張艷賀　任偉超　閆嵩　劉振鵬　張開雪　馬偉

(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，哈爾濱，150040)

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不同生長環(huán)境對黃芪葉綠體超微結(jié)構(gòu)的影響1)

張艷賀任偉超閆嵩劉振鵬張開雪馬偉

(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，哈爾濱，150040)

選用蒙古黃芪(Astragalusmembranaeus(Fisch) Bge. Var. Mongh-oicus (Bge) Hisao)和膜莢黃芪(Astragalusmembranaceus(Fisch) Bge.)種子在不同的環(huán)境中進(jìn)行種植，觀察內(nèi)生真菌、鹽堿脅迫以及遮光處理對黃芪葉綠體超微結(jié)構(gòu)的影響。結(jié)果表明:內(nèi)生真菌處理組葉綠體和類囊體形態(tài)結(jié)構(gòu)完整；鹽堿脅迫處理組，蒙古黃芪葉綠體類囊體受損，基粒片層溶解，淀粉粒數(shù)量增多、直徑增大。遮光處理組膜莢黃芪類囊體、基粒片層溶解，淀粉粒大量出現(xiàn)。蒙古黃芪栽培在透光率較低處，膜莢黃芪生長于鹽堿處對其生長影響較小。黃芪栽培過程中，適當(dāng)加以內(nèi)生真菌菌液，有利于黃芪的生長。

黃芪；超微結(jié)構(gòu)；遮光率；鹽堿脅迫；內(nèi)生真菌

WithAstragalusmembranaeus(Fisch) Bge. Var.mongholicus(Bge)Hisao andAstragalusmembranaceus(Fisch) Bge. seeds in different planting, we studied the effects of endophytic fungi, salt stress and cover light treatment onAstragaluschloroplast ultrastructure. The results showed that endophytic fungi group, chloroplast and thylakoid morphology robust. In the salt stress treatment group,A.membranaeuschloroplast thylakoid was damaged, grana lamellae was dissolved, the number of starch grains was increased, and the diameter was increased. In the shading treatment group,A.membranaeusthylakoid grana lamellae was dissolved, and many starch grains appeared. WhenA.membranaeuscultivation was in the lower light transmittance,A.membranaeusgrowth in salt had little effect on the growth of the department. The proper cultivation of the endophytic fungus is beneficial to the growth of Astragalus.

黃芪是豆科植物膜莢黃芪(Astragalusmembranaceus(Fisch) Bge.)或蒙古黃芪(AstragalusmembranaceusBge. Var.mongholicus(Bge.) Hsiao)的干燥根。始載于神農(nóng)本草經(jīng)被列為補(bǔ)養(yǎng)藥物之上品，目前也是我國藥膳同食品種。市場應(yīng)用量較大，以人工種植為主?，F(xiàn)以山西、甘肅、內(nèi)蒙古以及黑龍江等四省區(qū)為主產(chǎn)區(qū)。不同生長環(huán)境對植物葉綠體超微結(jié)構(gòu)的影響已有較多的報(bào)道[1-5]，但是不同環(huán)境對黃芪葉綠體超微結(jié)構(gòu)的研究國內(nèi)外尚無報(bào)道。本試驗(yàn)通過在不同環(huán)境下觀察內(nèi)生真菌、鹽堿濃度、遮光率對膜莢黃芪和蒙古黃芪葉綠體超微結(jié)構(gòu)的影響，以期為黃芪的栽培提供依據(jù)。

1　材料與方法

儀器：包埋板；LEICA ULTRACUTUCT切片機(jī)；TECNAIG2型透射電子顯微鏡，CLASSⅡTYPE B2潔凈工作臺(北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司)；HZQ-F160震蕩培養(yǎng)箱(中國哈爾濱市東聯(lián)電子科技開發(fā)有限公司)；SHB-111循環(huán)水式多用真空泵(鄭州長城科工貿(mào)有限公司)。

試劑：1%的磷酸緩沖液(PBS)；4%戊二醛；不同體積分?jǐn)?shù)的丙酮、乙醇(70%、80%、90%、95%、100%)；1%鋨酸固定液，飽和醋酸雙氧鈾染液，檸檬酸鉛染液，Epon 812 包埋劑均為黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)檢測實(shí)驗(yàn)室提供。

試驗(yàn)材料的處理：材料購自河北安國藥材市場的蒙古黃芪(Astragalusmembrana-eus(Fisch) Bge. Var. Monghoicus (Bge) Hisao)和膜莢黃芪(Astragalusmembran-aceus(Fisch) Bge.)種子，6月19日播種于黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥用植物園，栽培管理同大田。每組種植2行，行長2 m，行距0.23 m，采用密植種植。其中2號和6號兩組考慮到試驗(yàn)過程中可能造成的對土壤的破壞，選用直徑為35 cm的花盆種植。當(dāng)幼苗出土1個月后開始對黃芪幼苗采用不同的處理方法，如表1所示。

其中，Y-1和Y-5兩種處理選用孔祥軍從黃芪中提取出來的黃芪內(nèi)生真菌，參照孔祥軍[6]的培養(yǎng)方法進(jìn)行培養(yǎng)。對黃芪中分離出來的青霉菌屬、鐮孢菌屬、赤殼菌屬(2株)的4種內(nèi)生真菌進(jìn)行培養(yǎng)，選用PDF培養(yǎng)基在28 ℃、150 r·min-1條件下培養(yǎng)7 d。將培養(yǎng)液通過減壓抽濾法去除菌球，得到菌液。將菌液噴灑在幼苗葉片及根部。

表1　分組情況及不同分組處理方法

Y-2和Y-6號則將配置好的30 mol·L-1NaHCO3、Na2CO3溶液澆在花盆中，直到水從花盆底部流出為止。Y-3和Y-7號為對照組，除正常的苗間管理不做其他處理，Y-4和Y-8號采用30%遮光處理，在地面上60 cm處加蓋遮陰網(wǎng)。

取健康黃芪葉片中部，避開大葉脈，切成5.0 mm×1.0 mm的小塊，立即投入4%戊二醛溶液中固定，并用真空抽濾泵抽取表層空氣，使葉片盡快沉到固定液中，固定24 h(4 ℃)，用磷酸緩沖液沖洗3次，每次10 min(4 ℃)，再用體積分?jǐn)?shù)為70%、80%、90%、95%、100%乙醇依次脫水，脫水后轉(zhuǎn)移至丙酮內(nèi)，最后用Epon812包埋劑浸透包埋。利用LEICA ULTRACUTUC型超薄切片機(jī)切片，醋酸雙氧鈾—檸檬酸鉛雙重染色，TECNAIG2型透射電子顯微鏡下觀察、照相。

2　結(jié)果與分析

通過對空白試驗(yàn)組的觀察發(fā)現(xiàn)黃芪種間存在一定的差異，主要體現(xiàn)為膜莢黃芪葉綠體以弓形為主，而蒙古黃芪則主要為標(biāo)準(zhǔn)腎形。同時基粒片層數(shù)亦存在差異，本試驗(yàn)樣品中，Y-3號中類囊體垛數(shù)較多，而Y-7號中基粒片層數(shù)較多。正常成長條件下，也會存在一定數(shù)量的嗜鋨滴和小的淀粉粒。試驗(yàn)結(jié)果見圖1所示。

2.1內(nèi)生真菌對黃芪葉綠體超微結(jié)構(gòu)的影響

內(nèi)生真菌多為對植株生長有益的菌群，植物可以通過共生的真菌獲得土壤中的礦物質(zhì)養(yǎng)分[7]。本試驗(yàn)所用黃芪內(nèi)生真菌分離自蒙古黃芪根莖中。試驗(yàn)過程中將此菌群大量的接種到黃芪植株上，影響植株中正常的菌群數(shù)量及比例，以達(dá)到影響植株生長的作用。通過對葉片超微結(jié)構(gòu)的觀察發(fā)現(xiàn)，膜莢黃芪和蒙古黃芪在內(nèi)生真菌處理前后，Y-1號樣品中嗜鋨滴數(shù)目較多，類囊體數(shù)目也較多，在視野范圍內(nèi)并未發(fā)現(xiàn)明顯的淀粉粒出現(xiàn)。在Y-5號樣品中，存在著為數(shù)不多的小塊淀粉粒，葉綠體膜結(jié)構(gòu)完整，類囊體膜清晰可見，嗜鋨滴數(shù)目較少。說明在內(nèi)生真菌作用下，有利于黃芪的生長。

2.2鹽堿脅迫對黃芪葉綠體超微結(jié)構(gòu)的影響

鹽堿脅迫組葉綠體中出現(xiàn)大量較大的淀粉粒，此處出現(xiàn)的淀粉粒數(shù)目多且每顆淀粉粒體積均較大，是植物在逆境中自我保護(hù)的一種表現(xiàn)。并且類囊體數(shù)及基粒片層均少于空白組試驗(yàn)，嗜鋨顆粒數(shù)目也較空白試驗(yàn)組少，Y-6號蒙古黃芪產(chǎn)生更多的淀粉粒，并且基粒片層減少更加明顯。因此，從顯微觀察的層面上來說，鹽堿脅迫會對黃芪生長有抑制作用，對Y-2號膜莢黃芪影響較小，黃芪在鹽堿脅迫的逆境中，有一系列的自我保護(hù)的方式，來減少外界對細(xì)胞損傷。

2.3光強(qiáng)度對黃芪葉綠體超微結(jié)構(gòu)的影響

在遮光組試驗(yàn)中，我們發(fā)現(xiàn)Y-4號膜莢黃芪的葉綠體幾乎全部被淀粉粒所占據(jù)，葉綠體變?yōu)閳A形，基粒片層數(shù)及類囊體數(shù)目減少，且大量的葉綠體內(nèi)膜發(fā)生溶解，使視線內(nèi)膜結(jié)構(gòu)變模糊。Y-8號蒙古黃芪葉綠體形態(tài)和數(shù)目未見明顯變化，類囊體數(shù)和基粒片層數(shù)均未發(fā)生大的變化。由此可知，在超微結(jié)構(gòu)層面上，遮陰處理對蒙古黃芪影響較小，對膜莢黃芪影響較大。即蒙古黃芪在遮陰環(huán)境中較適于生長，而對膜莢黃芪生長產(chǎn)生極度不利影響。

3　結(jié)論與討論

本試驗(yàn)通過不同生長環(huán)境的蒙古黃芪、膜莢黃芪葉綠體超微結(jié)構(gòu)觀察，發(fā)現(xiàn)內(nèi)生真菌處理有利于黃芪葉綠體及類囊體保持形態(tài)和結(jié)構(gòu)的完整性，有助于黃芪的生長；鹽堿脅迫組中蒙古黃芪葉綠體、類囊體受損，基粒片層溶解，大粒徑淀粉粒增多。膜莢黃芪葉綠體形態(tài)結(jié)構(gòu)完整，遮光處理組膜莢黃芪出現(xiàn)類囊體、基粒片層溶解，淀粉粒大量出現(xiàn)。而蒙古黃芪葉綠體形態(tài)結(jié)構(gòu)完整，表明在透光率較低的環(huán)境中對蒙古黃芪影響較小，膜莢黃芪在鹽堿脅迫土壤中影響較小，同時，在黃芪生長過程中噴灑一定量的黃芪內(nèi)生真菌有利于黃芪生長。

有無內(nèi)生真菌處理相比，膜莢黃芪葉綠體結(jié)構(gòu)變細(xì)長，類囊體數(shù)目減少，基粒片層數(shù)目增多。蒙古黃芪葉綠體變?yōu)闄E圓形，基粒片層數(shù)增多，類囊體膜機(jī)構(gòu)清晰。內(nèi)生菌多為益生菌[8]，本試驗(yàn)中使用的內(nèi)生菌分離自蒙古黃芪，對蒙古黃芪生長更為有利?；Ｆ瑢訑?shù)目增多，提高植物光能利用率，增加光合作用效率。

植物葉綠體超微結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性與其耐鹽性密切相關(guān)[9-10]。在鹽堿脅迫下，耐鹽植物葉綠體通常表現(xiàn)為結(jié)構(gòu)完整、基粒片層清晰、類囊體結(jié)構(gòu)完整，而不耐鹽植物表現(xiàn)為葉綠體超微結(jié)構(gòu)變形、基粒片層模糊，嚴(yán)重時基粒片層扭曲，葉綠體解體、失去完整結(jié)構(gòu)[11]。在鹽堿脅迫條件下，膜莢黃芪葉綠體中類囊體數(shù)目減少，淀粉粒直徑增大。蒙古黃芪中出現(xiàn)葉綠體結(jié)構(gòu)變成類圓形、基粒片層溶解、內(nèi)膜結(jié)構(gòu)模糊的現(xiàn)象。這是鹽堿脅迫下對黃芪生長產(chǎn)生的不利影響，蒙古黃芪光能捕捉和光能轉(zhuǎn)化的場所受到破壞，使其生長受到抑制。鹽堿脅迫下，對膜莢黃芪產(chǎn)生的不利影響較小，可以保持正常生長。

Chl為葉綠體， P為嗜鋨顆粒，G為基粒，S為淀粉粒，1～4號為膜莢黃芪，5～8號為蒙古黃芪，1、5號為內(nèi)生真菌處理組，2、6號為鹽堿脅迫組，3、7號為空白對照組，4、8號為遮光對照組。

圖1不同處理對黃芪葉綠體超微結(jié)構(gòu)的影響(17 000×)

在不同遮光率的黃芪超微結(jié)構(gòu)研究中，膜莢黃芪葉綠體形狀變?yōu)榍蛐危惸殷w數(shù)目減少，基粒片層溶解，邊緣模糊，淀粉粒數(shù)量增多、直徑明顯增大。蒙古黃芪類囊體數(shù)目增多，基粒片層邊緣清晰，淀粉粒幾不可見。有利于捕獲光能、減少自身對光的消耗，對其在弱光下生存具有重要意義[12-13]。

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Effect of Different Growth Environment on the Chloroplasts Ultrastructure ofAstragalus//

Zhang Yanhe, Ren Weichao, Yan Song, Liu Zhenpeng, Zhang Kaixue, Ma Wei

(Heilongjiang University of Chinese Medicine, Harbin 150040, P. R. China)//Journal of Northeast Forestry University，2016,44(2)：15-17,25.

Astragalus; Ultrastructure; Shading rate; Salt stress; Endophytic fungus

張艷賀，女，1989年1月生，黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，碩士研究生。E-mail:zyh_zyy2011@163.com。

馬偉，黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，研究員。E-mail:mawei@hljucm.net。

2015年9月11日。

R927.2

1)林業(yè)公益性行業(yè)科研專項(xiàng)(201004079，201404718)；國家自然科學(xué)基金(81274010)；黑龍江省杰出青年基金(JC201101)；黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)“優(yōu)秀創(chuàng)新人才支持計(jì)劃”項(xiàng)目。

責(zé)任編輯：潘華。