劉 妍，李曉璐，郭艷峰*，譚貴良

(1.中山火炬職業(yè)技術(shù)學(xué)院生物醫(yī)藥系，廣東中山 528436；2.中山市食品藥品檢驗(yàn)所，廣東中山 528437)

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魚油乙酯的制備·純化及降血脂功效的研究

劉 妍1，李曉璐1，郭艷峰1*，譚貴良2

(1.中山火炬職業(yè)技術(shù)學(xué)院生物醫(yī)藥系，廣東中山 528436；2.中山市食品藥品檢驗(yàn)所，廣東中山 528437)

[目的] 研究魚油乙酯的制備、純化及其降血脂功效。 [方法] 以魚油為原料，采用堿催化制備了魚油乙酯，優(yōu)化了條件并對其進(jìn)行純化，將產(chǎn)品配成飼料進(jìn)行動物試驗(yàn)，研究其降血脂功效。 [結(jié)果] 試驗(yàn)表明，乙醇-魚油6∶1(摩爾比)，反應(yīng)溫度75 ℃，反應(yīng)時(shí)間2 h，堿催化劑NaOH加入量為油重的0.30%；在此條件下魚油脂肪酸乙酯得率最高，經(jīng)分子蒸餾后達(dá)95%；硝酸銀最佳濃度為75%，提取得到的二十碳五烯酸(EPA)和二十二碳六烯酸(DHA)總濃度96%～99%；高含量EPA和DHA魚油能夠顯著降低小鼠血清中的總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)和低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)濃度，提高高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)濃度，可有效改善高脂血癥小鼠的血脂水平。 [結(jié)論] 研究可為魚油的深加工開發(fā)利用提供參考。

魚油乙酯；制備；純化；降血脂

魚油是一種利用價(jià)值很高的天然保健品，魚油中富含2種重要的長碳鏈多不飽和脂肪酸，即二十碳五烯酸(eicosapentaenoic acid，EPA)和二十二碳六烯酸(docosahexaenoic acid，DHA)，這2種脂肪酸具有預(yù)防心腦血管疾病、抗氧化、保護(hù)血管、預(yù)防腫瘤、調(diào)節(jié)血脂、促進(jìn)人腦及視網(wǎng)膜發(fā)育和延緩大腦衰老等多種功能[1]。自早期丹麥學(xué)者發(fā)現(xiàn)格林蘭島愛斯基摩人心腦血管疾病發(fā)病率低與他們長期食用富含DHA、EPA的海魚有關(guān)以來，EPA及DHA成為醫(yī)藥及營養(yǎng)界研究的熱點(diǎn)，魚油也因此被醫(yī)學(xué)界稱為“生命之油”[2]。

根據(jù)EPA及DHA存在的化學(xué)形式不同，魚油可分為甘油酯型、游離脂肪酸型及乙酯型3種。其中甘油酯型是將天然魚油精制后制成的膠丸；游離脂肪酸型是將魚油水解所得的富含EPA及DHA的壓丸；乙酯型是將魚油與乙醇經(jīng)酯交換反應(yīng)所得的富含EPA及DHA乙酯的產(chǎn)品[3-4]。有關(guān)魚油的營養(yǎng)功效目前已有大量的研究，研究主要針對于純EPA或DHA(脂肪酸型、乙酯型或甘油酯型)的營養(yǎng)功效方面。研究發(fā)現(xiàn)，盡管EPA和DHA都具有很多的生理功效，但它們的作用有較大的區(qū)別。以健腦、增強(qiáng)記憶力和提高視力為目的的嬰幼兒、青少年、孕婦等群體應(yīng)服用以DHA為主的產(chǎn)品，而以降低血脂、防治動脈粥樣硬化等心血管疾病群體則應(yīng)服用以EPA為主的產(chǎn)品[5]。另外，從提高人體的吸收，充分發(fā)揮制劑的功效來說，產(chǎn)品中EPA和DHA越高越好。筆者以魚油為原料，采用堿催化制備了魚油乙酯，優(yōu)化了條件并對其進(jìn)行純化，將產(chǎn)品配成飼料進(jìn)行動物試驗(yàn)，研究其降血脂功效。

1　材料與方法

1.1材料魚油，大豆油，市售；十一酸甲酯，色譜純，sigma公司；硝酸銀、氫氧化鉀、甲醇、氧化鎂、氯化鈉等化學(xué)試劑，均為國產(chǎn)分析純。健康小鼠雄性，體重16～18 g，SPF 級，廣東省實(shí)驗(yàn)動物中心；總膽固醇(TC)、甘油三脂(TG)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)和高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)試劑盒，北京中生北控生物科技股份有限公司；BSA224S-CW電子天平(Sartorius)；RE-52AA轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠；RCT恒溫加熱磁力攪拌器，德國IKA；DGX-9003鼓風(fēng)干燥箱，上海福瑪實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；6890N氣相色譜儀，安捷倫科技有限公司。

1.2方法

1.2.1魚油脂肪酸乙酯的制備。在150 mL三口瓶中加入魚油，恒溫水浴達(dá)到預(yù)設(shè)溫度后，開啟攪拌，加入乙醇和堿催化劑，密閉，冷凝回流，開始計(jì)時(shí)。之后停止反應(yīng)，降溫，轉(zhuǎn)入分液漏斗，靜置分層，除去下層催化劑和甘油，取上層，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)回收過量甲醇；用約為上層產(chǎn)物3倍體積的80 ℃的5%氯化鈉溶液洗滌，除去殘余的皂和催化劑，直至下層洗滌液清澈透明，取上層用于氣相色譜分析。

1.2.2樣品氣相色譜分析。樣品的氣相色譜分析參考文獻(xiàn)[6]而進(jìn)行。樣品經(jīng)甲酯化后，采用Agilent氣相色譜6890N分析脂肪酸甲酯含量并計(jì)算生物柴油產(chǎn)率。分析條件為：毛細(xì)管柱(DB-FFAP，0.25 mm I.D×30 m，df=0.25 μm)，程序升溫，初溫150 ℃保持3 min，然后以5 ℃/min升至220 ℃，保持6 min；氣化室溫度250 ℃，檢測器(FID)溫度330 ℃；載氣：高純氮?dú)?5 mL/min，氫氣40 mL/min，空氣450 mL/min；進(jìn)樣體積1 μL，分流進(jìn)樣，分流比30∶1。內(nèi)標(biāo)物采用十一酸甲酯。采用相對校正因子法定量。試驗(yàn)采用得率表征，計(jì)算公式如下：

脂肪酸甲酯得率(%)=脂肪酸甲酯的質(zhì)量/棕櫚油質(zhì)量×100%

1.2.3Ag+(EPA)絡(luò)合物、Ag+(DHA)絡(luò)合物的制備。參照文獻(xiàn)[7]進(jìn)行，將上述所得魚油乙酯與硝酸銀溶液室溫反應(yīng)一定時(shí)間后，放入分液漏斗，分離油層，得到Ag+(EPA)絡(luò)合物和Ag+(DHA)絡(luò)合物的混合物產(chǎn)品。

1.2.4DHA和EPA乙酯混合物的制備。 在室溫下，將以上所得Ag+(EPA)絡(luò)合物和Ag+(DHA)絡(luò)合物加入20倍體積的水，用正己烷50 mL×3萃取，有機(jī)層用無水硫酸鈉干燥，回收溶劑，得到DHA和EPA乙酯混合物[8]。

1.2.5高含量的EPA乙酯的分離制備。 在室溫下，將Ag+(EPA)絡(luò)合物和Ag+(DHA)絡(luò)合物5倍水溶解，用正己烷20 mL×3萃取，有機(jī)層用無水硫酸鈉干燥，回收溶劑。

1.2.6高含量的DHA乙酯的分離制備。在室溫下，將Ag+(EPA)絡(luò)合物和Ag+(DHA)絡(luò)合物5倍水溶解，用正己烷提取，分離有機(jī)層，水層用水稀釋20倍，再用正己烷50 mL×3萃取，得到富含DHA乙酯的產(chǎn)品。

1.2.7飼料的配制及動物試驗(yàn)設(shè)計(jì)。 將雄性小鼠隨機(jī)分為正常對照組、模型對照組、陽性對照組、乙酯型魚油對照組、低含量DHA/EPA 甘油三酯型魚油對照組和高含量DHA/EPA 甘油三酯型魚油低、中、高劑量組，每組10 只。各組動物飼料自行配制，具體成分如表1所示，其中礦物質(zhì)混合物及維生素復(fù)合物均參照AIN-93 配方(各組魚油添加量以DHA + EPA 計(jì))。試驗(yàn)周期15 周，試驗(yàn)期間小鼠自由進(jìn)食和飲水。于末次喂食后，小鼠禁食不禁水10 h，摘眼球取血，常規(guī)分離血清，保存于-20 ℃?zhèn)溆?，以試劑盒檢測TC、TG、LDL-C 和HDL-C 含量。解剖小鼠，仔細(xì)剝離肝臟，稱重，肝臟制備勻漿，離心，上清液于-80 ℃保存，備用。

表1　各試驗(yàn)組動物飼料成分

1.2.8血清脂肪濃度測定。按照文獻(xiàn)[9]的方法，血液室溫靜置30 min 后，7 500 r/min 離心獲得血清，按試劑盒說明測定TC、TG、HDL-C、LDL-C 濃度。

1.2.9肝臟脂肪濃度測定。按照文獻(xiàn)[10]的方法，制備肝臟勻漿，以氯仿和甲醇混合液(體積分?jǐn)?shù)2∶1)抽提肝臟脂質(zhì)并濃縮，肝臟TC 和TG 由試劑盒測定。

2　結(jié)果與分析

2.1堿催化制備魚油乙酯該研究優(yōu)化了堿催化魚油與乙醇反應(yīng)制備脂肪酸乙酯的工藝過程，包括乙醇-魚油摩爾比、反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)溫度、NaOH濃度，結(jié)果得到的優(yōu)化條件為：乙醇-魚油6∶1(摩爾比)，反應(yīng)溫度75 ℃，反應(yīng)時(shí)間2 h，堿催化劑NaOH加入量為油重的0.30%；在此條件下魚油脂肪酸乙酯得率最高，經(jīng)分子蒸餾后達(dá)95%。

從圖1中可以看出，當(dāng)乙醇-魚油摩爾比為6∶1時(shí)，魚油脂肪酸乙酯得率達(dá)到最高，繼續(xù)增加乙醇與魚油的摩爾比，魚油乙酯未見隨著進(jìn)一步提高。因此，在后續(xù)的過程中采用乙醇-魚油摩爾比為6∶1。反應(yīng)溫度影響反應(yīng)速率，反應(yīng)溫度提高，反應(yīng)速率隨之加快。從圖1(b)中可以看出，反應(yīng)溫度從55 ℃升至75 ℃時(shí)，魚油脂肪酸乙酯的得率隨著增加；但繼續(xù)增加至80 ℃時(shí)，脂肪酸乙酯的得率不再隨著增加。說明在既定的反應(yīng)體系中，已基本達(dá)到平衡。因此，采用75 ℃用于后續(xù)反應(yīng)。

圖1　反應(yīng)物摩爾比(a)和反應(yīng)溫度(b)對魚油乙酯制備的影響Fig.1　Effects of molar ratio of ethanol to fish oil(a)and reaction temperature(b)on the yield of the ethyl esters

圖2是催化劑濃度和反應(yīng)時(shí)間對魚油乙酯制備的影響。催化劑濃度影響反應(yīng)速率，一定范圍內(nèi)，反應(yīng)速率隨著催化劑用量的增加而增加，但是增加至一定濃度后反應(yīng)速率則不再隨著增加。該反應(yīng)體系中，當(dāng)繼續(xù)增加NaOH的濃度，脂肪酸乙酯反而有下降的趨勢，可能是催化劑增加后，反應(yīng)體系生成的皂增加的緣故，從而影響目標(biāo)產(chǎn)品脂肪酸乙酯的得率。因此，后續(xù)反應(yīng)過程中采用0.30%的NaOH濃度。從圖2(b)中可看出，反應(yīng)時(shí)間從0.5 h增加至2.0 h時(shí)，脂肪酸乙酯的得率隨著增加，繼續(xù)增加反應(yīng)時(shí)間，脂肪酸乙酯的得率未見顯著增加，說明該反應(yīng)體系中2.0 h已基本達(dá)到反應(yīng)平衡。

圖2　反應(yīng)物摩爾比(a)和反應(yīng)溫度(b)對魚油乙醇制備的影響Fig.2　Effects of concentration of catalyst NaOH(a)and reaction time(b)on the yield of the ethyl esters

2.2硝酸銀-水法提純高含量DHA和EPA的研究采用硝酸銀-水法對魚油乙酯化產(chǎn)品進(jìn)行分離提純，得到EPA和DHA總含量為> 95%的濃縮產(chǎn)品。根據(jù)Ag+(EPA)絡(luò)合物、Ag+(DHA)絡(luò)合物的穩(wěn)定性不同，進(jìn)一步分離出高純度的EPA乙酯和DHA乙酯。采用室溫AgNO3濃度為75%時(shí)，可得到DHA乙酯濃度為95.6%，EPA濃度為3.8%的乙酯魚油產(chǎn)品。

從表2中結(jié)果可以看出，在室溫條件下硝酸銀-水法提取魚油DHA和EPA的純度隨著硝酸銀濃度的增加而增加，分離DHA和EPA的硝酸銀最佳濃度為75%，提取得到的EPA和DHA總濃度96%～99%。

2.3高含量DHA和EPA魚油的降血脂動物試驗(yàn)研究

2.3.1高含量DHA和EPA魚油對高脂血癥小鼠血清脂質(zhì)水平的影響。從表3中可以看出，高含量DHA/EPA 魚油各劑量組較模型對照組血清中TC、TG、LDL-C、LDL-C /HDL-C 分別均有降低，HDL-C 均有升高。說明高含量DHA/EPA魚

表2硝酸銀-水提純制備高含量EPA和DHA魚油乙酯的結(jié)果

Table 2Contents of EPA and DHA in the ethyl esters prepared by silver nitrate-water method

%

油能有效降低模型小鼠血清TC、TG和LDL-C，升高HDL-C含量(P<0.05)。因此，高含量DHA/EPA魚油可有效改善模型小鼠的血脂水平。高含量DHA/EPA由于各劑量組較陽性對照組血清中TC、TG、LDL-C 均有所降低，HDL-C 有所升高，說明高含量DHA/EPA 魚油較羅格列酮具有更好的降血脂作用，促進(jìn)其更好地調(diào)節(jié)血脂水平。高含量DHA/EPA 魚油各劑量組較低含量DHA/EPA魚油對照組，TC 和LDL-C 分別均有升高，TG 和HDL-C 分別均有降低，說明在低含量DHA/EPA 魚油較高含量DHA/EPA 魚油在降低TC 和LDL-C，升高HDL-C 方面具有更好的調(diào)節(jié)血脂的作用。

表3　DHA/EPA對高血脂癥小鼠血脂水平的影響

注：結(jié)果表示為X±S，n=10。

Note：The results are shown asX±S，n=10.

2.3.2高含量DHA和EPA魚油對高脂血癥小鼠肝臟脂肪濃度的影響。從表4中可以看出，模型對照組較正常對照組小鼠肝臟TC 和TG 含量均有提高，說明高糖高脂的攝入嚴(yán)重?cái)_亂了小鼠的脂質(zhì)代謝，肝臟TC 和TG 水平顯著升高。高含量DHA/EPA魚油各劑量組較模型對照組肝臟TC和TG 含量均有降低，說明高含量DHA/EPA 魚油能有效降低小鼠肝臟脂肪濃度，減少肝臟脂質(zhì)的蓄積。高含量DHA/EPA 魚油各劑量組較陽性對照組和低含量DHA/EPA魚油對照組肝臟TC 和TG 含量均有所升高，說明羅格列酮以及低含量DHA/EPA魚油降低小鼠肝臟脂肪濃度均優(yōu)于高含量DHA/EPA魚油。

表4DHA/EPA對高脂血癥小鼠肝臟中TC、TG的影響

Table 4Effects of DHA/EPA on TC and TG content in the liver of hyperlipidemia mice mmol/L

試驗(yàn)組ExperimentalgroupTCTG正常對照組Normalcontrolgroup6.49±0.7812.02±1.99模型對照組Modelcontrolgroup9.08±0.8917.01±1.32陽性對照組Positivecontrolgroup7.01±0.5712.55±1.79低含量DHA/EPA對照組ControlgroupwithlowlevelsofDHA/EPA7.35±0.6713.38±1.08高含量DHA/EPA低劑量組Low-dosegroupwithhighlevelsofDHA/EPA8.15±0.9615.35±1.04高含量DHA/EPA中劑量組Moderate-dosegroupwithhighlevelsofDHA/EPA7.93±0.9613.67±1.28高含量DHA/EPA高劑量組High-dosegroupwithhighlevelsofDHA/EPA8.01±0.6713.22±1.60

注：結(jié)果表示為X±S，n=10。

Note：The results are shown asX±S，n=10.

3　結(jié)論與討論

目前有關(guān)魚油功效的研究主要集中在EPA、DHA 2種脂肪酸的獨(dú)立功效上，而對于這2種脂肪酸不同比例的功效的研究則較少。該研究優(yōu)化了堿催化制備魚油乙酯的工藝條件，純化了魚油乙酯，并研究了高含量EPA和DHA的降血脂功效。結(jié)果表明，乙醇-魚油6∶1(摩爾比)，反應(yīng)溫度75 ℃，反應(yīng)時(shí)間2.0 h，堿催化劑NaOH加入量為油重的0.30%；在此條件下魚油脂肪酸乙酯得率最高，經(jīng)分子蒸餾后達(dá)95%；硝酸銀最佳濃度為75%，提取得到的EPA和DHA總濃度96%～99%；高含量EPA和DHA魚油能夠顯著降低小鼠血清中的總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)和低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)濃度，提高高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)濃度，可有效改善高脂血癥小鼠的血脂水平。魚油是一種利用價(jià)值很高的天然保健品，魚油中富含的多不飽和脂肪酸EPA和DHA，具有預(yù)防心腦血管疾病、抗氧化、保護(hù)血管、預(yù)防腫瘤、調(diào)節(jié)血脂、促進(jìn)人腦及視網(wǎng)膜發(fā)育和延緩大腦衰老等多種功能。因此，與魚油相關(guān)的降血脂保健品具有極高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和社會效益。

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Preparation and Purification of Fish Oil Fatty Acid Ethyl Esters and Their Effects on Blood Lipid Reduction

LIU Yan1, LI Xiao-lu1, GUO Yan-feng1*et al

(1.Department of Biomedicine, Zhongshan Torch Polytechnic, Zhongshan, Guangdong 528436; 2. Zhongshan Institute for Food and Drug Control, Zhongshan, Guangdong 528437)

[Objective] To study the preparation and purification of fish oil fatty acid ethyl esters and their effects on blood lipid reduction. [Method] Fish oil fatty acid ethyl esters were made from fish oil by base catalysis and purified, and the conditions for the ethyl esters production were optimized. Effects of high levels of eicosapentaenoic acid (EPA) and docosahexaenoic acid (DHA) on blood lipid reduction were studied. [Result] The optimum conditions for ethyl esters production were shown as follows: the molar ratio of ethanol to fish oil was 6∶1; reaction temperature was 75 ℃; reaction time was 2 h; NaOH concentration was 0.30%. After molecular distillation, the yield of the ethyl esters was up to 95% under the optimum conditions. DHA and EPA were extracted by silver nitrate-water method, and total content of DHA and EPA was up to 96%-99% when AgNO3concentration was 75%. High levels of DHA and EPA significantly decreased the contents of serum total cholesterol (TC), triglyceride (TG) and low density lipoprotein cholesterin (LDL-C)and improved the content of high density lipoprotein cholesterin (HDL-C), which indicating that high levels of DHA and EPA could improve the disturbance of blood lipid on hyperlipidemia mice. [Conclusion] The study can provide scientific references for the deep processing, exploitation and utilization of fish oil.

Fish oil fatty acid ethyl esters; Preparation; Purification; Blood lipid reduction

國家質(zhì)檢總局科技計(jì)劃項(xiàng)目(2014QK051)；中山市科技計(jì)劃項(xiàng)目(2014A2FC247)。

劉妍(1983- )，女，內(nèi)蒙古通遼人，講師，碩士，從事食品加工研究。*通訊作者，博士，從事食品加工研究。

2016-06-06

S 986.2

A

0517-6611(2016)19-080-04