江惟蘇何友珍王鵬歐陽資章湯素環(huán)

雷公藤甲素體外對人表皮干細(xì)胞增殖的調(diào)控作用*

江惟蘇①何友珍①王鵬①歐陽資章①湯素環(huán)①

目的：探討雷公藤甲素體外對人表皮干細(xì)胞增殖的影響。方法：應(yīng)用中性蛋白酶-Ⅳ型膠原黏附方法分離正常人的包皮表皮干細(xì)胞，采用細(xì)胞免疫組化法檢測培養(yǎng)傳代細(xì)胞的角蛋白19（CK19）、角蛋白10（CK10）、β1整合素表達(dá)，鑒定人表皮干細(xì)胞。培養(yǎng)傳代細(xì)胞中加入不同濃度的雷公藤甲素，用倒置顯微培養(yǎng)后觀察細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化，應(yīng)用四甲基偶氮唑鹽（MTT）法檢測細(xì)胞的增殖情況，探索雷公藤甲素對人表皮干細(xì)胞增殖的影響。結(jié)果：免疫組化法檢測提示培養(yǎng)傳代細(xì)胞，β1整合素、CK19表達(dá)陽性，CK10表達(dá)陰性，MTT法檢顯示雷公藤甲素能顯著抑制人表皮干細(xì)胞的增殖，且存在一定的濃度依賴性。結(jié)論：雷公藤甲素能有效抑制人表皮干細(xì)胞增殖。

雷公藤甲素； 表皮干細(xì)胞； 增殖； 角蛋白19； β1整合素

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First-author’s address：People’s Hospital of Qingyuan，The Sixth Affiliated Hospital of Guanyzhou Medical University，Qingyuan 511518，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2016.22.006

中藥雷公藤系衛(wèi)矛科雷公藤屬植物，藥用其根，至今已從雷公藤屬植物的提取物中分離70多種成分，生物堿及二萜類為其主要活性成分，不僅有抗癌及免疫抑制作用，還有抗類風(fēng)濕作用［1-7］。目前雷公藤在我國已廣泛應(yīng)用于銀屑病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、濕疹、過敏性紫癜等皮膚病的治療，而且皮膚科的許多疾病與表皮干細(xì)胞有關(guān)［7-11］。目前尚未見雷公藤甲素體外對表皮干細(xì)胞增殖的調(diào)控作用的報道，因此選擇雷公藤甲素研究其體外對表皮干細(xì)胞增殖的影響，現(xiàn)報道如下。

1　材料與方法

1.1材料 小鼠抗人β1整合素購自武漢博士德，胰蛋白酶（來自Sigma），中性蛋白水解酶來自美國Gibco公司，小鼠抗人角蛋白19（Cytokeratin 19，CK19）、CK10（Cytokeratin 10）、兩步法免疫組織化學(xué)檢測試劑盒（均來自為福州邁新），DMEM培養(yǎng)基、低糖DMEM/F12培養(yǎng)基（均來自Gibco），胎牛血清（來自Hyclone），人膠原Ⅳ（來自Sigma），表皮生長因子（EGF，來自Promega），雷公藤甲素（中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院皮膚病研究所，純度為99%）。

1.2方法

1.2.1 中性蛋白水解酶配制 用D-Hanks 溶解中性蛋白水解酶25 mg，定容至100 mL，過濾除菌，4 ℃保存。

1.2.2 Ⅳ型膠原包被 按參考文獻［12-13］方法進行，將Ⅳ型膠原溶解于0.1%醋酸溶液中至終濃度為100 mg/L，經(jīng)過濾過除菌，4 ℃保存?zhèn)溆谩?yīng)用配制好的Ⅳ型膠原溶液2 mL平鋪在培養(yǎng)瓶中，取配制好的Ⅳ型膠原溶液10μL涂滿96孔板，置4 ℃冰箱中過夜，棄上清液，然后用0.01 mol/L PBS漂洗3次，洗去未貼壁多余的膠原，4 ℃干燥箱烘干，再用紫外線照射2 h消毒，得到預(yù)鋪的IV型膠原培養(yǎng)瓶和96孔培養(yǎng)板。

1.2.3 雷公藤甲素應(yīng)用液制備 將雷公藤甲素粉劑溶解于DMSO液中，貯存液濃度為5 mg/mL，貯存液加入適當(dāng)溶劑，制備不同濃度的實驗濃液。

1.2.4 表皮干細(xì)胞的分離與培養(yǎng) 將來自本院行包皮切除術(shù)的包皮皮片（患者年齡2～40歲，均無感染等相關(guān)疾病）共15例，所取皮片均得到患者知情同意，按參考文獻［12-13］方法進行實驗。將剛手術(shù)新鮮的標(biāo)本用含青霉素、鏈霉素的PBS液沖洗8～10次，無菌條件下剔除皮下組織。標(biāo)本剪成0.5 cm×0.5 cm的皮片，用中性蛋白水解酶4 ℃消化l4～16 h，棄上清液，分離表皮與真皮層。剪碎表皮，0.25%胰蛋白酶37 ℃消化15 min，加入含10%小牛血清DMEM終止消化，輕柔吹打，經(jīng)200目篩網(wǎng)研磨濾過。濾液離心速度為1000 r/min，離心5 min收集細(xì)胞。棄上清液，立即加入表皮干細(xì)胞培養(yǎng)基并輕輕吹打制成單細(xì)胞懸液，接種于預(yù)先鋪有Ⅳ型膠原培養(yǎng)瓶及96孔板內(nèi)，經(jīng)37 ℃孵育15 min。倒置顯微鏡下觀察，粘附于Ⅳ型膠原包被板上的細(xì)胞則主要為表皮干細(xì)胞為實驗組，再吸去未粘附細(xì)胞懸液，接種于未鋪Ⅳ型膠原包被板內(nèi)作為對照組，實驗組加入表皮干細(xì)胞培養(yǎng)基，每組各選15例。兩組放置于37 ℃、5% CO2孵箱培養(yǎng)。次日吸出培養(yǎng)液，用PBS沖洗1次，加入表皮干細(xì)胞培養(yǎng)基，置37 ℃、5% CO2孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)。換液2 d/次，在光鏡下觀察細(xì)胞生長情況。

1.2.5 表皮干細(xì)胞的傳代 當(dāng)培養(yǎng)的細(xì)胞接近70%～80%融合時，應(yīng)用0.25%胰蛋白酶0.02% EDTA消化培養(yǎng)瓶內(nèi)的細(xì)胞，按1∶2傳代，傳代的細(xì)胞接種在Ⅳ型膠原預(yù)先鋪的96孔培養(yǎng)板或培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。

1.2.6 表皮干細(xì)胞的鑒定 按參考文獻［12-13］實驗方法進行，應(yīng)用免疫組化染色方法檢測，采取第2代表皮干細(xì)胞爬片，用4%多聚甲醛在室溫下固定10 min，用兩步法進行免疫組化染色試驗。以對照組細(xì)胞作為對照組，具體步驟方法：滴加3%H202，置37 ℃孵育10 min，以消除內(nèi)源性的過氧化物酶活性。用非免疫性的動物血清封閉后分別滴加一抗（KI9、β1整合素、CK10）；同時設(shè)空白對照組，以PBS代替一抗，4 ℃過夜。洗后滴加辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗，37 ℃孵育20 min（以上各步驟間均以PBS振洗），DAB顯色。

1.2.7 雷公藤甲素體外對表皮干細(xì)胞增殖的調(diào)控 四甲基偶氮唑鹽（MTT）法檢測細(xì)胞的增殖［14-15］，取分離培養(yǎng)鑒定的表皮干細(xì)胞的制成單細(xì)胞懸液調(diào)整濃度為5×105/mL，接種于96孔板內(nèi)，每個樣本設(shè)4個復(fù)孔，0.2 mL/孔。放置培養(yǎng)箱內(nèi)孵育，待細(xì)胞完全貼壁，然后更換含雷公藤甲素的培養(yǎng)液終濃度分別為100、50、25、2.5、0.25、0.025μg/mL，同時設(shè)對照組。在培養(yǎng)箱中分別孵育7、10、13 d后，加入20μL/孔 MTT（5 mg/mL）后孵育4 h，參照試劑說明書進行操作，用酶標(biāo)儀檢測吸光度（OD）計算細(xì)胞增殖活性。

1.3統(tǒng)計學(xué)處理 使用SPSS 10.0統(tǒng)計軟件進行分析，計量資料采用（±s）表示，比較采用t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1培養(yǎng)細(xì)胞的生長狀況 顯微鏡下觀察分離的細(xì)胞貼壁，細(xì)胞折光性較強，分散較均勻，細(xì)胞體積較小、圓形。培養(yǎng)3 d后，試驗組個別細(xì)胞貼壁牢固，形成較小克隆。培養(yǎng)第8天，細(xì)胞連接成片，細(xì)胞間互相銜接、緊密相靠，呈鋪路石狀。培養(yǎng)至第13天形成圓形、橢圓形、不規(guī)則形大克隆，大部分融合。

2.2細(xì)胞免疫化學(xué)染色結(jié)果 試驗組細(xì)胞的CK10細(xì)胞免疫化學(xué)染色顯示為陰性，β1整合素、CK19細(xì)胞免疫化學(xué)染色顯示培養(yǎng)細(xì)胞的胞漿內(nèi)出現(xiàn)棕黃色的表達(dá)為陽性。

2.3MTT法檢測 表皮干細(xì)胞經(jīng)雷公藤甲素處理后，各組細(xì)胞的生長受到不同程度抑制，濃度不同抑制強度不同，在一定的濃度范圍內(nèi)，濃度越高抑制作用越大，隨雷公藤甲素濃度的變化而變化，見表1。（1）7 d OD，雷公藤甲素濃度為0.025、0.25μg/mL時兩組比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），其他濃度比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。實驗組組內(nèi)比較：雷公藤甲素濃度為0.025μg/mL與0.25μg/mL比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），與其他濃度比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；雷公藤甲素濃度為0.25μg/mL 與2.5、25、50、100μg/mL比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；雷公藤甲素濃度為2.5μg/mL與25μg/mL比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），與50、100μg/mL比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；濃度為25μg/mL與50、100μg/mL比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。（2）10 d OD，雷公藤甲素濃度為0.025、0.25μg/mL時兩組比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），其他濃度比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。實驗組組內(nèi)比較：雷公藤甲素濃度為0.025μg/mL與0.25、2.5μg/mL比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），與25、50、100μg/mL比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；雷公藤甲素濃度0.25μg/mL與2.5、25μg/mL比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），與50、100μg/mL比較P＜0.05；濃度2.5μg/mL與25 μg/mL比較P＞0.05，與50、100μg/mL比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；濃度25μg/mL與50μg/mL比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），與100μg/mL比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；濃度50μg/mL 與100μg/mL比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。（3）13 d OD時不同濃度雷公藤甲素體外對表皮干細(xì)胞增殖的影響情況與（2）類似，見表1。

表1　不同濃度雷公藤甲素體外對表皮干細(xì)胞增殖的影響（±s）

表1　不同濃度雷公藤甲素體外對表皮干細(xì)胞增殖的影響（±s）

組別7 d OD 0.025μg/mL0.25μg/mL2.5μg/mL25μg/mL50μg/mL100μg/mL對照組（n=15）0.380±0.0860.367±0.0710.381±0.0810.349±.0680.383±0.0830.296±0.065實驗組（n=15）0.381±0.0830.283±0.0650.382±0.0860.251±0.0700.380±0.0810.249±0.060

續(xù)表1

續(xù)表1

3　討論

當(dāng)前國內(nèi)外對表皮干細(xì)胞的增殖分化調(diào)控尚處于探索階段，中藥雷公藤系衛(wèi)矛科雷公藤屬植物，其中二萜類及生物堿為其主要有效活性成分。中藥現(xiàn)代藥理試驗證實其具有免疫調(diào)節(jié)、抗炎、抗腫瘤、抗生育等作用，已被廣泛應(yīng)用于銀屑病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、過敏性皮膚病、腎炎、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等諸多疾病治療［16-17］。MTT比色法又稱MTT法，是一種檢測細(xì)胞存活和生長情況常用方法，已廣泛用于大規(guī)模的抗腫瘤藥物篩選、生物活性因子的活性檢測、細(xì)胞增殖活性檢測、細(xì)胞毒性試驗等［18］。本課題研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)雷公藤甲素處理后的各組細(xì)胞的生長受到不同程度抑制，濃度不同抑制強度不同，在一定的濃度范圍內(nèi)對照組與實驗組比較，隨著雷公藤甲素濃度的升高，雷公藤甲素對表皮干細(xì)胞的抑制程度增強，濃度越高抑制作用越大；實驗組內(nèi)比較顯示：雷公藤甲素濃度越高對表皮干細(xì)胞的抑制程度也越強，隨著雷公藤甲素濃度的變化而變化。說明雷公藤甲素體外對表皮干細(xì)胞增殖分化有較強的調(diào)控作用，可以解釋雷公藤用于許多皮膚病的治療原因，例如：銀屑病（psoriasis）是一種常見的慢性復(fù)發(fā)性炎癥性皮膚病，基本損害為紅色丘疹或斑塊上覆有多層銀白色鱗屑，病理生理的一個重要特點是表皮基底層的角質(zhì)形成細(xì)胞增殖加速，表皮更替時間縮短，組織病理上出現(xiàn)角化不全，顆粒層消失。雷公藤甲素對銀屑病患者的表皮干細(xì)胞增殖分化有較強抑制作用，使細(xì)胞增殖速度差減慢，恢復(fù)正常增殖速度，這可能是雷公藤治療銀屑病的機理之一。目前研究發(fā)現(xiàn)皮膚科的許多疾病與表皮干細(xì)胞有關(guān)，表皮干細(xì)胞在一定條件下可以轉(zhuǎn)化為其他干細(xì)胞，其也積極參與皮膚損傷后的修復(fù)，是皮膚發(fā)生、重塑和修復(fù)的關(guān)鍵性細(xì)胞［19-25］。表皮干細(xì)胞具有慢周期性，自我更新能力強，與皮膚基底膜粘附緊密，體外培養(yǎng)時有較高的克隆形成率等特點［14，24］。隨著中藥對表皮干細(xì)胞的增殖分化調(diào)控研究的深入，中藥治療皮膚病的神秘面紗將被揭示，將為其邁向國際化市場提供理論基礎(chǔ)，造福全世界。

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In Vitro Regulatory Effect of Triptolide on Proliferation of Human Epidermal Stem Cells

JIANG Wei-su，HE You-zhen，WANG Peng，et al.//Medical Innovation of China，2016，13（22）：024-028

Objective：To investigate the effect of Triptolide on the proliferation of human epidermal stem cells（hESCs） in vitro.Method：hESCs was isolated from human foreskin by the method of protease-collagen Ⅳ-coated adhesion.The expression of integrins β1，keratin 19 and keratin 10 on the generation of hESCs were examined by immunocytochemical method.After the generation of hESCs were cultured in epilife medium containing Triptolide of different concentrations respectively.The shape，clone formation and proliferation of the cell were

Triptolide； Epidermal stem cells； Proliferation； Keratin 19； Integrins β1

清遠(yuǎn)市科技計劃項目（2012B011204125）
①廣東省清遠(yuǎn)市人民醫(yī)院暨廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第六醫(yī)院 廣東 清遠(yuǎn) 511518

江惟蘇

（2016-05-05） （本文編輯：周亞杰）