鄧燕， 文思雨， 皮毅兵， 蔣倩婷， 梁敏， 劉亮亮， 郭雨芳， 嚴(yán)奉梅， 張春香， 申有名，鄭清云， 張向陽(yáng)

一種水溶性探針的合成及對(duì)雙氧水的比色熒光檢測(cè)

鄧燕， 文思雨， 皮毅兵， 蔣倩婷， 梁敏， 劉亮亮， 郭雨芳， 嚴(yán)奉梅， 張春香， 申有名，鄭清云， 張向陽(yáng)

（湖南文理學(xué)院 化學(xué)化工學(xué)院， 湖南 常德， 415000）

以4-溴-1， 8-萘二甲酸酐為原料， 經(jīng)過(guò)Suzuki偶聯(lián)反應(yīng)、氨解反應(yīng)， 合成了一種水溶性的熒光探針， 其結(jié)構(gòu)經(jīng)過(guò)1H NMR、MS進(jìn)行了表征。利用熒光光譜、紫外光譜探討了該探針對(duì)雙氧水響應(yīng)的性能。結(jié)果表明，該探針在純水中對(duì)雙氧水具有高選擇性、高靈敏性， 雙氧水濃度在 3.3×10-8～1×10-4mol/L范圍內(nèi)探針對(duì)雙氧水具有較好的線性， 檢測(cè)下限為0.1 μg/mol。

熒光探針； 雙氧水； 比色； 合成

1　 實(shí)驗(yàn)

1.1 儀器與試劑

核磁共振分析采用Bruker AVB-500測(cè)定， 質(zhì)譜采用Agilent1100型液質(zhì)聯(lián)用儀測(cè)定， 紫外光譜吸光度采用UV2500測(cè)定， 熒光光譜強(qiáng)度采用FL-7000熒光光譜儀測(cè)定?；衔?按照文獻(xiàn)［16］的方法合成， 其它試劑均為分析純。

1.2 化合物2的合成

向100 mL單口瓶中加入化合物1 （0.32 g， 1 mmol）、6-氨基正己酸（0.26 g， 2 mmol）和無(wú)水乙醇（5 mL）， 氮?dú)獗Ｗo(hù)下， 加熱攪拌回流12 h。TLC（薄層色譜）跟蹤反應(yīng)進(jìn)程， 反應(yīng)完畢， 冷卻至常溫， 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀除去溶劑， 粗品柱層析分離（V二氯甲烷∶V甲醇= 20∶1）得到白色固體化合物2 （0.41 g， 產(chǎn)率93%）?；衔?的核磁表征1H NMR （500 MHz， CDCl3） δ （ppm）： 9.10 （d， J = 8.5 Hz，1H）， 8.59 （d， J = 7.0 Hz，1H），8.55 （d， J =7.0 Hz， 1H）， 8.28 （d， J = 7.0 Hz，1H）， 7.76 （d， J = 8.5 Hz，1H）， 4.18 （t， J = 7.5 Hz，2H）， 2.38 （t， J = 7.5 Hz，2H）， 1.71-1.78 （m，4H）， 1.47- 1.52 （m，2H）， 1.45 （s，12H）；13C NMR （125 MHz， CDCl3） δ （ppm）：178.3， 164.3， 164.3， 135.8， 135.3， 135.0， 131.3， 131.0， 129.9， 127.9，127.1， 127.0， 124.7， 84.6， 40.2， 33.7，27.7， 26.6， 25.0， 24.4； ESI-MS calcd for C24H28BNO6［M + 1］+ 438.293 2， found 438.208 2?；衔?的具體合成路線如圖1所示， 其1H NMR譜圖、13C NMR譜圖和質(zhì)譜圖分別見圖2、3和4。

圖1　化合物2的合成路線

圖2　化合物2的1H NMR譜圖

圖3　化合物2的13C NMR譜圖

圖4　化合物2的質(zhì)譜譜圖

1.3測(cè)試過(guò)程

準(zhǔn)確稱取NaH2PO4·2H2O 0.39 g， Na2HPO4·12H2O 3.58 g和NaCl 0.73 g置于250 mL燒杯中， 然后溶解調(diào)節(jié)pH值， 最后定容至250 mL容量瓶， 得到50 mg/mol pH值為7.4的PBS緩沖溶液。

準(zhǔn)確稱取一定量的化合物2， 將其溶于PBS緩沖溶液（50 mg/mol， pH值為7.4）中配成200 μg/mol的母液待用。然后將 PBS緩沖溶液配成不同濃度的探針溶液。將事先準(zhǔn)備好的雙氧水加入到探針溶液中， 混合均勻， 在室溫下進(jìn)行測(cè)試。以468 nm為激發(fā)波長(zhǎng)， 激發(fā)光狹縫寬度10 nm， 發(fā)射光狹縫寬度10 nm， 根據(jù)化合物2在445 nm激發(fā)下的熒光強(qiáng)度來(lái)定量分析雙氧水。

2　結(jié)果與討論

2.1化合物2的光譜性質(zhì)

2.1.1紫外光譜

圖5記錄的是探針1 （5 μg/mol）在室溫條件下，加入雙氧水前后的紫外光譜圖。由圖 5可看出， 在雙氧水加入前， 探針1在350 nm時(shí)吸光度最大， 加入雙氧水之后， 紫外光譜在 445 nm有一個(gè)新的吸收峰出現(xiàn)， 探針溶液的顏色由無(wú)色變成了黃色。探針 1在加入雙氧水前后的紫外吸收紅移了 95 nm，這可能是由于化合物2中的硼酸酯與雙氧水發(fā)生了反應(yīng)， 化合物2分子中出現(xiàn)了分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移（ICT）引起的。

圖5　化合物1中加入雙氧水前后的紫外光譜圖

2.1.2熒光光譜

圖6是化合物2的熒光強(qiáng)度隨雙氧水濃度變化的熒光圖。從圖 6可以看出， 化合物 2本身在 557 nm處只有微弱的熒光。加入H2O2后， 在557 nm處熒光強(qiáng)度隨著雙氧水濃度的增大而增強(qiáng)。這表明，雙氧水能夠與化合物 2發(fā)生反應(yīng)， 其對(duì)雙氧水濃度檢測(cè)范圍為3.3 × 10-8～1.0 × 10-4mol/L， 檢測(cè)下限為0.1 μg/mol。

圖6　化合物2的熒光強(qiáng)度與雙氧水濃度的變化關(guān)系

2.1.3選擇性考察

為了研究探針在模擬生理?xiàng)l件（pH值為 7.4）對(duì)雙氧水具有高度的選擇性。用化合物2分別對(duì)一系列的活性氧、活性氮物質(zhì)如O2-， OH，1O2， ONOO-，NO， ClO-， H2O2，tBuOOH進(jìn)行檢測(cè)。如圖 7所示，化合物 2對(duì)雙氧水有明顯響應(yīng)， 而其他分析物與化合物 2沒有響應(yīng)。這表明， 探針對(duì)雙氧水具有高度的選擇性， 不會(huì)受其他物質(zhì)干擾， 因此， 探針可以檢測(cè)生物環(huán)境中的雙氧水。

圖7　化合物2對(duì)雙氧水的選擇性

2.1.4pH值考察

為了研究 pH值對(duì)反應(yīng)的影響， 考察了加入雙氧水后探針在不同 pH值溶液中的熒光性質(zhì)。如圖8所示， 當(dāng)加入雙氧水后， 化合物 2的熒光強(qiáng)度隨pH值的變化而變化。結(jié)果表明， 化合物2可以在生理pH值條件下檢測(cè)雙氧水。

2.1.5時(shí)間考察

反應(yīng)時(shí)間也是影響反應(yīng)體系的一個(gè)非常重要的因素， 因此考察了在雙氧水存在下化合物 2隨時(shí)間變化的熒光光譜（圖9）。圖9表明， 化合物2的熒光強(qiáng)度會(huì)隨著時(shí)間的推移而增強(qiáng)， 在40 min時(shí)熒光強(qiáng)度增強(qiáng)到最大值， 然后基本保持不變。因此， 探針能夠很好地實(shí)時(shí)檢測(cè)雙氧水。

圖8　pH值對(duì)化合物2的影響

圖9　化合物2中加入雙氧水后熒光強(qiáng)度隨時(shí)間的變化

3　結(jié)論

本文設(shè)計(jì)合成了一種新型用于雙氧水檢測(cè)的硼酸酯熒光探針， 利用熒光光譜和紫外光譜研究了其對(duì)雙氧水響應(yīng)的性能。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明， 該探針能夠選擇性檢測(cè)雙氧水， 探針隨著雙氧水濃度的增大熒光強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)， 且在實(shí)現(xiàn)熒光增強(qiáng)檢測(cè)雙氧水的同時(shí)還能實(shí)現(xiàn)比色檢測(cè)。因此， 該方法給雙氧水的檢測(cè)提供了新的思路。

［1］ Hachem C， Bocquillon F， Zahraa O， et al. Decolourization of textile industry wastewater by the photocatalytic degradation process ［J］. Dyes Pigm， 2001， 49： 117-125.

［2］ Balaban R S， Nemoto S， Finkel T. Mitochondria， oxidants， and aging ［J］. Cell， 2005， 120： 483-495.

［3］ Rhee S G. H2O2， a necessary evil for cell signaling ［J］. Science， 2006， 312： 1 882-1 883.

［4］ Lin M T， Beal M F. Mitochondrial dysfunction and oxidative stress in neurodegenerative diseases ［J］. Nature， 2006， 443：787-795.

［5］ Mattson M P. Pathways towards and away from Alzheimer’s disease ［J］. Nature， 2004， 430： 631-639.

［6］ Ohshima H， Tatemichi M， Sawa T. Arch Chemical basis of inflammation-induced carcinogenesis ［J］. Biochem Biophys，2003， 417： 3-11.

［7］ Klassen N V， Marchington D， McGowan H C E. H2O2determination by the 13 method and by KMnO4titration ［J］. Anal Chem， 1994， 66： 2 921-2 925.

［8］ Xu M， Bunes B R， Zang L. Paper-based vapor detection of hydrogen peroxide： colorimetric sensing with tunable interface ［J］. ACS Appl Mater Interfaces， 2011， 3： 642-647.

［9］ Yuan P X， Zhuo Y， Chai Y Q， et al. Dendritic silver/silicon dioxide nanocomposite modified electrodes for electrochemical sensing of hydrogen peroxide ［J］. Electroanalysis， 2008， 20： 1 839-1 844.

［10］ Shan G， Zheng S， Chen S P， et al. Detection of label-free H2O2based on sensitive Au nanorods as sensor ［J］. Colloids Surf B， 2013， 102： 327-330.

［11］ Shu X H， Chen Y， Yuan H Y， et al. H2O2Sensor based on the room-temperature phosphorescence of nano TiO2/SiO2composite ［J］. Anal Chem， 2007， 79： 3 695-3 702.

［12］ Qian Y Y， Xue L， Hu D X， et al. Quinoline-based fluorescent probe for ratiometric detection of hydrogen peroxide in aqueous solution ［J］. Dyes and Pigments， 2012， 9： 373-376.

［13］ Xu J， Li Q， Yue Y， et al. A water-soluble BODIPY derivative as a highly selective “Turn-On” fluorescent sensor for H2O2sensing in vivo ［J］. Biosensors and Bioelectronics， 2014， 56： 58-63.

［14］ Sun X L， Xu S Y， Flower S E， et al. “Integrated” and “insulated” boronate-based fluorescent probes for the detection of hydrogen peroxide ［J］. Chem Commun， 2013， 49： 8 311-8 313.

［15］ Yu F B， Li P， Song P， et al. Facilitative functionalization of cyanine dye by an on-off-on fluorescent switch for imaging of H2O2oxidative stress and thiols reducing repair in cells and tissues ［J］. Chem Commun， 2012， 48： 4 980-4 982.

（責(zé)任編校： 劉曉霞）

Synthesis of a water solution probe and fluorescence and colorimetric sensor for detection of H2O2

Deng Yan， Wen Siyu， Pi Yibing， Jiang Qianting， Liang Ming， Liu Liangliang， Guo Yufang， Yan Fengmei， Zhang Chunxiang， Shen Youming， Zheng Qingyu， Zhang Xiangyang
（Department of Chemistry and Chemical Engineering， Hunan University of Arts and Science， Changde 415000，China）

A water solution fluorescent probe is synthesized via Suzuki coupling reaction， oxidative reaction，ammonolysis reaction from 4-bromo-1， 8-naphthalic anhydride. Its structure is characterized by1H NMR and MS. The spectroscopic properties， the target probe with H2O2is investigated by the fluorescence spectrum and ultraviolet spectrum. The results show that the probe can detect H2O2.The compound displays off/on ratio singles，highly selective and sensitive towards H2O2in 100% water. The fluorescence intensity is proportional to the concentration of glucose over a range of 3.3 × 10-8～1 × 10-4mol/L， with a limit of detection of 0.1 μg/mol.

fluorescent probe； H2O2； colorimetric； synthesis

O 657.3

1672-6146（2016）03-0006-04

10.3969/j.issn.1672-6146.2016.03.002

張春香， cxzhang81@163.com； 申有名， ymshen79@163.com。

2016-03-17

湖南省教育廳一般項(xiàng)目（15C0954）； 湖南文理學(xué)院科學(xué)研究項(xiàng)目（14YB05）； 湖南文理學(xué)院大學(xué)生創(chuàng)新項(xiàng)目； 湖南省十二五重點(diǎn)建設(shè)學(xué)科——應(yīng)用化學(xué)資助。不利于應(yīng)用［14-15］。因此， 研制一種快速、簡(jiǎn)單、水溶性高以及對(duì)雙氧水響應(yīng)的熒光探針是十分必要的。本實(shí)驗(yàn)合成了一種簡(jiǎn)單的、水溶性熒光探針， 該探針在雙氧水的存在下可以實(shí)現(xiàn)比色和熒光增強(qiáng)檢測(cè)， 相對(duì)單一的熒光探針， 比色、熒光增強(qiáng)雙通道熒光探針能夠有效、簡(jiǎn)單、方便地檢測(cè)生物體內(nèi)活性物質(zhì)。

雙氧水參與細(xì)胞生長(zhǎng)調(diào)節(jié)、重要物質(zhì)的合成和代謝、能量轉(zhuǎn)化及細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)［1-4］， 但其濃度過(guò)大又會(huì)對(duì)體內(nèi)的蛋白質(zhì)、核酸等產(chǎn)生不同程度的損傷， 導(dǎo)致一些疾?。?-6］。因此， 準(zhǔn)確及時(shí)地檢測(cè)雙氧水對(duì)一些疾病的預(yù)防和診斷具有重要的意義。目前， 對(duì)雙氧水的檢測(cè)方法比較多， 如滴定法［7］、比色法［8］、電化學(xué)法［9］、博層色譜法［10］以及熒光分析法［11］等。在這些檢測(cè)方法中， 熒光探針檢測(cè)法由于在物質(zhì)的檢測(cè)中可達(dá)到單分子檢測(cè)的高靈敏度， 所以能夠?qū)崿F(xiàn)開關(guān)操作以及人與分子的直接通訊， 對(duì)亞微粒具有可視的亞納米空間分辨能力和亞毫秒時(shí)間分辨能力。作為一種靈敏度高、選擇性好、檢出限低的微量分析技術(shù)， 熒光探針還可以對(duì)單（多）種對(duì)象進(jìn)行實(shí)時(shí)、在線檢測(cè)， 克服了傳統(tǒng)環(huán)境檢測(cè)分析手段樣品預(yù)處理過(guò)程繁瑣冗長(zhǎng)、成本高、不能實(shí)時(shí)在線分析的缺點(diǎn)， 因而受到科學(xué)家的廣泛關(guān)注［12-13］。然而， 已報(bào)道的熒光探針對(duì)雙氧水的檢測(cè)大多存在反應(yīng)時(shí)間長(zhǎng)、合成過(guò)程復(fù)雜以及低水溶性等問(wèn)題，