楊林* ，周小凱，楊明俊，王永剛，石紅霞（蘭州理工大學(xué) 生命科學(xué)與工程學(xué)院，蘭州 甘肅 730050）

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披針葉黃華內(nèi)生真菌抑菌和α-葡萄糖苷酶抑制活性的篩選

楊林* ，周小凱，楊明俊，王永剛，石紅霞
（蘭州理工大學(xué) 生命科學(xué)與工程學(xué)院，蘭州 甘肅 730050）

目的∶從披針葉黃華內(nèi)生真菌中篩選出抑菌和α-葡萄糖苷酶抑制活性較好的菌株。方法：采用植物組織塊法分離披針葉黃華內(nèi)生真菌，濾紙片法、分光光度法分別測定抑菌活性和α-葡萄糖苷酶抑制活性大小。結(jié)果：從披針葉黃華的根莖葉中共獲得16株內(nèi)生真菌，其中，Tl-R-9的抑菌活性最好。10mg·mL-1時，3種測試細(xì)菌的抑菌圈都在15mm以上。Tl-R-6的α-葡萄糖苷酶抑制活性最高，達(dá)到94.7%。結(jié)論：披針葉黃華內(nèi)生真菌在藥用價值方面有較大的前景。

披針葉黃華；內(nèi)生真菌；抑菌活性；α-葡萄糖苷酶抑制活性

披針葉黃華（Thermopsis lanceolata R. Br.）系豆科野決明屬，主要分布在中國西北部地區(qū)，該植物全草可祛痰［1］。內(nèi)生真菌是一類寄居在宿主植物體內(nèi)而不引起植物任何明顯疾病癥狀的微生物［2］。它常能產(chǎn)生一些有生物活性的次級代謝產(chǎn)物，其中的一些代謝產(chǎn)物在幫助宿主植物抵御外部不利因素方面起了很重要的作用［3］。最近10年，抗生素的濫用導(dǎo)致產(chǎn)生了很多的耐藥細(xì)菌。因此加快尋找抑菌活性好的化合物就變得迫在眉睫。

α-葡萄糖苷酶抑制劑能競爭性抑制小腸內(nèi)的α-葡萄糖苷酶的活性，從而延緩或抑制葡萄糖在腸道的吸收，最后有效地降低進(jìn)餐后的高血糖［4］。目前，α-葡萄糖苷酶抑制劑已被第三次亞太地區(qū)糖尿病治療藥物指南推薦為降餐后血糖的一線藥物［5］。

1 、材料

1.1植物材料 披針葉黃華新鮮植株采集自甘肅省甘南藏族自治州。

2 、方法

2.1內(nèi)生真菌的分離

新鮮的披針葉黃華植株在自來水下沖洗干凈后，轉(zhuǎn)移到75%乙醇中浸泡2min，無菌水沖洗3次，再轉(zhuǎn)移到0.1%的升汞溶液中浸泡30s，無菌水沖洗3次。最后一次沖洗的無菌水取少量涂布在PDA培養(yǎng)基上。用無菌手術(shù)刀將植株的根、莖、葉分別切成0.5cm、0.5cm、1cm2的小塊，然后轉(zhuǎn)接到PDA培養(yǎng)基中28±1℃下培養(yǎng)，每個培養(yǎng)基中放4塊，當(dāng)有菌絲從組織塊的切口處長出時，將菌絲挑取轉(zhuǎn)移到新的PDA培養(yǎng)基中進(jìn)行純化培養(yǎng)，直到菌落單一。

2.2萃取物的制備

純化的菌株接種到200mL PDB培養(yǎng)基中，28±1℃下?lián)u床震蕩培養(yǎng)10d，WhatmanNo1濾紙片過濾發(fā)酵液，然后用等體積的乙酸乙酯萃取發(fā)酵液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器旋干乙酸乙酯后得到粗萃取物。

2.3抑菌活性

選取地衣芽孢桿菌、綠膿桿菌和大腸桿菌作為測試菌，濾紙片法測定萃取物的抑菌活性。三種測試菌接入牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中37±1℃下?lián)u瓶8h，然后用無菌蒸餾水將其稀釋1000倍，吸取200μL測試菌液到牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中，無菌涂布棒均勻涂布，取直徑6mm的無菌濾紙片放于涂布好的平板上，每皿3片，然后吸取萃取物樣液（DMSO溶解，10mg·mL-1）15μL滴在濾紙片上，DMSO溶劑為陰性對照，100U·mL-1的硫酸鏈霉素與青霉素鈉為陽性對照，每個樣品3個平行。

2.4 α-葡萄糖苷酶抑制活性

萃取物用磷酸鹽緩沖液（PBS，100mmol·L-1，pH6.9）配制成1mg·mL-1的樣液。取0.5ml樣液加到0.5mL 5mmol·L-1的p-硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷（PNPG）PBS溶液中（pH 6.9），混勻后在37℃下靜置5min，然后1mL的α-葡萄糖苷酶（0.1U·mL-1）PBS溶液（pH6.9）加到試管中。37℃下反應(yīng)10min后加入0.1mL 100mmol·L-1的Na2CO3來終止反應(yīng)。405nm下測定吸光度值。抑制活性公式：抑制率（%）=（Ai-At）/Ai×100；Ai：不含樣液的吸光度值；At：含有樣液的吸光度值。

3、結(jié)果與討論

3.1內(nèi)生真菌的分離

通過組織塊分離法，從披針葉黃華植物的根（9）、莖（5）、葉（2）中共分離得到16株內(nèi)生真菌。

3.2抑菌活性

16株內(nèi)生真菌的萃取物對3種測試菌的抑制活性中，只有內(nèi)生真菌Tl-R-9抑制活性最好，三種測試菌的抑菌圈都在15mm以上，分別為地衣芽孢桿菌18mm、綠膿桿菌18mm、大腸桿菌16mm（圖1）。其余內(nèi)生真菌萃取物的抑菌圈都在10mm以下。陰性對照DMSO抑菌圈為0mm，陽性對照組青霉素鈉對革蘭氏陽性菌地衣芽孢桿菌的抑菌圈為42mm，硫酸鏈霉素對革蘭氏陰性菌綠膿桿菌、大腸桿菌的抑菌圈分別為26mm 和28mm。內(nèi)生真菌Tl-R-9最小抑菌濃度分別為地衣芽孢桿菌0.5mg·mL-1、綠膿桿菌1mg·mL-1、大腸桿菌1mg·mL-1。經(jīng)過形態(tài)學(xué)分析，內(nèi)生真菌Tl-R-9被鑒定為鏈格孢屬。

圖1　內(nèi)生真菌萃取物對三種測試菌的抑菌圈；9為內(nèi)生真菌Tl-R-9

3.3α-葡萄糖苷酶抑制活性 披針葉黃華內(nèi)生真菌萃取物表現(xiàn)出較好的α-葡萄糖苷酶抑制活性。其中，1mg·mL-1濃度下，內(nèi)生真菌Tl-R-4和Tl-R-6的抑制活性都在80%以上，Tl-R-6的活性最高，達(dá)到94.7%（圖2）。經(jīng)過形態(tài)學(xué)鑒定，內(nèi)生真菌Tl-R-4和Tl-R-6分別屬于鏈格孢屬和毛霉屬。

圖2　內(nèi)生真菌Tl-R-4和Tl-R-6不同濃度下的α-葡萄糖苷酶抑制活性

［1］陳冀勝，鄭碩.中國有毒植物［M］.北京：科學(xué)出版社，1987：340-341.

［2］Arnold AE. Understanding the diversity of foliar endophytic fungi： progress， challenges， and frontiers［J］. Fungal Biol Rev， 2007， 21（2）：51-66.

［3］Azevedo JL， Macchroni W， Pereira JO， et al. Endophytic microorganisms： a review on insect control and recent advances on tropical plants［J］. Biotechnology， 2000， 3：40·65.

［4］許有瑞，倪京滿，孟慶剛，等. 甘草中α-葡萄糖苷酶抑制劑的初步研究［J］.中藥材，2005，28（10）：890-891.

［5］Floris A， Peter L， Reinier P， et al. α-Glucosidase inhibitors for pients with type 2 diabetes［J］.Diabetes Care， 2005，28（1）：154-163.

甘肅省自然科學(xué)基金（1310RJZA078）