汪永忠，洪燕，李鈺馨，，韓燕全

（1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院國家中醫(yī)藥管理局中藥制劑三級實驗室，安徽合肥230031；2.安徽中醫(yī)藥大學(xué)，安徽合肥230012）

蒼耳子水提取液對小鼠肝毒性“量-時-毒”關(guān)系研究

汪永忠1，洪燕2，李鈺馨1，2，韓燕全1

（1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院國家中醫(yī)藥管理局中藥制劑三級實驗室，安徽合肥230031；2.安徽中醫(yī)藥大學(xué)，安徽合肥230012）

●“實驗”雖然是現(xiàn)代科學(xué)研究常用的方法，然在我國卻自古有之。古代學(xué)者王沖說“等類眾多，行事比肩，略舉較著，以定實驗也”，顏之推說“昔在江南，不信有千人帳，及來河北，不信有二萬斛船，皆實驗也”，大凡此義均與現(xiàn)代科學(xué)意義上的experiment相通。照此，傳統(tǒng)中醫(yī)藥學(xué)并非只是經(jīng)驗之學(xué)，而更充滿實驗的思想和方法。實驗中醫(yī)藥學(xué)，將現(xiàn)代實驗科學(xué)的方法和傳統(tǒng)中醫(yī)藥學(xué)的實驗方法融合起來，開拓現(xiàn)代實驗生物學(xué)、醫(yī)學(xué)和藥物科學(xué)的新領(lǐng)域。

目的：考察蒼耳子水提物單次給予對小鼠肝毒性的“量-時-毒”關(guān)系。方法：將小鼠按不同時間點和不同劑量分組，觀察小鼠急性肝毒性反應(yīng)，檢測血清谷氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、谷草氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）水平，計算肝體比值，光學(xué)顯微鏡下觀察肝組織病理形態(tài)變化。結(jié)果：“時-毒”關(guān)系研究表明：制備4.0 g/mL蒼耳子水提液，取小鼠按不同時間點分組，按101.14 g/kg劑量小鼠灌胃給藥一次，分別于給藥后各時間點取血，小鼠血清ALT，AST均在給藥1 h后明顯升高，給藥后8 h達(dá)到高峰，24 h后恢復(fù)近正常值；肝體比值增大，肝組織病理損傷嚴(yán)重；“量-毒”關(guān)系研究表明：小鼠單次灌胃給藥不同劑量（101.14 g/kg、83.312 g/kg、66.650 g/kg、53.320 g/kg、42.656 g/kg、空白組同體積蒸餾水）。蒼耳子水提液對肝組織產(chǎn)生明顯損傷，隨劑量增大，血清ALT，AST值顯著升高。肝體比值增大，肝組織病理損傷嚴(yán)重。結(jié)論：小鼠單次灌胃給藥蒼耳子水提取液可造成明顯急性肝損傷，并呈現(xiàn)一定“量-時-毒”關(guān)系。

蒼耳子水提液；肝毒性；時毒；量毒

中藥蒼耳子為菊科植物蒼耳（Xanthium sibirium Patr.）的干燥成熟帶總苞的果實，收載于歷版《中華人民共和國藥典》，味辛、苦，性溫，有毒，歸肺經(jīng)。蒼耳子水提取物臨床應(yīng)用于治療鼻竇炎和頭痛，也用于治療中耳炎、過敏性鼻炎和臭鼻癥等［1-2］。課題組前期研究表明蒼耳子水提物對于小鼠具有抗炎和鎮(zhèn)痛等藥理作用，但蒼耳子屬傳統(tǒng)記載的確有療效的有毒中藥，臨床有因長期、過量、反復(fù)使用或者炮制不當(dāng)或者未經(jīng)炮制使用而導(dǎo)致中毒，甚至屢有死亡的報道。研究表明，蒼耳子的使用不當(dāng)容易導(dǎo)致不同器官的損害，尤其是肝臟，以及輕微程度的心肌和腎臟損傷。大鼠在給藥4 w后，血清中丙氨酸氨基轉(zhuǎn)氨酶、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)氨酶和堿性磷酸酶顯著增加［3-4］。蒼耳子中蒼術(shù)苷與羧基蒼術(shù)苷等水溶性苷類成分可影響脂肪酸及氨基酸代謝從而產(chǎn)生肝臟毒性［5］。

蒼耳子作為臨床常用中藥，其化學(xué)成分和藥理作用已經(jīng)得到廣泛的研究，但對于蒼耳子的毒性作用研究較少，為進(jìn)一步明確蒼耳子水提物的肝臟毒性特點及其“時間窗”和“劑量窗”，本實驗對蒼耳子藥材的水提組分給小鼠單次灌胃所致急性肝毒性的“量-時-毒”關(guān)系進(jìn)行了研究，以期為該中藥臨床合理安全用藥提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物昆明種小鼠，18~22 g，適齡，健康，雌雄各半，共240只，購于安徽醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心。

1.1.2 實驗藥物蒼耳子藥材購于合肥深南中藥飲片有限公司，批號：120909。經(jīng)安徽中醫(yī)藥大學(xué)彭華勝教授鑒定為菊科植物蒼耳的成熟帶總苞的果實。取蒼耳子藥材600 g，適當(dāng)粉碎后加水煎煮，第1次為10倍量水，煎煮1.5 h，收集濾液；第2次加入8倍量水，煎煮1 h，收集濾液；合并2次濾液，加熱濃縮至濃度為4 g/m L，冷凍保存，備用。

1.1.3 試劑與儀器谷丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT/ GPT）試劑盒，批號：C009-2；谷草氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST/GOT）試劑盒，批號：C010-2，上述試劑均由南京建成生物科技有限公司提供。Thermo Scientific Multiscan GO 1510全波長酶標(biāo)儀，美國賽默飛世爾科技有限公司；BS2005電子天平，德國Sartorius公司；KDC-16H高速離心機(jī)，科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司。

1.2 實驗方法

課題組前期研究表明，蒼耳子小鼠灌胃給藥的LD50為329.92 g/kg，95%可信區(qū)間為303.42~ 359.06 g/kg，設(shè)定“時-毒”關(guān)系研究給藥劑量為101.14 g/kg；“量-毒”關(guān)系研究各給藥劑量組分別為101.140 g/kg、83.312 g/kg、66.650 g/kg、53.32 g/kg、42.656 g/kg，空白對照組給予等體積蒸餾水灌胃，均按25mL/kg體積灌胃。

1.2.1 蒼耳子水提物相同劑量單次給藥對小鼠肝毒性“時-毒”關(guān)系研究取小鼠，隨機(jī)分為12組，按處理時間點依次為0 h（正常對照組）、20min、40 min、1 h、2 h、3 h、4 h、8 h、12 h、24 h、48 h、72 h組。正常對照組小鼠蒸餾水灌胃，其余各組按101.14 g/kg生藥濃度灌胃。于相應(yīng)時間點稱量小鼠體質(zhì)量，摘眼球取血，3 000 rpm離心10min。采用所購買試劑盒，按照試劑盒說明書，以生化分析儀測定血清ALT、AST水平。取肝臟稱重，計算臟器系數(shù)；另取一部分肝組織，常規(guī)HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察其組織形態(tài)學(xué)變化。

1.2.2 蒼耳子水提物相同劑量單次給藥對小鼠肝毒性“量-毒”關(guān)系研究取小鼠，隨機(jī)分為6組，按劑量分別為101.140 g/kg、83.312 g/kg、66.650 g/kg、53.320 g/kg、42.656 g/kg及正常對照組。給藥8 h后，按1.2.1項下方法測量血清ALT、AST水平，計算臟器系數(shù)；另取一部分肝組織，光學(xué)顯微鏡下觀察其組織形態(tài)學(xué)變化。

2 結(jié)果

2.1 蒼耳子水提物相同劑量單次給藥對小鼠肝毒性“時-毒”關(guān)系

2.1.1 蒼耳子水提物對小鼠血清ALT、AST活力的影響空白對照組（0 h）小鼠血清ALT、AST水平均在正常范圍內(nèi)；給藥后20min～48 h，藥物組小鼠血清ALT、AST值均有不同程度升高，與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），結(jié)果見表1、圖1。

表1 蒼耳子水提物對小鼠肝毒性“時-毒”關(guān)系血清ALT和AST的影響（±s）

表1 蒼耳子水提物對小鼠肝毒性“時-毒”關(guān)系血清ALT和AST的影響（±s）

注：與0 h比較，1）P＜0.05

時間n ALT（IU/L）AST（IU/L）0 h 10 35.67±1.27 49.73±1.02 20min 10 38.59±1.181）55.53±1.521）40 min 10 40.71±1.291）75.90±1.361）1 h 10 51.30±1.431）85.56±1.481）2 h 10 55.15±1.401）91.02±1.001）3 h 10 58.86±1.231）92.47±2.981）4 h 10 68.23±1.691）99.93±1.691）8 h 10 84.77±1.001）114.43±1.561）12 h 10 48.00±1.961）86.20±1.571）24 h 10 43.32±1.171）77.15±1.301）48 h 10 35.33±1.40 54.14±0.951）72 h 10 35.35±1.38 48.63±1.06

圖1 蒼耳子水提物對小鼠肝毒性“時-毒”ALT和AST變化曲線

2.1.2 對小鼠肝臟指數(shù)的影響給藥8 h后小鼠即可出現(xiàn)肝臟明顯腫大，肝指數(shù)升高，其中8～24 h肝臟指數(shù)升高最為明顯（P＜0.01），結(jié)果見表2。

表2 蒼耳子水提物對小鼠肝毒性“時-毒”關(guān)系肝臟指數(shù)的影響（±s）

表2 蒼耳子水提物對小鼠肝毒性“時-毒”關(guān)系肝臟指數(shù)的影響（±s）

注：與0 h比較，1）P＜0.05，2）P＜0.01

不同時間肝臟指數(shù)（g/100 g）不同時間肝臟指數(shù)（g/100 g）0 h 4.081±0.019 4 h 5.309±0.0972）20min 4.359±0.0422）8 h 5.451±0.0492）40min 4.445±0.0742）12 h 5.290±0.1102）1 h 4.509±0.0462）24 h 5.018±0.0992）2 h 4.603±0.0622）48 h 4.125±0.032 3 h 5.273±0.0412）72 h 4.147±0.0761）

2.1.3 對小鼠肝組織形態(tài)的影響光鏡下觀察，正常對照組肝小葉結(jié)構(gòu)清晰完好，肝細(xì)胞未見明顯變性、壞死；給藥20min后，可見肝小葉結(jié)構(gòu)尚正常，肝細(xì)胞水腫、變性，大部分細(xì)胞固縮深染，出現(xiàn)氣球樣變、嗜酸性變與脂肪變，與正常對照組比較差異明顯。結(jié)果見圖2。

2.2 蒼耳子水提物相同劑量單次給藥對小鼠肝毒性“量-毒”關(guān)系

2.2.1 蒼耳子水提物對小鼠血清ALT、AST活力的影響正常對照組（0 h）小鼠血清ALT、AST水平均在正常范圍內(nèi)，藥物組小鼠血清ALT、AST值均有不同程度升高，與正常照組相比，5個劑量組的小鼠血清ALT、AST值均不同程度的升高（P＜0.01）。結(jié)果見表3、圖3。

2.2.2 對小鼠肝臟指數(shù)的影響蒼耳子水提物各劑量組肝臟指數(shù)均顯著性升高，與正常對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），結(jié)果見表4。

表3 蒼耳子水提物對小鼠肝毒性“量-毒”關(guān)系血清ALT和AST的影響（±s）

表3 蒼耳子水提物對小鼠肝毒性“量-毒”關(guān)系血清ALT和AST的影響（±s）

注：與正常對照組比較，1）P＜0.01

組別n劑量（g/kg）ALT（IU/L）AST（IU/L）正常對照組10-22.20±0.79 66.19±1.58 42.656 37.35±1.121）105.68±1.011）53.320 39.10±1.241）115.84±0.841）66.650 51.85±1.841）122.27±1.091）83.312 66.98±1.451）155.36±1.131）101.14 64.93±1.041）153.32±1.001）蒼耳子水提物10

圖3 蒼耳子水提物對小鼠肝毒性“量-毒”ALT和AST變化曲線

表4 蒼耳子水提物對小鼠肝毒性“量-毒”關(guān)系肝臟指數(shù)的影響（±s）

表4 蒼耳子水提物對小鼠肝毒性“量-毒”關(guān)系肝臟指數(shù)的影響（±s）

注：與正常對照組比較，1）P＜0.01

劑量（g/kg）肝臟指數(shù)（g/100g）劑量（g/kg）肝臟指數(shù)（g/100g）0 4.292±0.088 66.650 5.805±0.1281）42.656 5.325±0.1351）83.312 6.233±0.1021）53.320 5.495±0.4231）101.140 5.935±0.1341）

2.2.3 對小鼠肝組織形態(tài)的影響給藥8 h后，觀察小鼠肝細(xì)胞形態(tài)，可見肝小葉結(jié)構(gòu)尚正常，肝細(xì)胞明顯腫大，出現(xiàn)氣球樣變與脂肪變，部分灶狀壞死或點狀壞死，與正常對照組比較差異明顯。結(jié)果見圖4。

3 討論

圖2 蒼耳子水提液小鼠肝毒性“時-毒”關(guān)系研究病理照片（HE染色，10×20）

圖4 蒼耳子水提液小鼠肝毒性“量-毒”關(guān)系研究病理照片（HE染色，10×20）

蒼耳子為歷代治療鼻淵及頭痛的要藥，在治療鼻病的常用方劑中占有重要的地位，但文獻(xiàn)載明有“小毒”，屬有毒中藥范疇。蒼耳子引起的毒性反應(yīng)表現(xiàn)為多器官、多靶點、多系統(tǒng)。部分學(xué)者認(rèn)為蒼耳子的毒性物質(zhì)常損害肝、心、腎等內(nèi)臟實質(zhì)細(xì)胞，出現(xiàn)黃疽、心律不齊、蛋白尿，尤以損害肝臟為甚［6］。臨床均使用蒼耳子或炒蒼耳子的水煎提取物用于治療鼻科疾病，而現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，蒼耳子中的毒性成分主要為水溶性苷類蒼術(shù)苷與羧基蒼術(shù)苷［7］。因此，為了減少臨床不良反應(yīng)，更安全合理地使用蒼耳子，了解其口服毒性特點及機(jī)制，對其進(jìn)行毒性機(jī)制研究指導(dǎo)臨床應(yīng)用具有重要意義。

本實驗對蒼耳子水提物單次給藥致小鼠急性肝毒性“量-時-毒”關(guān)系進(jìn)行了觀察與評價。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，蒼耳子水提物對小鼠肝臟具有毒性作用。蒼耳子水提物致小鼠肝毒性“時-毒”關(guān)系研究顯示，小鼠單次灌胃101.14 g/kg蒼耳子水提物后，血清ALT、AST值隨時間不同肝損傷程度不同，給藥20min后血清ALT、AST水平升高，毒性高峰出現(xiàn)在給藥后8 h，毒性持續(xù)時間24 h。肝組織病理形態(tài)學(xué)檢查顯示，蒼耳子水提液在給藥后8 h對肝組織產(chǎn)生明顯損傷。這表明，單次給予較高劑量的蒼耳子水提液可造成小鼠急性肝損傷，具體表現(xiàn)為血清ALT、AST值升高或肝組織病理形態(tài)學(xué)的改變，且毒性出現(xiàn)早、持續(xù)時間長。蒼耳子水提物致小鼠肝毒性“量-毒”關(guān)系研究顯示，小鼠灌胃給藥8 h后，不同劑量組小鼠肝體比值和血清ALT、AST值都明顯升高，

本文對蒼耳子水提液單次給藥對小鼠肝毒性的“量-時-毒”關(guān)系進(jìn)行了初步研究，為中藥蒼耳子體內(nèi)肝毒性安全性評價體系的建立提供了研究思路與技術(shù)支撐。通過本文明確了蒼耳子水提液單次給藥致小鼠體內(nèi)肝毒性的毒性劑量范圍和肝毒性依賴時間變化的規(guī)律，為臨床長期大量使用蒼耳子水提制劑過程中毒副作用的監(jiān)測提供了參考，對于中藥臨床安全合理用藥具有重要意義。

［1］Hsu F L，Chen Y C，Cheng JT.Caffeic acid as active principle from the fruit of Xanthium strumarium to lower plasma glucose in diabetic rats［J］.Planta Medica，2000（66）：228-230.

［2］Hsu H Y，Chen Y P，Sheu S J，et al.Orientalmateriamedica a concise guide［M］.Taipei：Modern DrugWeekly of Taiwan，1985：277.

［3］Kellerman T S，Coetzer JAW，Naude TW.Plant poisonings andmycotoxicoses of livestock in Southern Africa［M］.Cape Town：Oxford University Press，1988.

［4］Wu B，Cao M，Liu SM，et al.Experiment study on hepatotoxicity induced by thewater extractof cocklebur fruit in rats［J］.Adverse Drug Reactions Journal，2010，12（6），381-386.

［5］Xue LM，Zhang Q Y，Han P，et al.Hepatotoxic constituents and toxicologicalmechanism of Xanthium strumarium L.fruits［J］.JEthnopharmacol，2014，152（2）：272-282.

［6］曲莉穎，權(quán)錦花，孫彤，等.105例蒼耳子不良反應(yīng)文獻(xiàn)分析［J］.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2015，17（2）：127-129.

［7］Nikles S，Heuberger H，Hilsdorf E，etal.Influence of processing on the contentof toxic carboxyatractyloside and atractyloside and themicrobiological status of xanthium sibiricum fruits（Canger zi）［J］.Planta Med，2015，81（12/13）：1 213-1 220.

（編輯：翟春濤）

Study on"dose-time-toxicity"relationship on hepatotoxicity caused by water extract of Xanthium in m ice

Wang Yongzhong1，Hong Yan2，Li Yuxin1，2，Han Yanquan1
（1.Grade 3 Laboratory of Traditional Chinese Medicine Preparation，State Administration of Traditional Chinese Medicines，The First Affiliated Hospital，Anhui University of Traditional Chinese Medicine，Hefei Anhui230031；2.Anhui University of Traditional Chinese Medicine，Hefei Anhui230031）

Objective：To study the"dose-time-toxicity"relationship of hepatotoxicity in mice caused by single dosage water extract of Xanthium.Method：Mice were packeted according to different time and dose points，to observe the hepatotoxicity ofmice，detect the ALT、AST in serum，calculate liver index，and observe the histopathology of liver tissue. Result：The"time-toxicity"relationship showed that：administrated the 101.14 g/kgwater extractof Xanthium tomice，take the blood samples at different time after administration，ALT and AST were increased after 1 hour，peaked at 8 hour and turned back to normal level at 24 hour；liver index increased and histopathological examination showed serious injury of liver tissue.The"dosage-toxicity"relationship showed that：the dosage ranger ofwater extract of Xanthium cause injury is 101.14 g/kg、83.312 g/kg、66.650 g/kg、53.320 g/kg、42.656 g/kg，the ALT and AST increased significantly as the dosage increased.Live index also increased，live tissue histopathology serious injurywas observed.Conclusion：The acute liver injury can be caused by single dosewaterextractofXanthium tomice，and thereare certain"time-dosage-toxicity"relationship.

water extract of xanthium；hepatotoxicity；time-toxicity；dosage-toxicity

R285

A

1671-0258（2016）06-0001-04

國家中醫(yī)藥管理局中藥炮制技術(shù)傳承基地項目

汪永忠，碩士，主任藥師，E-mail：wyzhmail@163.com

韓燕全，副主任藥師，E-mail：hyquan2003@163.com