張　政，鄧月婷，王小芳，任　遠(yuǎn)，張喜民△甘肅隴神戎發(fā)藥業(yè)股份有限公司，甘肅蘭州7300；甘肅中醫(yī)藥大學(xué)

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松潘烏頭總堿半數(shù)致死量的實驗研究*

張政1，鄧月婷1，王小芳1，任遠(yuǎn)2，張喜民1△
1甘肅隴神戎發(fā)藥業(yè)股份有限公司，甘肅蘭州730101；2甘肅中醫(yī)藥大學(xué)

目的:研究松潘烏頭總堿對小鼠的半數(shù)致死量（LD50），為藥理實驗和臨床安全合理用藥提供依據(jù)。方法:將松潘烏頭粉碎后，用碳酸鈉溶液浸潤，經(jīng)乙醇超聲提取，硫酸溶解，氨水調(diào)pH，用乙醚：氯仿（3：1）混合溶液萃取，得松潘烏頭總堿。根據(jù)預(yù)實驗結(jié)果將60只小鼠分為6組，按照200、160、128、102.4、81.9、65.5mg/kg的劑量一次性灌服小鼠后觀察24小時內(nèi)情況。記錄小鼠中毒癥狀及死亡情況，觀察松潘烏頭總堿的急性毒性。結(jié)果:松潘烏頭總堿經(jīng)口服給藥小鼠的LD50為119.78mg/kg，其95%可信區(qū)間為103.86～139.28 mg/kg。結(jié)論:松潘烏頭總堿有中等毒性，其半數(shù)致死量為119.78mg/kg。

松潘烏頭總堿；小鼠；半數(shù)致死量

松潘烏頭（Aconitum sungpanense Hand.-Mazz.）為毛茛科烏頭屬植物，以根入藥，主要產(chǎn)于甘肅、陜西、寧夏、山西、青海、四川。本品味辛、苦，性溫，有大毒，具有祛風(fēng)止痛、散瘀消腫之功效。民間用于跌打損傷、風(fēng)濕性和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等疾病。研究發(fā)現(xiàn)松潘烏頭中主要化學(xué)成分為生物堿，其中二萜類生物堿是其主要有效成分，也是其有毒成分［1-2］。目前，松潘烏頭研究主要集中在化學(xué)成分、藥理等作用方面。但其口服給藥的安全性文獻(xiàn)報道極少，現(xiàn)就松潘烏頭總堿的急性毒性進(jìn)行研究，以期為新藥研發(fā)與臨床安全、合理用藥等提供依據(jù)。

1　材料與方法

1.1實驗動物KM小鼠，SPF級，雌雄各半，體質(zhì)量18～22g，實驗動物質(zhì)量合格證號SCXK（甘）2011-0001，由甘肅中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供。溫度20～24℃，濕度40%～50%。小鼠每籠10只，雌雄分籠飼養(yǎng)，自由飲水，食固體飼料為SPF級，購自北京科奧協(xié)力飼料有限公司。

1.2藥物與試劑松潘烏頭采自甘肅天水，由甘肅林業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院任繼文教授鑒定為毛茛科烏頭屬植物；氯仿、乙醚、乙醇、吐溫-80均為分析純。

1.3儀器KH-500D E型數(shù)控超聲波清洗器（昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司）；RE-2000型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）；JA2603B電子天平（上海精科天美科學(xué)儀器有限公司）。

1.4實驗方法

1.4.1松潘烏頭總堿的制備取松潘烏頭藥材，粉碎后過60目篩，用10%碳酸鈉溶液浸潤，加入5倍量75%乙醇于超聲中提取30分鐘，重復(fù)提取3次，合并提取液，減壓濃縮至無醇味，加入10倍量2%硫酸溶液溶解并過濾，過濾后濾液中加入氨水調(diào)pH至9～10，用乙醚∶氯仿（3∶1）混合溶液按1∶1萃取3次，合并萃取液，減壓回收至少量，轉(zhuǎn)移至蒸發(fā)皿中蒸干，刮取浸膏至稱量瓶中，放置于硅膠真空干燥器中至恒重，備用。用酸性染料比色法測定其生物堿含量為74.35%。

1.4.2松潘烏頭總堿急性毒性實驗研究

1.4.2.1松潘烏頭總堿的配制精密稱取1.000g松潘烏頭總堿干燥品，加入新制的5%吐溫-80 50mL。超聲至完全溶解，放冷稱重，補足重量，用封口膜密封，于4℃冰箱保存，為20mg/mL母液。實驗時采用“低比稀釋法”配藥，用5%吐溫-80配制系列濃度藥液。

1.4.2.2急性毒性預(yù)實驗?zāi)康脑谟谙却_定引起0%（Dn）和100%（Dm）死亡率劑量的所在范圍。取小鼠20只，分為5組，每組4只，禁食12小時，自由飲水。按400、283、200、141、100mg/kg的給藥劑量1次灌胃給藥，記錄和觀察給藥后24小時內(nèi)的死亡情況和中毒反應(yīng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)200mg/kg時小鼠全部死亡。第2次預(yù)實驗，取小鼠20只，分為5組，每組4只，按200、140、98、68.6、48mg/kg的給藥劑量一次灌胃給藥，觀察并記錄給藥后24小時內(nèi)的死亡情況和中毒反應(yīng)，結(jié)果劑量為68.6mg/kg時，4只小鼠全部存活，確定了Dn為68.6mg/kg，Dm為200mg/kg。

1.4.2.3急性毒性實驗預(yù)實驗測得Dn為68.6mg/kg，Dm為200mg/kg，二者相差倍數(shù)為3，按表1選擇分組及劑量比值，查表以K=0.8，N=6為宜。因此6個劑量組的劑量分別為200、160、128、102.4、81.9、65.5mg/kg。將60只小鼠隨機分為6組，每組10只，雌雄各半，用苦味酸標(biāo)記。實驗前禁食不禁水12小時，一次性灌胃給藥，給藥容積為0.03m L/g，給藥后7天內(nèi)密切觀察各組動物反應(yīng)，見表1。

表1　選擇分組及劑量比值

2　結(jié)果

2.1小鼠灌胃后一般活動情況及死亡情況小鼠中毒癥狀首先是自發(fā)活動減少，接著出現(xiàn)腹式呼吸、呼吸急促、運動失調(diào)等，部分小鼠全身被毛濕潤，最終出現(xiàn)抽搐、角弓反張后死亡。中毒癥狀出現(xiàn)的時間集中在給藥后15分鐘內(nèi)，死亡時間集中在給藥后4小時內(nèi)。觀察過程中發(fā)現(xiàn)癥狀較輕的小鼠會在出現(xiàn)毒性癥狀后逐漸恢復(fù)。死后立即解剖，肉眼可見小鼠胃充盈，腸管脹氣，余未見異常。不同劑量的松潘烏頭總堿致死小鼠數(shù)量統(tǒng)計，見表2。

表2　各組小鼠死亡情況

2.2半數(shù)致死量按B l iss法統(tǒng)計各組死亡鼠數(shù)和死亡率，結(jié)果用S P SS軟件計算［3］松潘烏頭總生物堿的L D50為119.78 mg/kg，95%可信區(qū)間為103.86～139.28mg/kg。

3　討論

松潘烏頭在中醫(yī)古籍中已有記載，《神農(nóng)本草經(jīng)》曰：“主中風(fēng)，惡風(fēng)，洗洗出汗，除寒濕痹，咳逆上氣，破積聚寒熱”；《藥類法象》曰：“治風(fēng)痹血痹，半身不遂，行經(jīng)藥也?！爆F(xiàn)代藥理證明，松潘烏頭總堿有鎮(zhèn)痛、解熱、抗炎作用［4］，其鎮(zhèn)痛作用持續(xù)時間長且無耐受性和身體依賴性［5］。因其毒性，松潘烏頭的應(yīng)用受到了限制，但其顯著的療效又吸引著藥學(xué)工作者的關(guān)注，因此為進(jìn)一步開發(fā)利用，有必要對其有效成分進(jìn)行分析并提取純化，達(dá)到降低毒性，提高療效的目的。相關(guān)研究對其半數(shù)致死量進(jìn)行分析［3］，小鼠口服LD50為（8.66±0.58）mg/kg（P=0.95），為劇毒物，起藥效作用的劑量為0.5～3.0mg/kg，該文獻(xiàn)中采用的松潘烏頭總堿（含量1.14%）用藥安全性較低，不利于進(jìn)一步開發(fā)。本研究對松潘烏頭進(jìn)行提取純化，得生物堿含量為74.35%的松潘烏頭總堿，通過實驗測得松潘烏頭總堿對小鼠的LD50為119.78 mg/kg，按急性毒性分級標(biāo)準(zhǔn)分為中等毒性。同期進(jìn)行的熱板實驗與醋酸扭體實驗結(jié)果表明給藥劑量為LD50的1/40，即3mg/kg時能顯著提高小鼠痛閾、抑制小鼠扭體反應(yīng)，12mg/kg時鎮(zhèn)痛作用與嗎啡相當(dāng)，該工藝制備的松潘烏頭總堿安全窗大，為該藥物制劑的后續(xù)開發(fā)及應(yīng)用提供了安全保證。

［1］李洪剛，李廣義.松潘烏頭二萜生物堿的研究［J］.藥學(xué)學(xué)報，1988，23（6）:460-461.

［2］王銳，倪京滿，胡兆勇，等.松潘烏頭中的二萜生物堿研究［J］.蘭州醫(yī)學(xué)院學(xué)報，1991，17（4）:201-204.

［3］周一平.用SPSS軟件計算新藥的LD50［J］.藥學(xué)進(jìn)展，2003， 27（5）:314-316.

［4］楊軍英，黨月蘭.松潘烏頭總堿的抗炎解熱作用［J］.中國臨床藥理學(xué)與治療學(xué)，2003，8（4）：441-443.

［5］黨月蘭，胡兆勇，吳福祥.松潘烏頭總堿的鎮(zhèn)痛作用和身體依賴性的實驗研究［J］.中國藥物依賴性通報，2005，2（4）: 242-246.

Experim entalStudy on LethalMedian Doseof TotalA lkaloidsof SongPan WuTou

ZHANG Zheng1，DENG Yueting1，WANG Xiaofang1，REN Yuan2，ZHANG Ximin1△
1 Gansu Longshen Rongfa Pharmaceutical Company，Ltd.，Lanzhou 730101，China；2 Gansu University of Traditional Chinese Medicine

Objective:To provide the reference for pharmacological experiment and rationalmedication in clinic by study lethalmedian dose of total alkaloids of SongPan WuTou（Aconitum sungpanense Hand.-Mazz.）. Methods:Total alkaloids of SongPan WuTou were obtained by smashing SongPan WuTou，soaking it in sodium carbonate solution，processing by ethanol ultrasonic extraction，dissolving in sulphuric acid，adjusting the pH of the solution，extracting by themixture of aether and chloroform.According to the results of prelim inary experiment，sixtym icewere random ized into six groups，the conditionsw ithin 24 hourswere observed after themice received gavage of total alkaloids of SongPan WuTou according to the doses:200，160，128，102.4，81.9 and 65.5mg/kg. Poisoning symptomsand the death of them icewere recorded to observe acute toxicity of total alkaloids of SongPan WuTou.Results:LD50of totalalkaloidsof SongPan WuTou w as119.78mg/kg，its95%credibility intervalsw ere from 103.86to139.28mg/kg.Conclusion:Totalalkaloidsof SongPanWuTou showmoderatetoxicity，anditsLD50is119.78mg/kg.

totalalkaloidsof SongPan WuTou；mice；lethalmedian dose

R285.5

A

1004-6852（2016）03-0019-03

2014-12-28

蘭州市科技局項目蘭州市2011年創(chuàng)新人才團(tuán)隊培育計劃（編號2011-1-140）。

張政（1985—），女，碩士學(xué)位，工程師。研究方向：新藥研究與開發(fā)。

△張喜民（1956—），男，正高級工程師。研究方向：新藥研究與開發(fā)。