呂　斐，馬民安，王志宏，蘇遠科，羅　曉，胥　洪

（龍口出入境檢驗檢疫局，山東煙臺　265700）

?

液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定葡萄干中赭曲霉毒素A含量

呂斐，馬民安，王志宏，蘇遠科，羅曉，胥洪

（龍口出入境檢驗檢疫局，山東煙臺265700）

建立葡萄干中赭曲霉毒素A（OTA）的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定方法。樣品經(jīng)甲醇超聲提取，以乙腈-水（含0.1%甲酸）為流動相，進行梯度洗脫，正離子多反應(yīng)監(jiān)測模式（MRM）測定。結(jié)果表明，赭曲霉毒素A在1～50 μg/L范圍內(nèi)有良好的線性，相關(guān)系數(shù)R2＞0.999，方法回收率為79%～96%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.1%～4.8%，定量限1.0 μg/kg。該方法前處理快速簡單，可用于對進出口葡萄干中赭曲霉毒素A的檢測。

葡萄干；赭曲霉毒素A；液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法

0　引言

赭曲霉毒素A（英文簡稱OTA）為真菌的次級代謝產(chǎn)物，可從谷類、干果制品、飼料、肉類及制品、奶制品、藥用植物、人血中檢出。試驗表明，OTA具有嚴(yán)重的腎毒性、肝毒性、神經(jīng)毒性以及免疫毒性［1-4］。2008年，波蘭發(fā)出中國產(chǎn)葡萄干中OTA含量超標(biāo)（20.7 μg/kg） 的預(yù)警通報，導(dǎo)致貨物扣留，造成較大經(jīng)濟損失，給我國該食品行業(yè)出口造成不利影響。隨后，各國相繼對葡萄干中OTA規(guī)定了嚴(yán)格的限量要求，如歐盟科學(xué)委員會規(guī)定葡萄干中OTA的最高含量為10 μg/kg。

赭曲霉毒素A化學(xué)結(jié)構(gòu)式見圖1。

目前，國內(nèi)葡萄干中OTA的檢測標(biāo)準(zhǔn)有SN/T 1940—2007進出口食品中赭曲霉毒素A的測定方法，其采用免疫親和柱凈化、高效液相色譜法分析，基質(zhì)干擾較大，且免疫親和柱價格昂貴、成本較高。

圖1　赭曲霉毒素A化學(xué)結(jié)構(gòu)式

近年來，由于液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MSMS）技術(shù)具有靈敏度高、抗基質(zhì)干擾能力強、定性準(zhǔn)確等優(yōu)點，在化學(xué)殘留物檢測方面的應(yīng)用越來越廣泛。本文采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜結(jié)合溶劑直接提取，建立了葡萄干中赭曲霉毒素A殘留量的測定方法。該方法操作簡便、成本較低，省略液液分配、免疫親和柱凈化等步驟，可以滿足殘留監(jiān)控和風(fēng)險評估的要求。

1　材料與方法

1.1儀器與試劑

Agilent 1290型高效液相色譜儀、Agilent 6460型三重四級桿質(zhì)譜儀（配有電噴霧離子源（Jet-ESI））、Masshunter色譜工作站；十萬分之一電子天平，瑞士Mettler Toledo公司產(chǎn)品；KQ3200型超聲波清洗機，昆山市超聲儀器有限公司產(chǎn)品；超純水機，美國Millipore公司產(chǎn)品。

赭曲霉毒素A標(biāo)準(zhǔn)品，購自美國Sigma公司；乙腈、甲醇、甲酸均為色譜純，德國Merck公司產(chǎn)品。

1.2試驗方法

1.2.1液質(zhì)分析條件

（1）色譜條件。AgilentZORBAXEclipsePlusC18型色譜柱（2.1 mm×50 mm，3 μm）；柱溫35℃；流動相A為乙腈、B為0.1%甲酸水溶液；梯度程序為0～1 min 40%A，1～3 min從40%A線性增加至60% A，3～4 min 95%A，4～4.1 min由95%A降至40%A，4.1～5 min 40%A；進樣量10 μL；流速0.3 mL/min。

（2）質(zhì)譜條件。電噴霧離子源（Jet-ESI），正離子（ESI+）多反應(yīng)檢測（MRM）模式，噴霧電壓4kV，干燥氣及霧化氣均為氮氣，干燥氣體溫度350℃，干燥氣流量10 L/min，霧化氣壓力45 psi，裂解電壓100 V。

1.2.2標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

準(zhǔn)確稱取10 mg赭曲霉毒素A標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇溶解配制成質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，在-18℃下冷凍避光保存，有效期3個月。

取1.0 mL的上述標(biāo)準(zhǔn)儲備液，用甲醇配成質(zhì)量濃度為1.0 g/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作液，待用，-4℃下避光保存，有效期1個月。

取適量的標(biāo)準(zhǔn)工作液，用空白葡萄干樣品基質(zhì)配成質(zhì)量濃度為1，2，5，10，50 μg/L的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.2.3樣品制備

取葡萄干（約500 g）用食品粉碎機粉碎后，制成試樣備用。稱取5.00 g樣品于50.0 mL聚四氟乙烯離心管中，加入20.00 mL甲醇，超聲15 min。隨后在離心機中以轉(zhuǎn)速4 000 r/min離心5 min，吸取10.00 mL上清液至50 mL雞心瓶中，在35℃水浴旋蒸至干。加入乙腈和0.1%甲酸水溶液（配比為4∶6）2.00 mL溶解，渦旋，過0.2 μm微孔濾膜，待儀器測定。

2　結(jié)果與討論

2.1液相條件優(yōu)化

2.1.1提取溶劑的選擇

赭曲霉毒素A是一種穩(wěn)定的無色結(jié)晶化合物，呈弱酸性，易溶于極性溶劑和碳酸氫鈉溶液，微溶于水，在甲醇中溶解后可在冰箱中保存1年。本試驗為了提高OTA的提取效率、減少干擾，分別考察了70%甲醇，80%甲醇，純甲醇作為提取溶劑。結(jié)果表明，采用純甲醇為提取溶劑時，測定的干擾最少，待測物的回收率最高，故最終選用純甲醇作為最終提取溶劑。

不同提取溶劑的回收率對比見表1。

表1　不同提取溶劑的回收率對比

2.1.2提取液優(yōu)化與配比

將葡萄干空白樣品以及加標(biāo)樣品對比，空白樣品中存在與OTA保留時間靠近的干擾峰，在加標(biāo)后，干擾峰被OTA峰覆蓋，導(dǎo)致定量檢測不準(zhǔn)確。為了提高OTA的分離效果，消除葡萄干基質(zhì)的干擾，選擇用梯度洗脫程序進行優(yōu)化。

葡萄干空白樣品色譜見圖2，葡萄干加標(biāo)樣品色譜見圖3，色譜梯度條件見表2。

圖2　葡萄干空白樣品色譜

圖3　葡萄干加標(biāo)樣品色譜

表2　色譜梯度條件

2.1.3流動相的選擇

甲酸流動相色譜見圖4，乙酸銨流動相色譜見圖5。

圖4　甲酸流動相色譜

圖5　乙酸銨流動相色譜

流動相的組成不僅影響目標(biāo)化合物的色譜行為，而且還會影響其離子化效率。本方法采用乙腈和水作為流動相，但當(dāng)流動相為乙腈-水時，出現(xiàn)了OTA峰拖尾的現(xiàn)象。所以，考慮添加甲酸或乙酸銨改善。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，加入甲酸后能減少峰拖尾現(xiàn)象，并能提高目標(biāo)分子的離子化效率，使質(zhì)譜的靈敏度提高，響應(yīng)值和峰形均優(yōu)于乙酸銨，且甲酸的濃度在0.1%時，流動相pH值為3.5，OTA的保留時間差異和分離度較為滿意。試驗又比較了甲醇-水（含0.1%甲酸）和乙腈-水（含0.1%甲酸） 作為流動相，相較于甲醇-水（含0.1%甲酸）體系，OTA在乙腈-水（含0.1%甲酸）體系中峰寬更小、對稱性更好，出峰時間也靠前。因此，試驗采用乙腈-水（含0.1%甲酸）作為流動相。

2.2質(zhì)譜條件優(yōu)化

根據(jù)OTA分子的化學(xué)電離性質(zhì)，選擇ESI+作為電離模式，干燥氣體溫度350℃，干燥氣流速10 L/min，鞘氣溫度350℃，鞘氣流速12 L/min，毛細管電壓4 000 V，碰撞氣高純氮（純度≥99.999%）。

采用針泵直接進樣方式確定赭曲霉毒素A的母離子，用于定性分析的離子對為m/z 404.2/358.2和m/z 404.2/239，其中定量分析離子為m/z 404.2/358.2。由于結(jié)構(gòu)的不同，各自產(chǎn)生碎片離子所需要的碰撞能量都不同，在此條件下，能夠獲得較好的響應(yīng)。

MRM分析的質(zhì)譜參數(shù)見表3，赭曲霉毒素A的質(zhì)譜見圖6。

表3　M R M分析的質(zhì)譜參數(shù)

2.3標(biāo)準(zhǔn)曲線、線性范圍及定量限

用空白葡萄干樣品基質(zhì)配制質(zhì)量濃度為1，2，5，10，50 μg/L的標(biāo)準(zhǔn)工作液，按上述色譜條件進行分析，得出不同標(biāo)準(zhǔn)工作液質(zhì)量濃度對應(yīng)的峰面積，所得峰面積（Y）對質(zhì)量濃度（X）做圖，計算回歸方程式和相關(guān)系數(shù)。

圖6　赭曲霉毒素A的質(zhì)譜

質(zhì)量濃度與峰面積值見表4，OTA標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖7。

表4　質(zhì)量濃度與峰面積值

圖7　O TA標(biāo)準(zhǔn)曲線

回歸方程為Y=1.084 8X+0.238 4，R2=0.999 7。回歸方程表明，赭曲霉毒素A在質(zhì)量濃度為1～50 μg/L范圍內(nèi)，峰面積與質(zhì)量濃度成良好線性。

按照本方法測定，根據(jù)葡萄干樣品能可靠測得的最低質(zhì)量濃度確定本方法對赭曲霉毒素A的定量限（LOQ，S/N=10）為1.0 μg/kg，這一數(shù)值低于國內(nèi)、國外對葡萄干赭曲霉毒素A的限量標(biāo)準(zhǔn)。

2.4方法學(xué)考察

2.4.1回收率試驗

取適量赭曲霉毒素A標(biāo)準(zhǔn)溶液添加至空白葡萄干樣品中，使添加量相當(dāng)于1，10，50 μg/kg，且每個水平各6份，進行樣品處理、上機，計算回收率。

方法回收率見表5。

由表5可知，回收率為79%～96%，本方法準(zhǔn)確度良好。

2.4.2精密度試驗

方法精密度見表6。

每個加標(biāo)水平平行測定6次，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.1%～4.8%，表明本方法精密度良好。

2.4.3實驗室間驗證

實驗室間赭曲霉毒素A驗證回收率見表7。

選擇系統(tǒng)內(nèi)5家實驗室，在空白葡萄干樣品中添加3個水平的赭曲霉毒素A標(biāo)準(zhǔn)溶液，進行測定回收率，表明方法可靠。

表5 方法回收率

表6 方法精密度

表7　實驗室間赭曲霉毒素A驗證回收率

3　結(jié)論

相較于高效液相色譜結(jié)合免疫親和柱檢測方法，本試驗采用甲醇提取，省去了使用昂貴的免疫親和柱凈化的步驟，大大降低了試驗成本。直接提取上機也減少了前處理過程中OTA的損失，使得方法的回收率提高，3個水平的平均添加回收率在79%～96%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.1%～4.8%，方法精密度良好，可作為進出口葡萄干中赭曲霉毒素A含量的準(zhǔn)確定量方法，能滿足殘留監(jiān)控和風(fēng)險評估的要求。

［1］郝俊冉，許文濤，黃昆侖.赭曲霉毒素A生成轉(zhuǎn)化及致毒機制的研究進展 ［J］.食品工業(yè)科技，2012（12）：427-433.

［2］張愛華，馮璐璐，馬彥娜，等.赭曲霉毒素A分析方法研究進展 ［J］.中國公共衛(wèi)生，2012（7）：1 003-1 008.

［3］賈欣，徐詩涵，梁志宏，等.赭曲霉毒素A的微生物脫毒研究進展 ［J］.生物技術(shù)通報，2014（12）：18-23.

［4］夏凱，賀曉云，郝俊冉，等.基于核磁共振掃描（NMR）的赭曲霉毒素A毒性血漿代謝組學(xué)研究 ［J］.農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報，2013（12）：1 426-1 433.◇

Determination of Ochratoxin A in Raisin by LC-MS-MS

LV Fei，MA Min'an，WANG Zhihong，SU Yuanke，LUO Xiao，XU Hong
（Longkou Entry Exit Inspection and Quarantine Bereau，Yantai，Shandong 265700，China）

A confirmative method is developed for determining ochratoxin A（OTA）in raisin by liquid chromatography tandem quadrupole mass spectrometry.The sample is treated by ultrasonic extraction with methol.Mobile phase is a blend solution consists of acetonitrile and water（0.1%formic acid） .The separation is carried out with gradient elution.The deteIction is achieved in the positive chemical ionization and multi-reaction monitoring（MRM）mode.Results show that with the optimized condition，a good linearity（R2＞0.999）is achieved for the target compounds in the range of 1～50 μg/L.The overall recoveries ranged from 79%～96%，and the relative standard deviations（RSD）are between 3.1%and 4.8%，the limits of quantification of OTA analytes are 1.0 μg/kg.The results show that the method is simple，accurate and suitable for the determination of OTA in raisin.

raisin；ochratoxin A；liquid chromatography tandem mass spectrometry（LC-MS-MS）

TS201.6

A

10.16693/j.cnki.1671-9646（X）.2016.07.015

1671-9646（2016）07a-0051-04

2016-04-28

呂斐（1982— ），女，本科，工程師，研究方向為食品檢測。