張晶晶，謝永富，胡建峰，劉會(huì)晶，孫宏勛（河北醫(yī)科大學(xué)第三醫(yī)院 檢驗(yàn)科，河北 石家莊 050051）

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乙型肝炎病毒蛋白誘導(dǎo)白細(xì)胞介素32表達(dá)情況的研究

張晶晶，謝永富，胡建峰，劉會(huì)晶，孫宏勛
（河北醫(yī)科大學(xué)第三醫(yī)院 檢驗(yàn)科，河北 石家莊 050051）

目的探討乙型肝炎病毒蛋白誘導(dǎo)白細(xì)胞介素32（IL-32）的表達(dá)以及臨床意義。方法用Lipofectamine 2000TM介導(dǎo)轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞。轉(zhuǎn)染48 h后，采用聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR），蛋白免疫印跡法（Western blot）分別檢測(cè)HepG2細(xì)胞中IL-32的mRNA及蛋白的表達(dá)量。結(jié)果RT-PCR結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染HBV的HepG2細(xì)胞中IL-32 mRNA的表達(dá)量比轉(zhuǎn)染空載體（未轉(zhuǎn)染）的細(xì)胞中IL-32 mRNA高2.3倍；Western blot結(jié)果顯示與空載體轉(zhuǎn)染的HepG2細(xì)胞比較，轉(zhuǎn)染pIRES2-HBV-EGFP的HepG2細(xì)胞中IL-32蛋白質(zhì)表達(dá)增高，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論HBV促進(jìn)IL-32蛋白的表達(dá)，從而證實(shí)乙型肝炎的嚴(yán)重程度與IL-32的表達(dá)有關(guān)。

乙型肝炎病毒蛋白；IL-32；表達(dá)；研究

乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）感染是目前嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康的病毒之一。HBV感染肝細(xì)胞后不僅極易引起急性肝炎、慢性肝炎和肝硬化等疾病，而且還會(huì)提高肝癌的發(fā)生率［1］。HBV感染宿主后，正常的免疫應(yīng)答可以清除乙肝病毒，表現(xiàn)為急性一過(guò)性的感染。若是細(xì)胞免疫功能低下或紊亂者，則無(wú)法清除乙肝病毒，最終將成為慢性感染者［2］。白細(xì)胞介素32（Interleukin，IL-32）是一種重要的炎癥因子，主要經(jīng)免疫細(xì)胞表達(dá)，IL-32為促炎因子。IL-32在丙型肝炎病毒、人乳頭狀瘤病毒引起的炎癥性疾病中發(fā)揮重要作用［3-4］。IL-32是否參與乙型病毒性肝炎的發(fā)病，國(guó)內(nèi)外研究甚少，本研究在分子生化水平對(duì)HBV是否誘導(dǎo)IL-32的表達(dá)進(jìn)行初步探索。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

細(xì)胞株：人肝癌細(xì)胞株HepG2細(xì)胞（購(gòu)自北京協(xié)和技術(shù)所細(xì)胞庫(kù)），主要試劑：主要試劑及來(lái)源見(jiàn)表1。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)HepG2細(xì)胞培養(yǎng)在含10%胎牛血清、10%青鏈雙抗的DMEM培養(yǎng)基中，于37℃、5%二氧化碳CO2條件下培養(yǎng)，待貼壁細(xì)胞處于生長(zhǎng)期時(shí)進(jìn)行傳代。

1.2.2質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞用脂質(zhì)體 Lipofectamine 2000TM介導(dǎo)轉(zhuǎn)染，在轉(zhuǎn)染前1 d換用不含雙抗的培養(yǎng)液，調(diào)整HepG2細(xì)胞濃度為1×105個(gè)/rat，將其接種于24孔板中，每孔1 ml。用OPTI-MEM稀釋質(zhì)粒和脂質(zhì)體，當(dāng)細(xì)胞貼壁密度達(dá)到90%融合時(shí)，把質(zhì)粒、脂質(zhì)體混合物加至細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染6 h后更換培養(yǎng)液為含雙抗的培養(yǎng)液，第2天熒光下觀察轉(zhuǎn)染率達(dá)50%。

1.2.3RT-PCR檢測(cè)HBV轉(zhuǎn)染IL-32 mRNA的表達(dá)量將上述細(xì)胞培養(yǎng)48 h后，除去培養(yǎng)液，用PBS（phosphate-buffered saline，PBS）洗2次，然后加入Trizol。按試劑盒說(shuō)明提取總RNA。采用分光光度法（A260/280 nm值）檢測(cè)每一個(gè)RNA樣本的質(zhì)量。利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒對(duì)總RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。采用SYBR GreenⅠ染料法對(duì)IL-32基因的表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè)，反應(yīng)體系為25μl：2×Power SYBR Green PCR Master Mix（Applied Bio-system）10μl，10μmol/L的正反向引物各加1μl，模板為總RNA逆轉(zhuǎn)錄所得的cDNA，用滅菌雙蒸水補(bǔ)足至25μl。各處理組分別做3～4個(gè)平行樣品，每個(gè)樣品再分別平行做3個(gè)重復(fù)。各個(gè)樣品的反應(yīng)條件為：95℃、3 min，40個(gè)循環(huán)：95℃、15 s，60℃、45 s；60℃延伸步驟進(jìn)行熒光信號(hào)的采集。反應(yīng)結(jié)束后，收集本反應(yīng)體系的融解曲線，以此分析PCR產(chǎn)物的特異性。目的基因相對(duì)表達(dá)量分析方法采用 2-△△CT法計(jì)算。IL-32引物參照KOBAYASHI等［5］：正向引物5'-CGACTTCAAAGAGG GCTACC-3'，反向引物5'-GAGTGAGCTCTGGGTGC TG-3'；β-actin引物：正向引物5'-TCGTCCACCGCA AATGCTTCTAG-3'，反向引物5'-ACTGCTGTCACCT FCACCGTTCC-3'，采用雙△t法計(jì)算結(jié)果。

1.2.4蛋白免疫印跡法（Western blot）檢測(cè)HBV轉(zhuǎn)染IL-32蛋白的表達(dá)量影響收集未轉(zhuǎn)染以及轉(zhuǎn)染48 h的細(xì)胞，沖洗2次，置放射免疫沉淀分析緩沖液中萃取蛋白，置冰上30 min。采用超聲勻漿器處理標(biāo)本，用未轉(zhuǎn)染細(xì)胞做對(duì)照，采用Lowry法測(cè)定蛋白濃度。采用10%SDS-PAGE（150 V，2 h）分離蛋白，并轉(zhuǎn)到硝酸纖維膜上，用5%的牛血清白蛋白封閉1 h，加1∶2 000的Mouse anti-IL-32單抗孵育過(guò)夜，第2天，沖洗掉一抗，在用1∶5 000的辣根過(guò)氧化酶結(jié)合的Goat anti-mouse IgG孵育1 h。采用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)蛋白質(zhì)。Mouse-anti-β-actin單克隆抗體作為內(nèi)對(duì)照。

表1　試劑列表

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩組間比較用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1HBV對(duì)IL-32 mRNA的表達(dá)量的影響

實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染HBV 48 h后的HepG2細(xì)胞，比轉(zhuǎn)染空載體（未轉(zhuǎn)染）的細(xì)胞中的IL-32 mRNA表達(dá)量高2.3倍（見(jiàn)圖1，2和表2），并且溶解曲線顯示IL-32，以及β-actin的引物特異性良好，進(jìn)一步顯示數(shù)據(jù)具有可靠性。

結(jié)果可見(jiàn)，通過(guò)對(duì)未轉(zhuǎn)染細(xì)胞和轉(zhuǎn)染細(xì)胞中βactin統(tǒng)計(jì)分析可以看出，β-actin表達(dá)在兩組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而對(duì)未轉(zhuǎn)染細(xì)胞和轉(zhuǎn)染細(xì)胞中RNA IL-32 mRNA的含量可以看出未轉(zhuǎn)染細(xì)胞RNA IL-32 mRNA表達(dá)明顯高于轉(zhuǎn)染細(xì)胞，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)表2。

2.2HBV對(duì)IL-32蛋白的表達(dá)量的影響

圖1　未轉(zhuǎn)染細(xì)胞中IL-32及β-actin的擴(kuò)增曲線

圖2　轉(zhuǎn)染細(xì)胞中IL-32及β-actin的擴(kuò)增曲線

Western blot結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染48h的HepG2細(xì)胞，與空載體轉(zhuǎn)染的HepG2細(xì)胞比較，轉(zhuǎn)染HBV的HepG2細(xì)胞中IL-32蛋白質(zhì)表達(dá)顯著增高（P＜0.05）。見(jiàn)表3和圖3。

表2　HBV對(duì)IL-32 mRNA的表達(dá)量影響 （dRn±s）

表2　HBV對(duì)IL-32 mRNA的表達(dá)量影響 （dRn±s）

表3　HBV對(duì)IL-32蛋白的表達(dá)量的影響

圖3　Western blot結(jié)果圖

3　討論

近年的研究［6-7］證實(shí)，細(xì)胞因子在HBV感染所引起的肝損傷中發(fā)揮重要作用。許春梅等［8］檢測(cè)HBV患者血清中IL-32水平，發(fā)現(xiàn)IL-32水平與HBV感染者的炎癥嚴(yán)重程度相關(guān)，并且隨炎癥程度的加重IL-32呈上升趨勢(shì)。PAN等［9］證明HBV的X蛋白（HBx）通過(guò)IL-32的啟動(dòng)子（從-746到+25）以劑量依賴(lài)的方式增強(qiáng)IL-32的表達(dá)。IL-32是2005年KIMETAL［10］在用基因芯片方法研究IL-18可誘導(dǎo)基因時(shí)發(fā)現(xiàn)的一種新型白細(xì)胞介素。越來(lái)越多的研究表明，IL-32在機(jī)體的免疫調(diào)節(jié)方面發(fā)揮著重要作用，它與慢性炎癥性疾病、細(xì)菌感染性疾病、腫瘤和病毒感染性疾病等密切相關(guān)［11］。疾病中所起的作用不同，IL-32可以誘導(dǎo)IL-1β、IL-6、IL-8、TNFα及MIP-2等細(xì)胞因子的表達(dá)，與HCV［3］、HPV等［12］多種病毒感染引起的疾病的發(fā)病密切相關(guān)。IL-32基因位于人染色體16p13.3上，有8個(gè)外顯子，有6種以上剪接變異體，目前比較明確的是 IL-32α、IL-32β、IL-32γ、IL-32δ、IL-32ε和IL-32ζ6種［13］。

IL-32可由多種細(xì)胞刺激產(chǎn)生，如T淋巴細(xì)胞可在絲裂原等的刺激下、在IL-12和IL-18的共同作用下或在TNF-α的作用下產(chǎn)生，NK細(xì)胞可在IL-12和IL-18的共同作用下產(chǎn)生，單核細(xì)胞和B細(xì)胞均可在活化T細(xì)胞的輔助下產(chǎn)生，上皮細(xì)胞在IFN-γ的作用下亦可產(chǎn)生等［14］。本研究中顯示轉(zhuǎn)染HBV的HepG2細(xì)胞比未轉(zhuǎn)染的HepG2細(xì)胞中的 IL-32 mRNA的表達(dá)量高2.3倍，說(shuō)明HBV促使IL-32 mRNA的表達(dá)，是由于HBV感染引起肝損傷與增加炎癥因子的表達(dá)有關(guān)。同時(shí)，本研究結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染HBV的HepG2細(xì)胞中IL-32蛋白比未轉(zhuǎn)染HBV的細(xì)胞中IL-32蛋白表達(dá)量高，說(shuō)明HBV促進(jìn)HepG2細(xì)胞中的IL-32蛋白的表達(dá)。本研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染HBV表達(dá)載體的HepG2細(xì)胞內(nèi)及培養(yǎng)上清液中均表達(dá)IL-32，分泌表達(dá)的IL-32可通過(guò)誘導(dǎo)其他炎癥細(xì)胞因子的表達(dá)而引起炎癥疾病的發(fā)生，進(jìn)一步從蛋白水平說(shuō)明HBV感染引起肝損傷與增加炎癥因子的表達(dá)有關(guān)。

綜上所述，本文通過(guò)檢測(cè)轉(zhuǎn)染及未轉(zhuǎn)染HBV的HepG2細(xì)胞中的IL-32 mRNA及蛋白的表達(dá)量，探究HBV對(duì)IL-32的表達(dá)，研究結(jié)果證明HBV對(duì)IL-32的mRNA及蛋白的表達(dá)均有促進(jìn)作用。

［1］CROWTHER C，MOWA M B，ELY A，ARBUTHNOT P B.Inhibition of hepatitis B virus replication in vivo using helper-dependent adenovirus vectors to deliver antiviral RNAi expression cassettes［J］.Antivir Ther，2013，25（1）:72-86.

［2］BILITY M T I，CHENG L I，ZHANG Z，et al.Hepatitis B virus infection and immunopathogenesis in a humanized mouse model: inductionofhuman-specificliverfibrosisandM2-like macrophages［J］.PLoS Pathog，2014，20（3）:29-60.

［3］MOSCHEN A R，F(xiàn)RITZ T，CLOUSTON A D，et al.Interleukin-32:anewproinflammatorycytokineinvolvedinhepatitisC virus-related liver inflammation and fibrosis［J］.Hepatology，2011，53（6）:1819-1829.

［4］LEE S，KIM J H，KIM H，et al.Activation of the interleukin-32 pro-inflammatory pathway in response To human papilloma virus infection and over-expression of interleukin-32 controls the expression of the human papilloma virus oncogene［J］.Immunology，2011，132（3）:410-420.

［5］KOBAYASHI H，LIN P C.Molecular characterization of IL-32 in human endothelial cell［J］.Cytokine，2011，46（3）:351-358.

［6］ZHOU Y，WANG S，MA J W，et al.Hepatitis B virus protein X-induced expression of the CXC chemokine IP-10 is mediated through activation of NF-kappa B and increases migration of leukocytes［J］.J Biol Chem，2010，285（16）:12159-12168.

［7］ZHANG K，XU Q H，CHEN L B，et al.The measurement and significanceofserumchcmeokineRANTESinpatientswith chronic hepatitis B［J］.Chin J Exp Clin Virol，2012，22（12）:293-295.

［8］許春梅，左維澤，沈蘭超.白介素-32在HBV感染者的變化及其臨床意義［J］.現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2010，10（2）:298-301.

［9］PAN X，CAO H，LU J，et al.Interleukin-32 expression induced by hepatitis B virus protein X is mediated through activation of NF-κB［J］.Mol Immunol，2011，48（12/13）:1573-1577.

［10］KIM S H，HAN SY，AZAM T，et al.Interleukin-32:a cytokine and inducer of TNF-alpha［J］.Immunity，2005，22（1）:131-142.

［11］田兆菊，王英，陳強(qiáng)，等.白細(xì)胞介素-32與疾病的關(guān)系研究進(jìn)展［J］.免疫學(xué)雜志，2012，28（11）:994-997.

［12］LEE S，KIM J H，KIM H，et al.Activation of the interleukin-32 proinflammatory pathway in response to human papilloma virus infection and over-expression of interleukin-32 controls the expression of the human papilloma virus oncogene［J］.Immunology，2011，132:410-420.

［13］CHOI J D，BAE S Y，HONG J W，et al.Identification of the most active interleukin-32 isoform［J］.Immunology，2009，126（4）: 535-542.

［14］NETEA M G，AZAM T，F(xiàn)ERWERDA G，et al.IL-32 synergizeswithnucleotideoligomerizationdomain（NOD）1and NOD2 ligands for IL-1 beta and IL-6 production through a caspase 1-dependent mechanism［J］.USA Proc Natl Acad Sci，2010，102（45）:16309-16314.

（張蕾編輯）

Expression of IL-32 induced by hepatitis B virus protein

Jing-jing Zhang，Yong-fu Xie，Jian-feng Hu，Hui-jing Liu，Hong-xun Sun
（Department of clinical laboratory，the Third Hospital of Hebei Medical University，Shijiazhuang，Hebei 050051，China）

Objective To investigate whether protein of hepatitis B virus induced the expression ofIL-32. Methods HepG2 was mediated transfected by Lipofectamine 2000 TM.After 48 hours，the expressions of IL-32 mRNA and protein in HepG2 cells were detected by RT-PCR and western blot respectively.Results RT-PCR result showed expressions of IL-32 mRNA in HepG2 cells transfected with HBV were 2.3 times higher than the cells transfected with empty vector（non-transfected）.Western blot result showed that，compared with the IL-32 protein in untransfected HepG2 cells，expression ofIL-32protein in transfected pIRES2-HBV-EGFP HepG2 cells was increased，and the difference was statistically significant（P＜0.05）.Conclusion The expression ofIL-32mRNA，IL-32protein in HepG2 cells is promoted by HBV.

hepatitis B virus protein；IL-32；expression；study

R575.1

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2016.16.007

1005-8982（2016）16-0035-04

2016-04-08

謝永富，E-mail：xieteng811@sohu.com；Tel：13503339862