唐麗君，胡國英，涂正波，張　碩

(1江西省食品檢驗檢測研究院，南昌　330006；2南昌市疾病預(yù)防控制中心，南昌　330038； 3江西省產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢測院，南昌　330006)

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HPLC法測定贛南臍橙中維生素B1、維生素B2含量

唐麗君1，胡國英1，涂正波2，張碩3

(1江西省食品檢驗檢測研究院，南昌330006；2南昌市疾病預(yù)防控制中心，南昌330038；3江西省產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢測院，南昌330006)

目的：建立2種不同的HPLC法測定贛南臍橙中維生素B1及維生素B2含量，通過比較，得出適合贛南臍橙維生素B1及維生素B2含量測定的最佳方法。方法：色譜條件：色譜柱：C18反相色譜柱(粒徑5μm，150 mm×4.6 mm)；流動相：0.05mol/L乙酸鈉溶液-甲醇=65∶35(pH值4.6)；流速1.0 mL/min；柱溫30 ℃；檢測波長：維生素B1激發(fā)波長375nm、發(fā)射波長435nm；維生素B2激發(fā)波長462nm、發(fā)射波長522nm。結(jié)果：維生素B1和維生素B2線形范圍是0.01～1.00μg/mL，最低檢出限為0.001μg/mL；果皮、果肉維生素B1平均回收率分別為95.3%、92.98%；果皮、果肉維生素B2平均回收率分別為89.1% 、84.6% 。結(jié)論：此方法簡單、準(zhǔn)確，可用于測定贛南臍橙中的維生素B1及維生素B2含量。

HPLC；熒光檢測器；贛南臍橙；維生素B1；維生素B2

贛南臍橙果大形正、橙紅鮮艷、光潔美觀，可食率達(dá)85%，肉質(zhì)脆嫩、化渣、風(fēng)味濃甜芳香，含果汁55%以上。目前較多報告集中在對贛南臍橙維生素C含量的研究，較少有對贛南臍橙中維生素B1及維生素B2含量的研究。B族維生素是水溶性維生素中重要的一類，其中多種是酶的輔基和酶的組成部分。目前對于食品中水溶性維生素的分析方法較多，如分光光度法、熒光法、微生物法等[1-3]，這些方法常常由于樣品基質(zhì)復(fù)雜，干擾物質(zhì)較多而使測定結(jié)果不準(zhǔn)，給定量分析帶來一定的困難。本文采用液相色譜法測定贛南臍橙中果肉及果皮中維生素B1及維生素B2的含量。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

新鮮贛南臍橙(選用信豐安西臍橙)、維生素B1、維生素B2(純度99%)，德國Dr.Ehrenstorfer GmbH公司；甲醇、乙腈、正丁醇(色譜純)，美國Honeywell公司；Milli-Q水純化系統(tǒng)，美國Millipore公司；三水乙酸鈉、鐵氰化鉀、氫氧化鈉、冰乙酸、濃鹽酸、偏磷酸，均為分析純。

1.2儀器

安捷倫液相色譜儀1200(帶紫外及熒光檢測器) ，美國Angilent公司；冷凍離心機，美國Sigma公司；均質(zhì)機，德國IKA公司；移液槍，美國ThermoElectron公司；50 mL聚乙烯管、容量瓶。

1.3方法

1.3.1標(biāo)準(zhǔn)溶液配制[4，5]

維生素標(biāo)準(zhǔn)儲備液(500μg/mL)：各稱取相當(dāng)于50 mg(精確至0.1mg)的維生素B1及維生素B2標(biāo)準(zhǔn)品，用0.01mol/L鹽酸(4.13)溶解并定容于100mL。置于0～4 ℃冰箱中，保存期為3個月。

維生素B1及維生素B2標(biāo)準(zhǔn)中間液及標(biāo)準(zhǔn)工作液：準(zhǔn)確吸取2.00mL標(biāo)準(zhǔn)儲備液，用水稀釋并定容至100mL，此溶液中維生素B1及維生素B2濃度為10μg/mL。吸取維生素B1維生素及B2標(biāo)準(zhǔn)中間液配制成標(biāo)準(zhǔn)系列濃度分別為0、0.05、0.10、0.20、0.50、1.00μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作液。臨用前配制。

1.3.2溶液配制

氫氧化鈉溶液(100g/L)：稱取25g氫氧化鈉，用水溶解并定容至250mL；鐵氰化鉀溶液(20g/L)：稱取2g鐵氰化鉀，用水溶解并定容至100mL，臨用前配制；堿性鐵氰化鉀溶液：將5mL鐵氰化鉀溶液與200mL氫氧化鈉溶液混合，臨用前配制。

1.3.3液相色譜條件

方法一(熒光檢測器)條件：色譜柱：資生堂C18反相色譜柱(粒徑5μm，150mm ×4.6 mm)或相當(dāng)者；流動相：0.05 mol/L 乙酸鈉溶液-甲醇= 65+35 (pH 4.6)；流速1.0mL/min；進(jìn)樣量20μL；柱溫30 ℃；檢測波長：維生素B1激發(fā)波長375nm、發(fā)射波長435nm；維生素B2激發(fā)波長462nm、發(fā)射波長522nm。

方法二(紫外檢測器串聯(lián)熒光檢測器)條件：色譜柱：資生堂 C18反相色譜柱(粒徑 5μm，150mm ×4.6 mm)或相當(dāng)者；0.05 mol/L乙酸鈉溶液-甲醇= 70+30 (pH4.6)；流速1.0mL/min；進(jìn)樣量20μL；柱溫30 ℃；檢測波長：維生素B1：251nm；維生素B2：激發(fā)波長 462 nm，發(fā)射波長 522 nm。

1.3.4前處理方法

方法一：稱取已混勻樣品10～20g于50mL離心管，用10 g/L偏磷酸溶液[6]調(diào)節(jié)溶液pH值4～5之間，充分搖勻加水定容至刻度，在8 000r/min條件下離心5 min，取上清液過0.45μm膜上機測定維生素B2。另取濾液10mL，按國標(biāo)GB5413.11-2010方法處理維生素B1。

方法二：稱取已混勻樣品10～20g于50mL離心管，用10 g/L偏磷酸溶液調(diào)節(jié)溶液pH值4～5之間，充分搖勻加水定容至刻度，在8 000r/min條件下離心5 min，取上清液過0.45μm膜上機測定維生素B1及維生素B2。

2　結(jié)果與分析

2.1系統(tǒng)適應(yīng)性考察[7]

考察兩種方法的系統(tǒng)適應(yīng)性，見圖1及圖2。

圖1　維生素B1及維生素B2標(biāo)樣色譜圖

圖2　維生素B1及維生素B2混合標(biāo)樣色譜圖

由圖1可見，方法一中維生素B1和維生素B2保留時間分別在2.597、3.995min，且峰型正常，無拖尾現(xiàn)象，分離效果良好。由圖2可見，方法二中維生素B1和維生素B2保留時間分別在5.487、10.103min，峰型正常，說明分離效果良好，維生素B1是在紫外251nm下測定，為了在同一條件下得到良好的圖譜峰形，維生素B1標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度是維生素B2的10倍。

2.2線性關(guān)系考察

方法一：將逐級稀釋的標(biāo)準(zhǔn)工作液分別進(jìn)樣20μL，測定結(jié)果經(jīng)線性回歸，線性范圍：維生素B1及維生素B2為0.01～1.00 μg/mL，各物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限以及定量限見表1。

表1　方法一維生素B1及維生素B2的回歸方程、相關(guān)系數(shù)和線性范圍

方法二：維生素B1將逐級稀釋的標(biāo)準(zhǔn)儲備液分別進(jìn)樣20μL，測定結(jié)果經(jīng)線性回歸，線性范圍：維生素B1為0.50～50μg/mL、維生素B2為0.01～1.00 μg/mL，各物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限以及定量限見表2。由表1及表2可見，方法一及方法二均有較好的線性關(guān)系。方法一較方法二維生素B1檢出限更低，適合測定維生素B1含量較低的物質(zhì)。

表2　方法二維生素B1及維生素B2的回歸方程、相關(guān)系數(shù)和線性范圍

2.3精密度試驗

方法一：分別精密吸取濃度為0.20μg/mL維生素B1和維生素B2標(biāo)準(zhǔn)工作液20μL，連續(xù)進(jìn)樣5次，測定峰面積，計算各水溶性維生素RSD見表3。

表3　方法一精密度試驗結(jié)果

方法二：精密吸取維生素B1(2.0μg/mL)維生素B2(0.2μg/mL)標(biāo)準(zhǔn)工作液20μL，連續(xù)進(jìn)樣5次，測定峰面積，計算各水溶性維生素RSD見表4。

表4　方法二精密度試驗結(jié)果

由表3可見，方法一的精密度試驗結(jié)果相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD變化為1.22%～3.43%，平均RSD為2.33%，滿足試驗要求，其中維生素B1精密度試驗結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差小于維生素B2精密度試驗結(jié)果。由表4可見，方法二的精密度試驗結(jié)果相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD變化為3.75%～4.24%，平均RSD為4.00%，滿足實驗要求，其中維生素B2精密度試驗結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差小于維生素B1精密度試驗結(jié)果。2種方法的精密度均良好。

2.4穩(wěn)定性試驗

方法一：將維生素B1和維生素B2標(biāo)準(zhǔn)工作液(0.20μg/mL)放置室溫條件下，并且不做避光保護(hù)，精密吸取各標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液20μL，在0、2、4、8h分別進(jìn)樣。分別記錄峰面積，考察維生素B1和維生素B2的穩(wěn)定性，結(jié)果見表5。方法二：將維生素B1(2.0μg/mL)和維生素B1(0.20μg/mL)標(biāo)準(zhǔn)工作液放置室溫條件下，并且不做避光保護(hù)，精密吸取各標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液20μL，在0、2、4、8h分別進(jìn)樣。分別記錄峰面積，考察維生素B2和維生素B1的穩(wěn)定性，結(jié)果見表6。

表5　方法一穩(wěn)定性試驗結(jié)果

表6　方法二穩(wěn)定性試驗結(jié)果

由表5及表6可見，在室溫、不做避光保護(hù)條件下，方法一中維生素B1較方法二中維生素B1穩(wěn)定性好，2種方法維生素B2穩(wěn)定性相差不大。

2.5重復(fù)性試驗

方法一：將樣品果皮及果肉取50g，平均分為5份，并按方法一進(jìn)行樣品處理，各取20μL進(jìn)行重復(fù)性試驗，用外標(biāo)法分別計算出樣品的質(zhì)量濃度，結(jié)果見表7。方法二：將樣品果皮及果肉取50g，平均分為5份，并按方法二進(jìn)行樣品處理，各取20μL 進(jìn)行重復(fù)性試驗，用外標(biāo)法分別計算出樣品的質(zhì)量濃度，結(jié)果見表8。

表7　方法一重復(fù)性試驗結(jié)果

由表7可見，樣品果皮及果肉中均含有維生素B1和維生素B2，方法一重復(fù)性試驗中結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD變化為1.40%～2.77%，滿足試驗要求。由表8可見，樣品采用方法二檢測樣品中維生素B1含量低于儀器檢出限，所以果肉及果皮均未檢出維生素B1的含量。選定方法一作為贛南臍橙維生素B1及維生素B2的檢測方法，對樣品進(jìn)行加標(biāo)回收及含量分析。

表8　方法二重復(fù)性試驗結(jié)果

2.6加標(biāo)回收率試驗

由于方法二對基質(zhì)較復(fù)雜及含量較低的維生素B1定量準(zhǔn)確度不高，因此僅對方法一進(jìn)行樣品加標(biāo)回收實驗。取樣品果肉及果皮并按方法一進(jìn)行樣品處理，在線性范圍內(nèi)，采用加標(biāo)回收的方法對準(zhǔn)確度進(jìn)行驗證。同一樣品中分別加入高、中、低3種混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個加標(biāo)濃度平行測定6次，與樣品同時前處理和測定，回收率在82.1%～101.2%之間(表9)。

表9　回收率試驗結(jié)果

2.7樣品各維生素含量

采用方法一測定：分別稱取已均勻制樣的果肉及果皮5個樣品進(jìn)行測定，平行測定3次，根據(jù)樣品色譜圖與標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖比較和分析，保留時間進(jìn)行定性分析，判斷樣品中所含水溶性維生素種類。通過外標(biāo)法計算得到樣品中相應(yīng)維生素的含量，由表10可知，維生素B1含量果肉略高于果皮、維生素B2含量果皮是果肉的3倍。

表10　樣品中維生素含量測定結(jié)果

(續(xù))

3　討論

3.1檢測波長的選擇

方法一是依據(jù)國標(biāo)方法采用熒光法測定，維生素B1(Ex：375 nm、Em：435 nm)維生素B2( Ex：462 nm、Em：522 nm)；方法二中標(biāo)準(zhǔn)品溶液分別在210～800nm 波長范圍內(nèi)掃描，發(fā)現(xiàn)維生素B1在251.3 nm處有最大吸收，這與華永有等[8]報導(dǎo)紫外掃描維生素B1在 246.8 nm 處有最大吸收相近，故本試驗方法二維生素B1采用251 nm、維生素B2用熒光(Ex：462 nm、Em：522 nm)檢測。

3.2分離條件的選擇

(1)探索了三氟乙酸/乙腈[9]、甲醇/三乙胺的磷酸二氫鉀溶液[10]、辛烷磺酸鈉/甲醇[11]、己烷磺酸鈉/甲醇[7]、乙酸鈉/甲醇[1，12]體系流動相，結(jié)果表明，方法一選用0.05 mol/L乙酸鈉溶液—甲醇=65：35，能達(dá)到良好的分離效果，且由于增加了流動相中的甲醇的比例節(jié)約了色譜分離時間；方法二選用0.05 mol/L乙酸鈉溶液—甲醇=70：30，可有效緩解拖尾峰對分離的影響，且由于降低了流動相中的甲醇的比例，維生素B1和維生素B2的出峰時間推后，減少了紫外吸收下溶劑峰的干擾，提高了維生素B1定量分析的準(zhǔn)確性。(2)探討了在相同的流動相組成、流速以及洗脫程序條件下，改變柱溫箱溫度：當(dāng)柱溫在5～35℃時，色譜峰的分離度和峰形無明顯差異，色譜峰保留時間有微小變化。綜合考慮選取柱溫30℃為最佳試驗條件。(3)探討了在相同的流動相組成、流速以及洗脫程序條件下，改變流動相pH值：采用pH值分別為3.00、3.75、4.00、4.20、4.60、4.80的醋酸鈉溶液作為流動相進(jìn)行梯度洗脫，考察流動相pH值分離的影響。pH<4.20時，方法一中維生素B1及維生素B2出峰時間分別提前，不影響分離效果；方法二中維生素B1及維生素B2保留時間比較集中，分離效果不佳。結(jié)果表明，分離效果pH值4.6時，試驗條件最佳。

3.32種方法分析比較

方法一在樣品前處理中增加了維生素B1衍生過程，其方法靈敏度較高，且色譜峰圖譜基本無雜峰，有利于樣品的定性定量分析，適用于基質(zhì)較復(fù)雜、且維生素B1含量較低的物質(zhì)；方法二的樣品前處理較方法一簡單，也具有良好的線性范圍，精密度及穩(wěn)定性，但由于維生素B1的檢測波長為251nm，在此波長下大多數(shù)物質(zhì)具有紫外吸收，影響樣品中維生素B1的定性定量分析，適合于基質(zhì)簡單，且維生素B1在樣品中含量較高的樣品，特別是一些維生素功能飲料及維生素片。

3.4樣品各維生素組分中的實際含量

臍橙中果皮與果肉中維生素B1相差不大，果皮中維生素B2含量是維生素B1含量的3倍多，對于開發(fā)利用臍橙果皮、果肉產(chǎn)品提供了可靠的參考數(shù)據(jù)。

4　結(jié)論

通過比較，選取方法一作為贛南臍橙中維生素B1及維生素B2含量測定的方法，結(jié)果表明，果肉中維生素B1含量平均值13.0μg/100g、果皮中維生素B1含量平均10.9μg/100g；果肉中維生素B2含量平均值18.6μg/100g、果皮中維生素B2含量平均值57.3μg/100g。該法靈敏度高，樣品分離效果佳，明顯提高了檢測準(zhǔn)確性和重復(fù)性?！?/p>

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(責(zé)任編輯李燕妮)

Determination on Vitamin B1and Vitamin B2in Gannan Navel Orange by HPLC

TANG Li-jun1，HU Guo-ying1，TU Zheng-bo2，ZHANG Shuo3

(1Jiangxi Institute for Food Control，Nanchang 330006，China；2Nanchang Center for Disease Control and Prevention，Nanchang 330038，China；3Jiangxi Institute of Supervision & Inspection on Product Quliaty，Nanchang 330006，China)

ObjectiveTo develop two kinds of HPLC methods for determination on vitamins B1and vitamins B2in Gannan navel orange.By comparing the two methods，results showed that it was suitable for Gannan navel orange detection method of vitamin B1and vitamin B2content.MethodC18column(5μm，150 mm× 4.60 mm)was used as stationary phase.The mobile phase was composed of 0.05 mol/L Sodium acetate solution and methanol (70：30) at pH 4.6.The flow rate was 1.0 mL/min with the column temperatureat 30℃.Excitation wavelength of vitamin B1was 375 nm，emission wavelength was 435 nm，excitation wavelength of vitamin B2was 462 nm，the emission wavelength was 522 nm.ResultThe standard curves developed exhibited a good linear over a range of 0.01～1.00μg/mL for VB1and VB2.The detection limits for VB1and VB2were 0.001μg/mL.The average recoveries of the peel and the pulp were 95.3% and 92.98% for VB1，respectively.The average recoveries of the peel and the pulp were 89.1% and 84.6% for VB2，respectively.ConclusionThis method was simple and accurate.and could be used in the determination on vitamins B1and vitamins B2in Gannan navel orange.

HPLC；fluorescence detector；Gannan navel orange；vitamin B1；vitamin B2

唐麗君(1981—)，女，碩士，工程師，研究方向：食品安全檢驗。