郭康 劉夢實 徐萍 李紅梅

肺癌是世界范圍內最常見的腫瘤之一，而且其發(fā)病死亡率居首位[1]，是威脅人類生命健康的主要惡性腫瘤。其中肺腺癌的發(fā)病率逐年升高，已經(jīng)躍居肺癌發(fā)病率首位[2]。研究[2]證實，早期診斷和治療是提高肺癌患者生存率的關鍵。腫瘤標志物因其檢測方便、成本低等優(yōu)點可廣泛用于肺癌的篩查，對肺癌早期診斷、組織學分型、預后判斷及療效評價等方面有重要價值[3]。腫瘤睪丸抗原（cancer-testis antigen, CTA）是一類新的腫瘤標志物，在多種腫瘤中存在表達，而在正常組織中僅表達于睪丸和胎盤組織[4]。黑色素抗原C2（melanoma antigen-C2,MAGE-C2）是CTA的一種，最初發(fā)現(xiàn)于黑色素瘤細胞，后被證實在多種腫瘤中存在表達[5,6]，而其在肺腺癌中的研究卻很少。本實驗通過熒光定量PCR（realtime fluorescence quantitative PCR, RTFQ-PCR）及Western blot方法檢測MAGE-C2 mRNA及蛋白在肺腺癌中的表達情況，并分析其與肺腺癌臨床病理特征及總生存率之間的關系，以期望發(fā)現(xiàn)一種新的肺腺癌標志物。

1 資料與方法

1.1 病例資料 選取青島大學附屬醫(yī)院胸外科2010年3月-2011年3月肺腺癌患者87例，分別取肺腺癌組織及癌旁組織10 g剪碎后儲存于-80 ℃?zhèn)溆?。癌旁組織取自癌組織旁5 cm以外的組織。所有患者均為接受過放化療，并均已經(jīng)病理診斷證實，且無其他惡性疾病及自身免疫性疾病。臨床分期采用國際腫瘤-淋巴結-轉移（tumor-nodemetastasis, TNM）分期方法。

1.2 總RNA提取和cDNA合成 取冰凍肺腺癌組織及癌旁組織各50 mg-100 mg，利用RNAsimple Total RNA Kit提取總RNA，利用超微量核酸蛋白檢測儀檢測RNA純度。再利用FastQuant RT Kit（with gDNase）進行cDNA合成。所有試劑盒均為天根科技有限公司提供，具體操作均按說明書進行。

1.3 熒光定量PCR檢測 使用上述合成的cDNA為模板，利用SuperReal PreMix Plus（SYBR Green）試劑盒進行熒光定量PCR檢測。所使用MAGE-C2上游引物為：5’-AAAGTCA GCACAGCAGAGGAG-3’，下游引物為：5’-TCTTCAGGA GCAGCAGGTAAA-3’。先95 ℃預變性15 min，再與熒光定量PCR儀（Bio-Rad儀器）內擴增40個循環(huán)（95 ℃變性10 s，55 ℃退火20 s，72 ℃延伸20 s），然后進行融解曲線分析。所有試劑盒均為天根科技有限公司提供，具體操作按說明書進行[7]。

1.4 Western blot檢測 將凍存的組織標本取出稱重，每100 mg加入500 μL蛋白裂解液，置于勻漿器中研磨，冰上裂解30 min，離心（12,000 r/min）收集上清液，使用BCA法測定蛋白濃度。將蛋白于10%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，電轉膜1.5 h，5%BSA封閉1 h后，分別加入MAGE-C2兔抗人單克隆抗體（1:1,000）及GAPDH小鼠抗人單克隆抗體（1:1,000），4 ℃孵育過夜漂洗，加二抗（1:2,000）室溫孵育1 h后加發(fā)光試劑，暗室曝光顯示條帶[8]。

圖1 Western blot檢測MACE-C2蛋白在肺腺癌及癌旁組織中的表達情況Fig 1 Expression of MAGE-C2 protein was detected in lung adenocarcinoma and adjacent non-cancerous tissue by Western bolt.MAGE-C2: melanoma antigen-C2.

1.5 隨訪 對87例患者進行長期隨訪，隨訪時間從診斷日期開始至最終觀察日期或死亡日期。記錄患者的總生存時間。

1.6 統(tǒng)計學方法 所有數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0統(tǒng)計學軟件進行分析。計量資料以Mean±SD表示，采用t檢驗；計數(shù)資料采用χ2檢驗；生存分析采用Kaplan-Meier法及Cox風險比例回歸模型，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 MAGE-C2 mRNA在肺腺癌及癌旁組織中的表達 超微量核酸蛋白檢測儀檢測RNA純度，選取A260/A280的比值在1.8到2.1之間的樣本用于合成cDNA。熒光定量PCR結果顯示MAGE-C2 mRNA在肺腺癌組織存在表達（53/87,60.9%），而在癌旁組織中無表達。

2.2 MAGE-C2蛋白在肺腺癌及癌旁組織中的表達 Western blot結果與熒光定量PCR檢測結果一致，在肺腺癌組織中檢測到MAGE-C2蛋白的表達（53/87, 60.9%）（圖1），而在癌旁組織中無表達。

2.3 MAGE-C2 mRNA及蛋白表達與肺腺癌臨床病例特征之間的關系 將MAGE-C2 mRNA及蛋白表達情況與肺腺癌患者的臨床病理資料結合進行分析。我們發(fā)現(xiàn)，MAGE-C2 mRNA及蛋白表達陽性組與表達陰性組之間在臨床分期、是否轉移、分化程度方面存在統(tǒng)計學差異（P＜0.05）（表1）；在MAGE-C2 mRNA表達陽性組中，晚期、低分化、轉移組的表達量明顯高于早期、高/中分化、無轉移組（P＜0.05）（圖2）；但與患者的年齡、性別、吸煙史之間無明顯相關性（P＞0.05）（表1）。

2.4 MAGE-C2 mRNA與患者預后之間的關系 通過對87例隨訪數(shù)據(jù)進行Kaplan-Meier法生存分析，我們發(fā)現(xiàn)MAGE-C2 mRNA及蛋白表達陽性組與表達陰性組之間在總生存期上存在明顯差異（Log-rank=7.541,P＜0.05）（圖3）。利用Cox風險比例回歸模型對87例患者的7個因素進行分析，這7個因素分別為：年齡、性別、吸煙史、分化程度、臨床分期、是否轉移、MAGE-C2表達，結果發(fā)現(xiàn)，臨床分期、是否轉移、MAGE-C2表達分別為肺腺癌預后不良的獨立因素。MAGE-C2 mRNA及蛋白高表達對患者總生存期產(chǎn)生不利影響（RR=2.813, 95%CI 1.714-4.616,P=0.017）（表2），并可能與臨床分期、是否轉移間存在協(xié)同作用。

表1 MAGE-C2 mRNA及蛋白表達情況與臨床病理特征的關系Tab 1 Relationship between expression level of MAGE-C2 mRNA and protein and clinical characteristics of patients

3 討論

CTA抗原基因編碼的腫瘤抗原能在多種腫瘤組織中表達，但在正常組織中僅限于睪丸和胎盤組織，但是睪丸不表達人類白細胞抗原（human leukocyte antigen,HLA），因此不會在體內產(chǎn)生相應抗體[9,10]。Jassim等[11]的研究發(fā)現(xiàn)CTA的異位表達能引發(fā)人體的免疫反應，在血液中產(chǎn)生相應抗體，這為CTA在早期腫瘤診斷方面的應用提供了依據(jù)[12]。另外，由于CTA這種免疫原性及表達限制性，CTA在腫瘤的診斷及免疫治療方面存在巨大的潛在價值。

MAGE-C2是CTA家族中的一員，可在腫瘤細胞的胞質內被降解成九肽或十肽，然后作為抗原表位，與細胞內的HLA分子結合后呈遞到細胞膜[13]，從而誘導機體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生相應抗體。在本研究中，我們檢測了87例肺腺癌患者癌組織及癌旁組織中MAGE-C2 mRNA及蛋白的表達情況，結果發(fā)現(xiàn)，MAGE-C2 mRNA及蛋白表達于多數(shù)肺腺癌組織中（53/87, 60.9%），而在癌旁組織中未檢測到MAGE-C2 mRNA及蛋白的表達。因此，MAGE-C2有潛力作為一種新型的肺腺癌標志物，其在血清中產(chǎn)生的特異性抗體可廣泛用于肺癌的篩查。另外，通過分析MAGE-C2 mRNA及蛋白的表達情況與肺腺癌臨床病理特征之間的關系，我們發(fā)現(xiàn)，MAGE-C2 mRNA及蛋白的表達陽性組與表達陰性組在肺腺癌的臨床分期、是否轉移及分化程度方面存在明顯統(tǒng)計學差異（P＜0.05），并且在晚期、低分化、轉移組的表達量明顯高于早期、高/中分化、無轉移組。這一結果提示，MAGE-C2的高表達可能對腫瘤細胞的分化、轉移有促進作用，其具體機制有待進一步研究。

利用Cox風險比例回歸模型及Kaplan-Meier法對隨訪數(shù)據(jù)進行生存分析后，我們發(fā)現(xiàn)，MAGE-C2的高表達同臨床分期、是否轉移一樣，為肺腺癌不良預后的獨立因素。MAGE-C2表達越高，預后相對越差。因此，我們認為，MAGE-C2不僅可以用于肺腺癌的診斷，而且可

以作為肺腺癌不良預后的指標。另外，由于其特殊的免疫原性及表達限制性，MAGE-C2可能作為肺腺癌免疫治療的靶點。體外培養(yǎng)能結合MAGE-C2的細胞毒性T淋巴細胞，進而特異性殺傷體內腫瘤細胞，而不對正常組織造成損害，減少了腫瘤治療的副反應[14]。同時，阻斷MAGE-C2相關的信號轉導途徑[15]，可能達到延緩腫瘤轉移、改善患者的預后目的。相信此方面的研究將會對腫瘤的臨床治療產(chǎn)生重大影響。

表2 肺腺癌預后因素的Cox風險回歸模型分析Tab 2 Cox multivariate analysis of prognostic factors of lung adenocarcinoma

圖3 MAGE-C2 mRNA及蛋白的表達情況與肺腺癌患者總生存率之間的關系（Kaplan-Meier法）Fig 3 Relationship between expression of MAGE-C2 mRNA and protein and overall survival rate of lung adenocarcinoma patients (Kaplan-Meier method)

圖2 熒光定量PCR檢測MAGE-C2 mRNA在肺腺癌中的表達情況。A：MAGE-C2 mRNA在高/中分化組和低分化組的表達情況（以高/中分化組為標準，低分組的熒光表達量）；B：MAGE-C2 mRNA在（I期+II期）組和（III期+IV期）組的表達情況（以I期+II期組為標準，III期+IV期組的熒光表達量）；C：MAGE-C2 mRNA在轉移組和無轉移組的表達情況（以無轉移組為標準，轉移組的熒光表達量）。Fig 2 Expression of MAGE-C2 mRNA was detected in lung adenocarcinoma by realtime fluorescent quantitative PCR. A:MAGE-C2 mRNA expression in well/mod differentiation group and poor differentiation group (Compared to well/mod differentiation group, expression of MAGE-C2 mRNA in poor differentiation group); B: MAGE-C2 mRNA expression in stage I+II group and stage III+IV group (Compared to stage I+II group, expression of MAGE-C2 mRNA in stage III+IV group); C: MAGE-C2 mRNA expression in metastasis group and non-metastasis group (Compared to metastasis group, expression of MAGE-C2 mRNA in non-metastasis group).

總體來看，本研究成功證實了MAGE-C2在肺腺癌組織中存在高表達，并與肺腺癌的臨床分期、是否轉移及分化程度相關，對患者的總生存期有不良影響。這表明，MAGE-C2可作為一種肺腺癌診斷及預后標志物，并可作為免疫治療靶點，在臨床應用中存在巨大潛力。