沈紅勝，許惠琴，陸春紅，戴國英，徐　康，呂　興，陳玉萍，吳云皓

(1. 南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，2.江蘇省中藥藥效與安全性評價重點實驗室，江蘇 南京　210023)

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山茱萸環(huán)烯醚萜苷類成分對AGEs誘導(dǎo)HUVEC損傷的保護作用

沈紅勝1,2，許惠琴1,2，陸春紅1,2，戴國英1,2，徐康1,2，呂興1,2，陳玉萍1,2，吳云皓1,2

(1. 南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，2.江蘇省中藥藥效與安全性評價重點實驗室，江蘇 南京210023)

doi:10.3969/j.issn.1001-1978.2016.08.007

目的探討山茱萸環(huán)烯醚萜苷類特征成分馬錢苷、莫諾苷對糖基化終末產(chǎn)物(AGEs)誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)損傷的保護作用。方法體外培養(yǎng)HUVEC，用馬錢苷、莫諾苷(終濃度分別為100、10、1 μmol·L-1)預(yù)孵1 h后，再加入AGEs(200 mg·L-1)刺激，并設(shè)氨基胍為陽性對照，孵育24 h后，采用MTT法檢測馬錢苷、莫諾苷對HUVEC增殖率的影響；采用試劑盒檢測細(xì)胞上清液中一氧化氮(NO)、內(nèi)皮素(ET-1)、單核細(xì)胞趨化蛋白-1(MCP-1)和血管細(xì)胞黏附分子-1(VCAM-1)；采用Western blot法檢測HUVEC中糖基化終末產(chǎn)物受體(RAGE)、核轉(zhuǎn)錄因子(NF-κB)的蛋白表達(dá)。結(jié)果山茱萸環(huán)烯醚萜苷類特征成分馬錢苷、莫諾苷能抑制AGEs導(dǎo)致的HUVEC損傷，與空白對照組比較，模型組細(xì)胞RAGE、NF-κB蛋白表達(dá)上調(diào)(P<0.01)，ET-1、MCP-1、VCAM-1分泌增加(P<0.01)，NO水平降低(P<0.01)。馬錢苷、莫諾苷給藥組能不同程度地下調(diào)RAGE、NF-κB蛋白表達(dá)，減少ET-1、MCP-1、VCAM-1分泌，升高NO水平，與模型組比較差異具有顯著性(P<0.05～0.01)。結(jié)論山茱萸環(huán)烯醚萜苷類特征成分馬錢苷、莫諾苷對AGEs導(dǎo)致的HUVEC損傷具有明顯的保護作用，其作用機制為下調(diào)RAGE蛋白表達(dá)，抑制RAGE受體相關(guān)NF-κB信號通路發(fā)揮抗炎作用，從而改善內(nèi)皮細(xì)胞功能。

山茱萸；馬錢苷；莫諾苷；糖尿?。籄GEs；HUVEC

糖尿病(diabetes mellitus,DM)以高血糖為主要特征，成為繼腫瘤、心血管疾病之后第三大嚴(yán)重威脅人類健康的慢性內(nèi)分泌代謝性疾病[1-2]。研究發(fā)現(xiàn)[3-4]，在糖尿病發(fā)生及糖尿病血管病變過程中，晚期糖基化終末產(chǎn)物(AGEs)起到了關(guān)鍵性的作用。血管內(nèi)皮細(xì)胞(vascular endothelial cell，VEC)是血管的屏障保護層，另外可產(chǎn)生和釋放各種活性物質(zhì)，維持血管正常功能和血液的供應(yīng)狀態(tài)。糖尿病血管病變發(fā)生最基本的是血管內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的受損，持續(xù)的高血糖導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞損傷及功能紊亂，增高血管內(nèi)皮通透性，還可抑制內(nèi)皮細(xì)胞的遷移、增殖[5-6]。

山茱萸環(huán)烯醚萜苷類成分能夠明顯改善糖尿病所致的內(nèi)皮細(xì)胞損傷[7],同時其特征成分馬錢苷、莫諾苷能明顯抑制糖尿病大鼠腎皮質(zhì)內(nèi)皮細(xì)胞增生，減輕內(nèi)皮細(xì)胞的腫脹程度，降低內(nèi)皮細(xì)胞間通透性，保護內(nèi)皮的完整，對糖尿病血管并發(fā)癥內(nèi)皮細(xì)胞具有明顯的保護作用[8]。因此，本實驗采用AGEs誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)損傷模型，探究山茱萸環(huán)烯醚萜苷類特征成分馬錢苷、莫諾苷保護內(nèi)皮細(xì)胞的效應(yīng)機制，為馬錢苷、莫諾苷的臨床應(yīng)用提供理論研究基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1實驗材料人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞，購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司，批號: KG110；馬錢苷(loganin，批號: M-010-140730 ) 、莫諾苷(morroniside，批號: M-011-140730),均由成都瑞芬思生物科技有限公司提供(質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98% ) ; 氨基胍(aminoguanidine)，Sigma公司進口分裝。RPMI 1640 培養(yǎng)液、胰蛋白酶(Trypsin)，美國Gibco公司；胎牛血清(FBS)，杭州四季青公司；二甲基亞砜(DMSO)、四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)，美國Sigma公司；RIPA裂解液，碧云天生物技術(shù)研究所；血管細(xì)胞黏附分子-1(VCAM-1)ELISA試劑盒，進口分裝，批號：14101201 ；單核細(xì)胞趨化蛋白-1(MCP-1)ELISA試劑盒，南京聯(lián)科生物技術(shù)有限公司，批號：E09549-1638；一氧化氮(NO)試劑盒，南京建成生物工程研究所，批號：20140613；內(nèi)皮素(ET-1)ELISA 試劑盒，進口分裝，批號：14101202；RAGE抗體，美國Abcam公司，批號：GR186177-6；NF-κB抗體，美國Abcam公司，批號：GR115355-1。

1.2儀器Synergy HT酶標(biāo)儀，美國Bio-Tek公司；二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱，日本SANYO公司；超凈工作臺，蘇州凈化設(shè)備有限公司；倒置熒光顯微鏡(Ti型)，日本尼康公司。

1.3方法

1.3.1AGEs的制備[9]將牛血清白蛋白(BSA)在0.2 mol·L-1磷酸鹽緩沖液(PBS，pH 7.4)中配制成50 g·L-1，同時將葡萄糖在上述液體中配制成0.5 mol·L-1，充分溶解，37℃避光孵育3個月，使其形成AGEs-BSA。同時，平行條件下配制不加入葡萄糖的上述BSA溶液，以制備無糖基化BSA(0-BSA)作為對照。待AGEs形成后，用孔徑為分子質(zhì)量1萬的透析袋低溫透析24 h，除去未反應(yīng)的葡萄糖。用0.22 μm濾器過濾除菌后保存于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2細(xì)胞培養(yǎng)HUVEC采用10%FBS RPMI 1640培養(yǎng)液培養(yǎng)，按1 ∶3比例進行傳代培養(yǎng)，每2～3 d換液1次，傳代至第5～7代的細(xì)胞用于實驗。

1.3.3MTT法檢測細(xì)胞增殖取對數(shù)生長期的分化成熟細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度至5×107·L-1，接種于96孔板，每孔100 μL，于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)24 h。當(dāng)細(xì)胞貼壁生長至80%～90%融合狀態(tài)時，換無FBS RPMI 1640培養(yǎng)液饑餓培養(yǎng)23 h，加入氨基胍、馬錢苷、莫諾苷(終濃度分別為100、10、1 μmol·L-1)預(yù)孵1 h后，加入終濃度為200 mg·L-1的AGEs刺激，同時設(shè)模型組和空白對照組。24 h后，每孔加入5 g·L-1的MTT溶液20 μL，繼續(xù)孵育4 h，吸棄孔中培養(yǎng)上清液，每孔加入150 μL的DMSO，震蕩混勻10 min，酶標(biāo)儀測定490 nm處各孔的吸光度(A)值，計算細(xì)胞存活率。

細(xì)胞增殖保護率/%=[(OD給藥組-OD模型組)/OD模型組]×100%

1.3.4試劑盒檢測細(xì)胞上清液中細(xì)胞因子的表達(dá)取對數(shù)生長期的HUVEC，以1×108·L-1密度接種于24孔板內(nèi)，設(shè)4復(fù)孔。按“1.3.3”項中方法制備饑餓后的HUVEC，加入氨基胍、馬錢苷、莫諾苷(終濃度分別為100、10、1 μmol·L-1)預(yù)孵1 h后，加入終濃度為200 mg·L-1的AGEs，同時設(shè)模型組及空白對照組。24 h后，分離細(xì)胞與上清液，用對應(yīng)的試劑盒檢測細(xì)胞上清液中NO、ET、MCP-1、VCAM-1水平。

1.3.5Western blot檢測RAGE、NF-κB蛋白表達(dá)取對數(shù)生長期細(xì)胞，以2×108·L-1密度接種于6孔板，按“1.3.3”項中方法制備饑餓后的HUVEC，加入氨基胍、馬錢苷、莫諾苷(終濃度為10 μmol·L-1)預(yù)孵1 h后，加入終濃度為200 mg·L-1的AGEs，同時設(shè)模型組及空白對照組。離心收集細(xì)胞，用RIPA裂解液提取細(xì)胞總蛋白，并測定蛋白濃度。蛋白樣品加入1/4體積的4×蛋白上樣緩沖液，沸水煮沸5 min，進行SDS-PAGE凝膠電泳，然后轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，按約0.1 mL·cm-2量加入封閉液封閉1 h，一抗4℃過夜。次日PBST漂洗3次，加入辣根過氧化酶標(biāo)記的二抗，室溫孵育2 h，ECL顯色。利用Image J軟件分析各組灰度值，以β-actin為內(nèi)參，計算各蛋白的變化。

2　結(jié)果

2.1馬錢苷、莫諾苷對AGEs損傷HUVEC存活率的影響給予AGEs刺激24 h后，與空白對照組比較，模型組細(xì)胞OD值明顯降低(P<0.01)；與模型組比較，氨基胍組在終濃度100、10 μmol·L-1時，馬錢苷、莫諾苷在終濃度100、10、1 μmol·L-1時，對AGEs損傷HUVEC具有明顯的保護作用(P<0.05～0.01)，且呈濃度相關(guān)性。見Tab 1。

2.2馬錢苷、莫諾苷對AGEs損傷HUVEC后MCP-1、VCAM-1的影響給予AGEs刺激24h后，與空白對照組比較，模型組細(xì)胞產(chǎn)生的MCP-1、VCAM-1明顯升高(P<0.01)；與模型組比較，氨基胍、莫諾苷、馬錢苷(終濃度為100、10、1 μmol·L-1)對AGEs損傷HUVEC細(xì)胞產(chǎn)生的MCP-1、VCAM-1具有明顯的抑制作用(P<0.05～0.01)。見Tab 2。

Tab 1　Effect of loganin and morroniside on cell viability of HUVEC induced by ±s,n=6)

##P<0.01vsvehicle;*P<0.05,**P<0.01vsmodel

GroupConcentration/μmol·L-1MCP-1/μg·L-1VCAM-1/μg·L-1Vehicle-246.75±72.150.72±0.06Model-580.50±50.74##1.05±0.08##Aminoguanidine100344.20±38.38**0.68±0.11**10370.50±63.57**0.73±0.17*1423.00±46.73**0.82±0.11*Loganin100334.20±31.19**0.72±0.09**10368.00±12.25**0.83±0.09*1400.50±26.61**0.89±0.13Morroniside100323.00±42.43**0.71±0.06**10345.50±16.58**0.85±0.09*1379.20±23.23**0.91±0.04*

##P<0.01vsvehicle;*P<0.05,**P<0.01vsmodel

2.3馬錢苷、莫諾苷對AGEs損傷HUVEC后NO、ET-1的影響給予AGEs刺激24 h后，與空白對照組比較，模型組細(xì)胞產(chǎn)生的NO明顯降低(P<0.01), ET-1明顯升高(P<0.01)；與模型組比較，氨基胍、馬錢苷、莫諾苷(終濃度為100、10、1 μmol·L-1)對AGEs損傷HUVEC細(xì)胞產(chǎn)生的NO具有明顯的促進作用(P<0.01);氨基胍(終濃度為100、10、1 μmol·L-1)、馬錢苷(終濃度為100、10 μmol·L-1)、莫諾苷(終濃度為100 μmol·L-1)對AGEs損傷HUVEC細(xì)胞產(chǎn)生的ET-1具有明顯的抑制作用(P<0.05～0.01)。見Tab 3。

2.4馬錢苷、莫諾苷對AGEs損傷HUVEC的RAGE、NF-κB蛋白表達(dá)的影響給予AGEs刺激24 h后，與空白對照組比較，模型組RAGE、NF-κB蛋白表達(dá)明顯增加(P<0.01)；與模型組比較，氨基胍、馬錢苷、莫諾苷組(終濃度為10 μmol·L-1)的RAGE、NF-κB蛋白表達(dá)明顯下調(diào)(P<0.05～0.01)。見Fig 1、Fig 2。

GroupConcentration/μmol·L-1NO/μmol·L-1ET-1/μg·L-1Vehicle-497.19±15.7613.87±1.80Model-436.87±18.27##20.08±2.16##Aminoguanidine100519.37±3.89**14.51±1.31**10495.00±7.14**14.81±3.39*1492.19±5.98**15.32±1.14**Loganin100635.62±14.01**12.76±1.28**10584.06±8.92**15.87±2.06*1547.19±9.26**17.43±3.55Morroniside100653.12±16.79**14.00±2.05**10649.37±18.78**15.80±4.251619.69±7.99**16.34±3.01

##P<0.01vsvehicle;*P<0.05,**P<0.01vsmodel

Fig 1　Effect of loganin and morroniside

##P<0.01vsvehicle;*P<0.05,**P<0.01vsmodel

Fig 2　Effect of loganin and morroniside

##P<0.01vsvehicle;**P<0.01vsmodel

3　討論

血管內(nèi)皮細(xì)胞作為一種機體內(nèi)的重要修復(fù)細(xì)胞，其主要功能有愈合創(chuàng)面、參與炎癥反應(yīng)、分泌細(xì)胞外基質(zhì)、生長因子等[10]。研究表明[11]，血管內(nèi)皮功能紊亂是糖尿病血管并發(fā)癥的關(guān)鍵性環(huán)節(jié)。AGEs是非酶糖基化反應(yīng)的終末產(chǎn)物，糖尿病條件下AGEs形成速率加快并大量累積，因此，糖基終末化產(chǎn)物受體(RAGE)與AGEs結(jié)合增多及活性增強，誘導(dǎo)NF-κB的活化，并由胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到胞核中，啟動多種靶基因的轉(zhuǎn)錄[12]，影響MCP-1、VCAM-1等表達(dá)，進而引起內(nèi)皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)的發(fā)生。另外，還可影響NO/ET 的平衡[13]，改變內(nèi)皮細(xì)胞功能，引起細(xì)胞膜通透性的變化。NF-κB激活后又作為一種正反饋，促進AGEs與RAGE的結(jié)合。

越來越多的證據(jù)表明，炎癥反應(yīng)是引起糖尿病血管病變的重要因素之一。MCP-1是趨化因子超家族CC亞群的成員之一，具有誘導(dǎo)、激活單核巨噬細(xì)胞的作用。正常情況下，HUVEC等多種機體細(xì)胞分泌少量MCP-1，在機體內(nèi)保持平衡，維持正常生理功能。但在糖尿病條件時，多種因素誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞趨化因子表達(dá)增強，MCP-1分泌增多[14]。 MCP-1還可促進HUVEC表達(dá)VCAM-1，后者可介導(dǎo)HUVEC和白細(xì)胞黏附緊密,并相互作用、相互激活,促進黏附分子、趨化因子、細(xì)胞因子大量表達(dá),擴大炎癥反應(yīng)[15]。因此，MCP-1和VCAM-1介導(dǎo)的單核細(xì)胞遷移和對內(nèi)皮細(xì)胞的黏附是誘發(fā)血管內(nèi)炎性反應(yīng)的關(guān)鍵步驟，是衡量病變過程中炎性反應(yīng)程度的特征指標(biāo)。NO和內(nèi)皮素(ET-1)是一對調(diào)節(jié)血管舒張收縮功能的活性物質(zhì)，ET-1的升高及NO的降低，可引起血管收縮、微循環(huán)障礙，從而導(dǎo)致血管內(nèi)皮依賴性舒張功能減退。NO是內(nèi)源性血管舒張因子，因此血管內(nèi)NO降低，是糖尿病血管病變的發(fā)病機制之一。ET-1是一種具有強烈收縮血管作用的活性多肽，它是由血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌的所知作用最強、最持久的縮血管多肽物質(zhì)，在內(nèi)皮損傷時,ET-1的合成與釋放明顯增加,故被認(rèn)為是血管內(nèi)皮功能損傷的分子標(biāo)志物之一[16]。研究表明,NO與ET-1的動態(tài)平衡對于內(nèi)皮功能的調(diào)節(jié)至關(guān)重要。因此，NO 與ET-1含量變化是反映內(nèi)皮細(xì)胞功能改變的重要指標(biāo)之一。

本實驗通過AGEs直接刺激HUVEC 24h，研究馬錢苷、莫諾苷對AGEs損傷HUVEC的保護作用，并探討其作用機制。結(jié)果表明，馬錢苷、莫諾苷可減輕AGEs誘導(dǎo)的HUVEC損傷，并促進HUVEC的增殖，且隨著濃度的升高而增強；同時，馬錢苷、莫諾苷可明顯下調(diào)HUVEC中RAGE蛋白的表達(dá)，提示馬錢苷、莫諾苷保護HUVEC損傷可能與降低RAGE表達(dá)有關(guān)。NF-κB為介導(dǎo)炎癥反應(yīng)的啟動因子，馬錢苷、莫諾苷可有效抑制NF-κB的表達(dá)，減少MCP-1和VCAM-1的分泌，抑制炎性反應(yīng)。另外，馬錢苷、莫諾苷可恢復(fù)NO和ET-1間的動態(tài)平衡，改善內(nèi)皮細(xì)胞功能。綜上所述，馬錢苷、莫諾苷對AGEs誘導(dǎo)的HUVEC損傷具有保護作用，其機制可能為下調(diào)RAGE蛋白表達(dá)，抑制RAGE受體相關(guān)NF-κB信號通路發(fā)揮抗炎作用，從而改善內(nèi)皮細(xì)胞功能。

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Protective effect of loganin and morroniside on HUVEC injury induced by advanced glycation end products

SHEN Hong-sheng1,2, XU Hui-qin1,2, LU Chun-hong1,2,DAI Guo-ying1,2,XU Kang1,2, LYU Xing1,2, CHEN Yu-ping1,2, WU Yun-hao1,2

(1.CollegeofPharmacy,NanjingUniversityofChineseMedicine,2.JiangsuKeyLaboratoryforPharmacologyandSafetyEvaluationofChineseMateriaMedica,Nanjing210023,China)

AimTo observe the protective mechanism of loganinand morroniside(active components inCornusofficinalis) on HUVEC injury induced by advanced glycation end products(AGEs).MethodsHUVECs were culturedinvitroand divided into control group, model group(AGEs group), loganin group, morroniside group and aminoguanidine group(set as positive control). After being incubated with loganin and morroniside(final concentrations were 100,10,1 μmol·L-1) for 1 h, HUVECs were stimulated by AGEs of 200 mg·L-1for 24 h. Then, the cell viability was measured by using MTT method. The supernatant was extracted and the levels of NO,ET-1,MCP-1,VCAM-1 were measured by the corresponding kits. Receptors of advanced glycation end products(RAGE) and NF-κB in HUVEC were detected by Western blot.ResultsLoganin and morroniside could inhibit HUVEC injury induced by AGEs. In model group,the contents of ET-1,MCP-1,VCAM-1 increased(P<0.01),the content of NO decreased(P<0.01) and the expression of RAGE and NF-κB increased(P<0.01); however,loganin and morronside could reduce the ET-1,MCP-1,VCAM-1contents,increase the NO content and down-regulate the expression of RAGE and NF-κB to different extents.ConclusionLoganin and morroniside could ameliorate HUVEC injury, and its mechanism may be related to inhibit inflammation,the improvement of endothelial cell function, and the decrease of the expression of RAGE.

CornusofficinalisSieb. et Zucc.; loganin; morroniside; diabetes mellitus; AGEs; HUVEC

2016-04-07,

2016-05-10

國家自然科學(xué)基金資助項目(No 81374029, 81073111)；江蘇高校優(yōu)勢學(xué)科建設(shè)工程資助項目(No nzyzyxjp1006)

沈紅勝(1992-)，男，碩士生，研究方向：內(nèi)分泌藥理學(xué)，E-mail: 1375358145@qq.com;

許惠琴(1961-)，女，博士，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：內(nèi)分泌藥理學(xué)，通訊作者，E-mail: hqxu309@sina.com

A

1001-1978(2016)08-1063-05

R284.1；R322.123；R329.24；R587.1；R977.6

網(wǎng)絡(luò)出版時間：2016-7-19 10:43網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20160719.1043.014.html

◇論著◇