬性強(qiáng)、基質(zhì)效應(yīng)低、回收率及穩(wěn)定性高的特點(diǎn)，可用于甘草次酸與雄黃聯(lián)合用藥小鼠肝臟中甘草次酸的含量測定.

LC-MS/MS；甘草次酸；咖啡酸；多反應(yīng)監(jiān)測；肝臟

甘草次酸(Glycyrrhetinic acid, GA)為甘草在體內(nèi)的主要代謝產(chǎn)物，具有抗腫瘤、抗炎抗菌、治療心血管疾病、免疫調(diào)節(jié)、抗HIV及腎上腺皮質(zhì)激素樣作用等多種藥理作用，能夠增加肝腎解毒功能[1-2]. 臨床上，甘草常與雄黃配伍使用，研究表明甘草次酸對雄黃具有“解毒”作用[3-4].

目前，采用液相色譜-質(zhì)譜法(LC-MS/MS)測定血漿中甘草酸鹽或甘草次酸濃度的測定方法已有文獻(xiàn)報(bào)道[5-7]，常選用白藜蘆醇、丙酸睪酮及甘草次酸甲酯等作為內(nèi)標(biāo)物質(zhì)，而采用咖啡酸作為內(nèi)標(biāo)物質(zhì)檢測肝臟中甘草次酸含量的研究鮮有報(bào)道. 本研究將選用咖啡酸為內(nèi)標(biāo)物，采用多反應(yīng)監(jiān)測模式建立LC-MS/MS測定小鼠肝臟中甘草次酸含量的方法，并將本法用于甘草次酸與雄黃聯(lián)合用藥小鼠肝臟中甘草次酸的含量測定，為探討甘草與雄黃配伍機(jī)制的研究提供研究思路.

1　實(shí)驗(yàn)部分

1.1儀器與試劑

1290型高效液相色譜儀(Agilent公司，美國)，6410型三重串聯(lián)四級桿質(zhì)譜儀(Agilent公司，美國)，CP124C全自動(dòng)電子天平(十萬分之一)(日本A&D公司)；3K-18型超速低溫冷凍離心機(jī)(Sigma公司)；超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)(寧波新芝生物科技股份有限公司)；XW-80A旋渦混合器(上海精科實(shí)業(yè)有限公司)；真空離心濃縮儀(湖南赫西儀器裝備有限公司)；Easypure純水系統(tǒng)(Barnstead公司，美國).

雄黃(產(chǎn)地，甘肅)，甘草次酸(上海源葉生物科技有限公司)，咖啡酸(中國藥品生物制品檢定所)，質(zhì)譜級乙腈(Sigma公司)，質(zhì)譜級甲醇(Sigma公司)，其他試劑均為分析純.

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1動(dòng)物處理

SPF級雄性ICR小鼠50只，體重(20±5) g，均由中國醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部提供. 標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)，小鼠自由攝食及飲水，實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性飼養(yǎng)1 w. 按照體重隨機(jī)分為5組，每組10只. 第1組為對照組，灌胃給予0.5%羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)水溶液；第2組為雄黃組，灌胃給予雄黃(1.35 g/kg)；第3組為甘草次酸對照組，灌胃給予甘草次酸48 mg/kg；第4組為甘草次酸低劑量聯(lián)合用藥組，灌胃給予甘草次酸(16 mg/kg)+雄黃(1.35 g/kg)；第5組為甘草次酸高劑量聯(lián)合用藥組，灌胃給予甘草次酸(48 mg/kg)+雄黃(1.35 g/kg). 每日灌胃1次，連續(xù)8 w. 每隔3 d稱量體重1次，調(diào)節(jié)灌胃容量. 于末次給藥24 h后，無水乙醚麻醉，冰浴取小鼠肝臟組織，預(yù)冷0.9%生理鹽水沖洗干凈，待用.

1.2.2甘草次酸標(biāo)準(zhǔn)溶液和內(nèi)標(biāo)溶液的配制

精密稱取甘草次酸對照品適量，用甲醇溶解，定容至100 mL，得濃度為336.0 mg/L的甘草次酸儲(chǔ)備液，備用. 精密吸取儲(chǔ)備液適量，稀釋成濃度為67.20、134.4、336.0、672.0、1 344、6 720 μg/L的標(biāo)準(zhǔn)系列液.

精密稱取咖啡酸對照品適量，用甲醇溶解，定容至100 mL，得濃度為900.0 μg/L的咖啡酸儲(chǔ)備液，備用. 臨用前，精密量取儲(chǔ)備液適量，稀釋成濃度為630 .0 μg/L的內(nèi)標(biāo)溶液.

1.2.3樣品溶液的制備

精密稱取小鼠肝臟200 mg，加入乙腈1.0 mL，超聲破碎2 min，得20%(質(zhì)量體積比)的肝組織勻漿液，然后向勻漿液中加入濃度為630.0 μg/L咖啡酸溶液200 μL，混勻，4 ℃離心10 min(12 000 r·min-1). 精密吸取上清液1.0 mL，濃縮至干，殘?jiān)砸译?水(80∶20，體積比)50 μL復(fù)溶后，4 ℃離心(2 000 r·min-1)5 min ，取上清液，進(jìn)樣分析.

1.2.4色譜條件和質(zhì)譜條件

ZORBAX SB-C18色譜柱(Agilent，4.6×100 mm，3.5 μm)，柱溫30 ℃，流動(dòng)相為乙腈-水(80∶20，體積比)，流速為1 mL/min，進(jìn)樣量為10 μL.

電噴霧(ESI)離子源，負(fù)離子模式，采用多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)方式，甘草次酸m/z為469.2→425.2，咖啡酸m/z為179.1→135.1. 毛細(xì)管電壓為3.5 kV，甘草次酸和咖啡酸的裂解電壓分別為200 V和110 V，碰撞電壓分別為38 V和15 V. 霧化器壓力為275.792 kPa，離子源溫度為350 ℃，保護(hù)氣流量為10 L/min.

1.2.5樣品測定

按“1.2.3”項(xiàng)下方法操作，測定對照組、雄黃組、甘草次酸對照組、甘草次酸低劑量聯(lián)合用藥組及甘草次酸高劑量聯(lián)合用藥組小鼠肝臟組織中甘草次酸的含量，并以當(dāng)日隨行的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算小鼠肝臟組織中甘草次酸的濃度.

1.2.6統(tǒng)計(jì)分析

所得數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，用SPSS 17.0軟件單因素方差分析方法(ANOVA)進(jìn)行各指標(biāo)組間差異的顯著性檢驗(yàn)，以P< 0.05作為檢驗(yàn)的顯著性差異.

2　結(jié)果與討論

2.1內(nèi)標(biāo)物的選擇

在內(nèi)標(biāo)物的選擇過程中，考查了與甘草次酸結(jié)構(gòu)類似的齊墩果酸、熊果酸、熊去氧膽酸及咖啡酸. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，咖啡酸與待測物受內(nèi)源物質(zhì)干擾及試劑、儀器等因素的影響相近，且色譜分離時(shí)間短，出峰時(shí)間僅為0.927 min. 甘草次酸及內(nèi)標(biāo)物咖啡酸在MRM監(jiān)測中信號無相互干擾，最終選擇咖啡酸作為內(nèi)標(biāo)物.

2.2色譜及質(zhì)譜條件的優(yōu)化

乙腈-水和甲醇-水作為反相液相色譜常用的流動(dòng)相，對待測分析物的色譜保留時(shí)間有較大影響，且流動(dòng)相的組成與分離度及待測物的離子化程度有關(guān). 實(shí)驗(yàn)過程中，為了使分析方法的靈敏度更高，考察了兩個(gè)流動(dòng)相體系對它們的影響. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，使用乙腈-水作為流動(dòng)相的色譜峰形對稱，且化合物出峰時(shí)間快，總體分析時(shí)間短. 實(shí)驗(yàn)又探討了流動(dòng)相中加入不同濃度(體積比0.1%、0.2%)甲酸及不加甲酸對待測物的靈敏度及色譜峰形的影響，結(jié)果表明甲酸對色譜峰形及靈敏度并無明顯影響. 最終，流動(dòng)相選擇乙腈-水(80∶20，體積比).

結(jié)果顯示，負(fù)離子檢測較正離子檢測模式信號強(qiáng)度大，最終選擇負(fù)離子檢測模式. 對甘草次酸及內(nèi)標(biāo)物咖啡酸進(jìn)行一級全掃描，甘草次酸和咖啡酸的分子離子峰[M-H]-m/z分別為469.2和179.1，選擇其作為母離子進(jìn)行二級全掃描，最終選擇m/z為469.2→425.2及179.1→135.1分別為甘草次酸和咖啡酸MRM分析的定量離子對.

在質(zhì)譜條件優(yōu)化中，毛細(xì)管出口電壓(fragmentor voltage)及碰撞能(collision energy)對信號影響顯著. 因此在本文中仔細(xì)考察了毛細(xì)管出口電壓在15～150 V之間及碰撞能在5～25 V之間對甘草次酸和咖啡酸信號強(qiáng)度的影響. 結(jié)果表明，在200 V毛細(xì)管出口電壓、38 V碰撞能下，能夠得到離子強(qiáng)度合適的甘草次酸子離子；在110 V毛細(xì)管出口電壓、15 V碰撞能下，能夠得到離子強(qiáng)度合適的咖啡酸離子.

2.3方法的專屬性

由圖1可見，甘草次酸和咖啡酸的保留時(shí)間分別為3.265和0.927 min，咖啡酸可作為測定甘草次酸含量的內(nèi)標(biāo)物質(zhì). 小鼠肝組織中其他內(nèi)源性物質(zhì)不干擾甘草次酸和咖啡酸的分離. 結(jié)果表明，該方法具有良好專屬性.

2.4標(biāo)準(zhǔn)曲線和線性范圍、精密度、準(zhǔn)確度、基質(zhì)效應(yīng)及回收率

取6只對照組小鼠混合肝組織勻漿液，分別加入甘草次酸系列對照品溶液和咖啡酸內(nèi)標(biāo)溶液，在優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件下，利用建立的LC-MS/MS聯(lián)用系統(tǒng)進(jìn)行分析，采用峰面積積分. 以甘草次酸和咖啡酸內(nèi)標(biāo)物色譜峰面積比值為縱坐標(biāo)，以甘草次酸濃度為橫坐標(biāo)，采用加權(quán)最小二乘法線性回歸，求得回歸方程. 小鼠肝臟組織中甘草次酸的線性回歸方程為y=0.113 61x+1.703 5(r=0.999 8)，結(jié)果表明甘草次酸在9.600～960.0 μg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好.

A.對照組色譜圖;B.甘草次酸標(biāo)準(zhǔn)色譜圖;C.甘草次酸高劑量聯(lián)合用藥組色譜圖.圖1　甘草次酸肝臟樣品的LC-MS/MS色譜圖Fig.1　LC-MS/MS chromatogram of Glycyrrhetinic acid in liver samples

在優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件下，由表1可見，方法的精密度、準(zhǔn)確度及回收率較好，基質(zhì)效應(yīng)較低. 低、中、高三個(gè)濃度的質(zhì)控(QC)樣品的日內(nèi)、日間精密度在0.1%～4.1%之間，準(zhǔn)確度在0.1%～6.7%之間. 甘草次酸的基質(zhì)效應(yīng)在103.5%～104.2%之間(RSD在0.8%～5.3%之間)，咖啡酸的基質(zhì)效應(yīng)為95.27%(RSD=7.2%). 草次酸的提取回收率在97.1%～102.4%之間，內(nèi)標(biāo)物咖啡酸的提取回收率為104.96%(RSD=7.6%).

表1　小鼠肝臟組織中甘草次酸測定方法的精密度、準(zhǔn)確度、基質(zhì)效應(yīng)及回收率

2.5樣品穩(wěn)定性考察結(jié)果

在優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件下，三個(gè)濃度的QC樣品，經(jīng)3次冷凍-解凍循環(huán)后(-20～20 ℃)、室溫放置24 h及-20 ℃儲(chǔ)存30 d. 由表2可見穩(wěn)定性良好.

2.6應(yīng)用及討論

結(jié)果表明，甘草次酸對照組、甘草次酸低劑量聯(lián)合用藥組、甘草次酸高劑量聯(lián)合用藥組中甘草次酸的含量分別為(3 730.4±1 016.2) ng/g、(317.0±188.9) ng/g和(1 158.4±176.1) ng/g，對照組未檢出甘草次酸. 甘草次酸高劑量組、甘草次酸對照組與甘草次酸低劑量組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05).

表2　小鼠肝臟組織中甘草次酸的穩(wěn)定性考察

與甘草次酸對照組比較，甘草次酸聯(lián)合用藥組小鼠肝臟中甘草次酸的含量明顯降低(P<0.05)，甘草次酸與雄黃高劑量聯(lián)合用藥組的甘草次酸含量明顯高于甘草次酸低劑量聯(lián)合用藥組(P<0.05).

雄黃的毒性源于雄黃中的砷可被機(jī)體吸收，并在體內(nèi)(如腦、肝臟、腎臟)蓄積[8-11]，而長期服用含雄黃制劑易引起藥源性慢性砷中毒，造成肝臟損害[12]. 臨床上，雄黃常與甘草配伍使用. 甘草為國老藥，具有調(diào)和諸藥的作用，對雄黃的毒性也有一定的解毒作用[3]. 本研究表明，甘草次酸與雄黃聯(lián)合用藥后，肝臟中甘草次酸含量明顯降低，可能是砷與甘草次酸結(jié)合，使肝臟中游離態(tài)的甘草次酸含量減少，這可能也是甘草次酸對雄黃起解毒作用的原因之一，具體機(jī)制有待進(jìn)一步探討.

3　結(jié)論

采用LC-MS/MS法，以咖啡酸為內(nèi)標(biāo)物質(zhì)，通過MRM負(fù)離子模式監(jiān)測，對甘草次酸與雄黃聯(lián)合用藥組小鼠肝臟組織中的甘草次酸進(jìn)行含量測定，建立了肝臟中甘草次酸的含量測定方法，為甘草與雄黃配伍機(jī)制的研究提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù).

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[責(zé)任編輯：吳文鵬]

Determination of glycyrrhetinic acid in liver of mice by LC-MS/MS

WANG Shouyun1, HUO Taoguang2, FENG Cong2, JIANG Hong2, FENG Xuesong1*

(1.CollegeofPharmacy,ChinaMedicalUniversity,Shenyang110122,Liaoning,China;2.CollegeofPublicHealth,ChinaMedicalUniversity,Shenyang110122,Liaoning,China)

A method of LC-MS/MS was established for the determination of glycyrrhetinic acid in liver of mice. Multiple reaction monitoring(MRM) scanning mode was used for the quantification with caffeic acid as the internal standard (IS). The method was validated for sensitivity, precision, reliability, a wide linear range, strong specificity, low matrix effect, high recovery and stability. The method was successfully applied for the determination of glycyrrhetinic acid in liver of mice combined treated with glycyrrhetinic acid and realgar.

LC-MS/MS; glycyrrhetinic acid; caffeic acid; multiple reaction monitoring; liver

1008-1011(2016)04-0429-04

2016-01-11.

國家自然科學(xué)基金(81473417, 81403066).

王守云(1991-), 女, 碩士生, 研究方向?yàn)樗幬锓治?*通訊聯(lián)系人, E-mail: voncedar@126.com.

R286.02

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