沈秋蘭， 何冬華， 徐秋芳， 程 敏， 毛新偉， 李永春， 陳俊輝

(浙江農(nóng)林大學(xué)環(huán)境與資源學(xué)院，浙江省森林生態(tài)系統(tǒng)碳循環(huán)與固碳減排重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江臨安 311300)

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闊葉林改種毛竹(Phyllostachyspubescens)后土壤固氮細(xì)菌nifH基因多樣性的變化

沈秋蘭， 何冬華， 徐秋芳*， 程 敏， 毛新偉， 李永春， 陳俊輝

(浙江農(nóng)林大學(xué)環(huán)境與資源學(xué)院，浙江省森林生態(tài)系統(tǒng)碳循環(huán)與固碳減排重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江臨安 311300)

【目的】毛竹是喜氮植物，土壤氮素水平對毛竹生長至關(guān)重要。生物固氮是土壤氮素的重要來源，因此，探索闊葉林改種毛竹后土壤固氮細(xì)菌和土壤氮素的變化具有重要意義。【方法】選擇立地條件相近的毛竹林(100多年前由闊葉林改種而來)和闊葉林，每種林地在東北坡向位置隨機(jī)選擇4個(gè)10 m×10 m標(biāo)準(zhǔn)樣地，每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)樣地選取5個(gè)采樣點(diǎn)，分層采集0—20 cm(表層)和20—40 cm(次表層)土壤樣品，分析了土壤pH、有機(jī)碳、堿解氮、有效磷、速效鉀和含水量等常規(guī)理化性質(zhì); 采用引物對AQER和PolF，以土壤總DNA為模板擴(kuò)增了固氮細(xì)菌功能基因(nifH)片段，應(yīng)用變性梯度凝膠電泳(DGGE)和實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Real-time PCR)，分析了固氮細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)、多樣性以及豐度(nifH基因拷貝數(shù))變化; 通過基因克隆測序?qū)ν寥拦痰?xì)菌進(jìn)行初步鑒定?！窘Y(jié)果】闊葉林改種毛竹后土壤pH顯著(P<0.05)提高; 毛竹林土壤的含水量、堿解氮以及表層土壤的速效鉀顯著高于(P<0.05)同層的闊葉林土壤，而有效磷則顯著(P<0.05)低于同層的闊葉林土壤?？傮w來說，闊葉林改種毛竹后土壤養(yǎng)分含量明顯提高; 闊葉林土壤固氮細(xì)菌DGGE條帶數(shù)以及多樣性指數(shù)(Shannon-Wiener index)都高于毛竹林; 基于DGGE條帶信息的聚類分析和主成分分析(PCA)結(jié)果表明，闊葉林和毛竹林區(qū)分為2個(gè)類群，而同一林分的不同土層之間差異較小; 實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示，毛竹林土壤的固氮細(xì)菌nifH基因豐度顯著(P<0.05)高于闊葉林土壤; 通過克隆測序，14個(gè)陽性克隆分別屬于2個(gè)不同的菌屬，其中13個(gè)均為Bradyrhizobium，1個(gè)為Azohydromonaslata，條帶序列與已知序列的相似度為93%98%。【結(jié)論】闊葉林改種毛竹后土壤固氮細(xì)菌的種類減少，而功能基因豐度卻明顯增加; 土壤氮素水平明顯提高，這可能是土壤固氮能力增強(qiáng)的結(jié)果。

毛竹; 土壤固氮細(xì)菌; 氮素

毛竹(Phyllostachyspubescens)是禾本科剛竹屬(Phyllostachys)，主要分布于熱帶和亞熱帶地區(qū)，是我國一種重要的森林資源[1]。20世紀(jì)70年代以來，許多研究者通過毛竹開展了氮磷鉀三要素最佳配比的肥料試驗(yàn)。黃當(dāng)亮[2]認(rèn)為2 ∶1 ∶1的比例對毛竹出筍效果最好; 郭曉敏等[3]報(bào)道N ∶P ∶K為1 ∶0.68 ∶0.49時(shí)，出筍率和成竹率為最佳; 鄭蓉等[4]指出氮的比例相對較高，說明氮素對毛竹生長具有十分重要的作用。然而，毛竹在立地條件較好(如由花崗巖發(fā)育而來的土壤)的粗放經(jīng)營(不施肥)環(huán)境中也能良好生長，說明毛竹林生態(tài)系統(tǒng)自身有能力保證氮素的供應(yīng)。對于不施肥的粗放經(jīng)營森林生態(tài)系統(tǒng)，生物固氮是土壤氮素的主要來源，生物固氮量為非生物固氮量的兩倍多[5]，是地球上最大規(guī)模的天然氮肥工廠。由此，本研究提出科學(xué)假設(shè): 闊葉林改種毛竹后可能影響生態(tài)系統(tǒng)氮素循環(huán)和固氮微生物的活動。

土壤中許多固氮微生物是非培養(yǎng)的，因此通過分子生物技術(shù)能更全面地了解土壤固氮微生物的特性。編碼固氮酶鐵蛋白組分的結(jié)構(gòu)基因nifH基因是固氮細(xì)菌最為保守的功能基因，常用來證明固氮菌的存在[6-9]，同時(shí)，也用以揭示固氮菌群落結(jié)構(gòu)與環(huán)境的關(guān)系[10]。目前對于竹林生態(tài)系統(tǒng)固氮微生物的研究甚少，侯偉等[11-12]對廣東刺竹植株體內(nèi)的固氮菌多樣性進(jìn)行了研究，并通過接種實(shí)驗(yàn)證明固氮菌株對植物生長有一定的促進(jìn)作用; 而且，對毛竹林土壤固氮菌的研究只有早期顧小平和吳曉麗兩位學(xué)者的3篇報(bào)道[13-15]。他們應(yīng)用傳統(tǒng)的平板培養(yǎng)法，從毛竹根際分離得到36個(gè)固氮菌，發(fā)現(xiàn)其固氮活性隨溫度和pH變化而變化，不同碳源也會對固氮活性產(chǎn)生一定的影響。本研究以純自然未被改種的闊葉林為毛竹林的對照，結(jié)合土壤常規(guī)理化分析，應(yīng)用nifH基因的特異引物對，利用DGGE和熒光定量PCR等方法，著重研究2種土壤的固氮細(xì)菌和氮素特征，旨在揭示闊葉林改為毛竹林后不同土層固氮微生物nifH基因多樣性與土壤氮素的變化。該研究結(jié)果對指導(dǎo)毛竹林經(jīng)營和持續(xù)發(fā)展具有重要的指導(dǎo)意義。

1　材料與方法

1.1土壤樣品采集與處理

研究區(qū)位于浙江省西北部的臨安市青山鎮(zhèn)(30°14′ N， 119°42′ E)，屬中亞熱帶季風(fēng)氣候區(qū)，平均降水量為1628.6 mm，年平均氣溫16.4℃，日照時(shí)數(shù)1847.3 h，無霜期237.0 d。土壤為砂頁巖發(fā)育的紅壤，兩種林地分布在相鄰的兩個(gè)山體，每個(gè)山體的面積為0.35公頃左右，海拔60140 m，坡度為25°。

純自然的闊葉林主要優(yōu)勢樹種有苦櫧(Castanopsissclerophylla)、木荷(Schimasuperba)、青岡(Cyclobalanopsisglauca)等，林下灌木種類有山胡椒(Linderaglauca)、山蒼子(Litseacubeba)等，覆蓋度為70%。毛竹林則為100多年前由闊葉林改種而來，竹林立竹密度為28003200株/hm2，平均胸徑為30 cm左右。毛竹林主要采用冬季劈除林下雜灌、不翻耕施肥的粗放經(jīng)營措施，林下僅少量雜草; 毛竹每隔一年出筍長新竹(稱大年)，大年時(shí)挖去部分春筍，保留一定數(shù)量的新竹，小年(不長新竹)時(shí)砍伐6年生的成熟毛竹。

于2013年5月，每種林地在東北坡向的不同位置，隨機(jī)選取4個(gè)10 m×10 m標(biāo)準(zhǔn)樣地，每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)樣地選取5個(gè)采樣點(diǎn)，分層采集0—20 cm(表層)和20—40 cm(次表層)土壤，將每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)樣地同一土層的土壤充分混勻形成一個(gè)混合樣品，每種林地得8個(gè)混合樣品(2個(gè)土層，4個(gè)重復(fù))，2種林地共計(jì)16個(gè)樣品(2種林地，2個(gè)土層，4個(gè)重復(fù))。樣品過2 mm鋼篩、充分混勻，從中取出部分樣品裝入小塑料瓶后放入備好的冰盒，帶回實(shí)驗(yàn)室后置于-70℃保存，土樣經(jīng)冷凍干燥后提取DNA，其余部分帶回實(shí)驗(yàn)室風(fēng)干后用于土壤理化性質(zhì)的測定。

1.2分析方法

1.2.1 土壤理化性質(zhì)參照魯如坤等[16]方法對土壤理化性質(zhì)進(jìn)行分析。其中，土壤pH值采用1 ∶2.5土水質(zhì)量比，用復(fù)合電極測定; 有機(jī)碳含量采用重鉻酸鉀-油浴外加熱法測定; 堿解氮采用堿解擴(kuò)散法; 有效磷采用Bray法，鹽酸-氟化銨溶液浸提，鉬銻抗比色法測定; 速效鉀采用醋酸銨提取，火焰分光光度計(jì)測定。

1.2.2 土壤總DNA的提取采用Power SoilTMTotal DNA Isolation Kit試劑盒(美國Mo Bio公司)提取土壤總DNA，稱取0.5 g于-70℃保存的土壤樣品，按試劑盒說明書進(jìn)行土壤DNA提取，通過1.2%瓊脂糖凝膠電泳對DNA提取效果進(jìn)行鑒定，提取后的DNA樣品保存于-40℃。

1.2.3 土壤固氮細(xì)菌的PCR擴(kuò)增使用BIO-RAD公司的PCR儀對固氮細(xì)菌特異性nifH基因進(jìn)行擴(kuò)增，表1為反應(yīng)步驟和對應(yīng)的引物[17]序列(上海生物工程有限公司)。20 μL反應(yīng)體系如下: Premix 10 μL，引物各 0.2 μL，BSA 0.2 μL，模板0.2 μL，H2O 9.2 μL。第一輪反應(yīng)， 94℃預(yù)變性3 min，94℃變性1 min，55℃退火1 min，72℃延伸2 min，30個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸5 min; 第二輪反應(yīng)， 以第一輪產(chǎn)物為模板，94℃預(yù)變性3 min，94℃變性1 min，48℃退火1 min，72℃延伸2 min，35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸5 min[17]。取4 mL PCR反應(yīng)產(chǎn)物用1.2%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，確認(rèn)其片段大小，并用于DGGE分析。

表1　PCR擴(kuò)增所用引物

注(Note): R=A/G; N=A/G/C/T; H=T/C/A; Y=C/T; S=G/C.

1.2.4 變性梯度凝膠電泳(DGGE)參照Marcia等[17]和Wartiainen等[18]的方法，改良后使用BIO-RAD基因突變儀進(jìn)行變性梯度凝膠電泳，丙烯酰胺凝膠濃度為8%，電泳緩沖液為1×TAE，變性梯度為40%65%(100%變性劑為7 mol/L尿素，40%去離子甲酰胺)。在60℃、80 V條件下，電泳14 h后，用Gelred(美國Invitrogen公司)(1 ∶10000稀釋)染色30 min，染色結(jié)果用Gel DocTMEQ(BIO-RAD)凝膠成像系統(tǒng)成像，使用Quantity One 4.4 軟件(BIO-RAD)進(jìn)行圖像分析，確定電泳條帶數(shù)、亮度和光密度。

1.2.5 固氮細(xì)菌nifH基因序列分析根據(jù)2種林地土壤樣品固氮細(xì)菌nifH基因DGGE圖譜結(jié)果，選取主要條帶進(jìn)行割膠回收，回收條帶使用pEASY-T3試劑盒(北京全式金生物技術(shù)有限公司)進(jìn)行克隆，菌液送生工測序，測序結(jié)果在NCBI上進(jìn)行Blast比對。

1.2.6 固氮細(xì)菌nifH基因定量PCR以土壤總DNA為模板，AQER和PolF為引物(引物見表1)，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Real-time PCR)法測定固氮細(xì)菌nifH基因拷貝數(shù)。20 μL反應(yīng)體系組成如下: 2×SYBR Premix Ex Taq 10 μL，50 μmol/L上游和下游引物各0.2 μL，模板DNA 1 μL，無菌雙蒸水8.6 μL。熒光定量PCR擴(kuò)增在CFX96TMReal-Time System(BIO-RAD, USA)儀器上進(jìn)行，每個(gè)樣品3個(gè)重復(fù)。熒光定量PCR 程序參考文獻(xiàn)[17]。標(biāo)準(zhǔn)曲線制作: 從測序結(jié)果中選取合適的陽性克隆子，擴(kuò)增培養(yǎng)后提取質(zhì)粒DNA，紫外吸收定量法(OD260/OD280)檢測濃度，重組質(zhì)粒梯度稀釋(10-110-8)后作為nifH基因的熒光定量的標(biāo)準(zhǔn)樣品，樣品的反應(yīng)程序和反應(yīng)體系同標(biāo)準(zhǔn)樣品測定。

1.3數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，采用t檢驗(yàn)方法，檢驗(yàn)相同土層不同林地之間、同一林地不同土層之間的差異。利用Quantity One 4.4 軟件進(jìn)行圖譜分析時(shí)，主要采用未加權(quán)算術(shù)平均對群法 (The unweighted pair group method with arithmetic averages, UPGMA)對DGGE圖譜進(jìn)行聚類分析。使用CANOCO 4.5.1軟件(Microcomputer Power, Ithaca, USA)對DGGE揭示的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行主成分分析(PCA)。使用多樣性指數(shù)H和均勻度指數(shù)(E)來評價(jià)微生物群落的多樣性[19]，其計(jì)算公式為:

式中，Pi為某一條帶的強(qiáng)度與同泳道中所有條帶總強(qiáng)度的比值，即Pi=i/N;i是物種的個(gè)體數(shù)，在這里指條帶的強(qiáng)度;N是所有物種的個(gè)體總數(shù)，在這里指同泳道中所有條帶總強(qiáng)度;S為每一泳道總的條帶數(shù)。

2　結(jié)果與分析

2.1土壤理化性質(zhì)

闊葉林改種毛竹后，土壤pH顯著(P<0.05)提高(表2); 毛竹林土壤的含水量、堿解氮以及表層土壤的速效鉀，都顯著高于(P<0.05)同層的闊葉林土壤，而有效磷則顯著(P<0.05)低于同層的闊葉林土壤; 除闊葉林土壤有機(jī)碳含量外，同一林地的其他指標(biāo)均為表層土壤大于次表層土壤，其中毛竹林表層土壤的pH、堿解氮、有效磷和速效鉀含量顯著(P<0.05)高于次表層。顯然，闊葉林地改種毛竹后，土壤酸性減弱，有效養(yǎng)分含量明顯提高。

表2　闊葉林和毛竹林地土壤基本理化性質(zhì)

注(Note): 同列數(shù)值后不同小寫字母代表同一土層不同林地的顯著性差異(P<0.05)，大寫字母代表同一林地不同土層的顯著性差異(P<0.05)Values followed by different small letters are significantly different at the 0.05 level between different forests in the same soil layer, and followed by different capital letters are significant at the 0.05 level between different layers in the same forest.

2.2土壤微生物DNA

1.2%瓊脂糖凝膠電泳圖顯示，DNA提取效果良好(圖1)。OD260/OD280比值大部分在1.82.0之間，表明只是有輕度的RNA污染(OD260/OD280=1.8為最佳，OD260/OD280>1.9為RNA污染，OD260/OD280<1.6為蛋白質(zhì)污染); OD值的大小即DNA的濃度，能大致反映土壤微生物數(shù)量[20]，無論是表層還是次表層，毛竹林土壤DNA濃度均明顯高于對應(yīng)土層的闊葉林，說明毛竹林土壤的微生物生物量高于闊葉林。

圖1　DNA 1.2%瓊脂糖凝膠電泳圖、濃度以及OD260 nm與OD280 nm比值Fig.1　1.2%AGE of DNA, concentration and OD260nm/OD280 nm[注(Note): M—Marker; 14—毛竹林0—20 cm土層樣品Soil of Moso bamboo forest at 0-20 cm layer; 58—毛竹林20—40 cm土層樣品Moso bamboo forest at 20-40 cm layer; 912—闊葉林0—20 cm土層樣品Broadleaf forest at 0-20 cm layer;1316—闊葉林20—40 cm土層樣品Broadleaf forest at 20-40 cm layer.

2.3固氮細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)及多樣性

采用嵌套式PCR擴(kuò)增技術(shù)對固氮細(xì)菌nifH基因進(jìn)行擴(kuò)增，經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳后，獲得條帶清晰的400 bp左右DNA片段。PCR產(chǎn)物經(jīng)DGGE分離出數(shù)目、強(qiáng)度和遷移位置不同的條帶(圖2)。DGGE圖中不同位置的條帶代表不同的細(xì)菌種群[21]; 電泳條帶越多，說明細(xì)菌種群越多[22]; 條帶信號越強(qiáng)，表示該條帶代表的相應(yīng)細(xì)菌數(shù)量越多。本研究的目標(biāo)條帶是固氮細(xì)菌，比較毛竹林和闊葉林這兩種林地之間的條帶發(fā)現(xiàn)，兩種土壤的DGGE帶譜差異明顯，闊葉林土壤條帶數(shù)和優(yōu)勢條帶(亮度大)明顯多于毛竹林。16個(gè)樣品共出現(xiàn)21條位置不同的條帶，其中闊葉林、毛竹林地分別有20條、17條條帶。同一林地不同土層土壤固氮菌差異不明顯。

分析比較條帶特征發(fā)現(xiàn)，條帶11為兩種林地的共性條帶，不僅亮度最大而且在不同土壤間差異最小，表明該種固氮細(xì)菌在兩種林地中均有生長，并且為土壤固氮細(xì)菌群落中的優(yōu)勢種群; 共性條帶12亮度較低，不同土壤樣品間有明顯差異; 條帶20、21分別為闊葉林和毛竹林的特征條帶，對應(yīng)土壤表層亮度高于次表層，說明這兩個(gè)條帶對應(yīng)的固氮細(xì)菌主要活躍于土壤表層; 毛竹林土壤中非共性條帶18、19的亮度大于闊葉，而條帶15、16、17則呈現(xiàn)出相反的趨勢。

圖2　 nifH 基因DGGE電泳圖譜Fig.2　DGGE fingerprinting of nitrogen-fixing bacteria based on nifH gene[注(Note): M—Marker; 14—毛竹林0—20 cm土層樣品 0—20 cm soil layer in Moso bamboo forest; 58—毛竹林20—40 cm土層樣品20—40 cm soil layer in Moso bamboo forest; 912—闊葉林0—20 cm土層樣品 0—20 cm soil layer in broadleaf forest; 1316—闊葉林20—40 cm土層樣品20—40 cm soil layer in broadleaf forest .]

根據(jù)固氮細(xì)菌DGGE圖譜中條帶位置和亮度計(jì)算多樣性指數(shù)H和均勻度指數(shù)E(表3)。多樣性指數(shù)H越大，說明微生物群落多樣性越高; 均勻度指數(shù)E表示微生物在環(huán)境中的分布狀況，各微生物數(shù)目越接近，數(shù)值越大[23]。結(jié)果表明，闊葉林多樣性指數(shù)H大于對應(yīng)土層的毛竹林，而土壤的均勻度指數(shù)E則正好相反，但均沒有達(dá)到顯著性差異。

2.4土壤固氮細(xì)菌 nifH 基因測序

根據(jù)2種林地土壤樣品固氮細(xì)菌nifH基因DGGE圖譜結(jié)果，選取主要的14個(gè)條帶(編號分別為1、3、7、8、11、12、13、15、16、17、18、19、20、21)進(jìn)行割膠回收測序。結(jié)果表明，14個(gè)陽性克隆分別屬于2個(gè)不同的菌屬(表4)，其中13個(gè)均為Bradyrhizobium，1個(gè)為Azohydromonaslata[24]，但14個(gè)條帶的序列與已知序列的相似度為93%98%，相似度低于98%說明與已知的物種存在一定差異，相似度低于96%的可能是新種。闊葉林土壤的特征性條帶20和毛竹林土壤特征性條帶21所對應(yīng)的固氮細(xì)菌，雖然也都屬于慢生根瘤菌屬(Bradyrhizobium)，但存在一定差異，而且毛竹林土壤的21號可能是新種。

表3　土壤固氮細(xì)菌群落多樣性指數(shù)

注(Note):H—多樣性指數(shù)Shannon-wiener index;E—均勻度指數(shù)Pielou index; 小寫字母代表同一土層不同林地的顯著性差異(P<0.05)，大寫字母代表同一林地不同土層的顯著性差異(P<0.05)The small letters mean significant difference at the 0.05 level between different forests in the same soil layer, and capital letters mean significant difference at the 0.05 level between different layers in the same forest.

表4　DGGE條帶測序比對結(jié)果

2.5聚類分析

從聚類分析圖上看(圖3)，所有樣品大致可以被歸為兩組(相似度低于0.4)，19號為一組，1016號為另一組，除9號闊葉林土壤出現(xiàn)異常外，同一林地的表層和次表層樣品均歸為一類，說明兩種林地土壤的固氮細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)存在明顯差異。闊葉林土壤的表層樣品(#10、11、12)和次表層樣品(#13、14、16)的固氮細(xì)菌結(jié)構(gòu)也存在明顯差異(相似度低于0.6)。然而，毛竹林土壤則沒有明顯的層次差異規(guī)律。

圖3　土壤固氮細(xì)菌條帶圖譜的聚類分析Fig. 3　Cluster analysis(UPGMA)of soil nitrogen-fixing bacteria[注(Note): BB—毛竹林Bamboo; BL—闊葉林Broadleaf.]

2.6主成分分析(PCA)

為更進(jìn)一步揭示土壤樣品間固氮細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的相互關(guān)系，對不同樣品DGGE圖譜上條帶位置和亮度進(jìn)行數(shù)字化處理后的主成分分析(Principal Component Analysis，PCA)結(jié)果顯示，主成分1解釋了樣品中32.0%的變異，主成分2解釋了樣本中17.1%的變異，共解釋了樣本中49.1%的樣本總變異(圖4)。在PC1上，兩種林地得到了較好的區(qū)分，毛竹林土壤樣品除了3號外主要分布在坐標(biāo)軸左側(cè)，闊葉林土壤樣品除了9號外主要分布在坐標(biāo)軸右側(cè)，表明不同林地間固氮細(xì)菌群落有明顯差異; 毛竹林不同土層固氮細(xì)菌在PC1上存在差異，而闊葉林土壤固氮細(xì)菌土層間的差異主要落在PC2上; 該結(jié)果表明，不同林地的固氮細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)存在一定的差異。

圖4　固氮細(xì)菌群落的主成分分析(PCA)Fig. 4　PCA of nitrogen-fixing bacteria communities[注(Note): BB—毛竹林Bamboo; BL—闊葉林Broadleaf.]

2.7豐度分析

實(shí)驗(yàn)測得所提nifH基因質(zhì)粒濃度為301 ng/μL，將其轉(zhuǎn)換成拷貝數(shù)為8.18×1010, 10 倍稀釋質(zhì)粒，共稀釋得8個(gè)梯度作為標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行熒光定量PCR，不同梯度生物重組質(zhì)粒為模板進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作。得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線每個(gè)梯度均有呈明顯“S”型的特征性擴(kuò)增曲線，通過定量 PCR ，利用稀釋的質(zhì)粒作出Ct 值與起始拷貝數(shù)對數(shù)線性關(guān)系的標(biāo)準(zhǔn)曲線(R2=0.997，E=91.8%)。利用Real-time PCR技術(shù)獲得各土壤樣品nifH功能基因拷貝數(shù)，換算出每克干土nifH基因的拷貝數(shù)(圖5)。結(jié)果表明，同一土層毛竹林土壤nifH功能基因拷貝數(shù)顯著大于闊葉林，而同一林地表層和次表層nifH基因拷貝數(shù)則沒有明顯差異。說明毛竹林土壤中的固氮細(xì)菌數(shù)量明顯高于闊葉林土壤。

圖5　 nifH 基因拷貝數(shù)Fig.5　Abundance of nifH gene[注(Note): BB—毛竹林Bamboo; BL—闊葉林Broadleaf. 柱上不同小寫字母表示同一土層不同林地 nifH 基因拷貝數(shù)差異達(dá)顯著水平(P<0.05)，不同大寫字母表示同一林地不同土層 nifH 基因拷貝數(shù)差異達(dá)顯著水平(P<0.05)　Different small letters above the bars mean significant difference at the 0.05 level between different forests in the same soil layer, and different capital letters mean significant difference at the 0.05 level between different layers in the same forest.]

3　討論與結(jié)論

本研究中，兩種土壤固氮細(xì)菌功能基因的DGGE圖譜分析結(jié)果中闊葉林土壤固氮細(xì)菌物種數(shù)量(條帶數(shù))和種群數(shù)量(亮度)以及以此為基礎(chǔ)計(jì)算得出的多樣性指數(shù)H高于毛竹林，可以推測闊葉林土壤的固氮細(xì)菌物種多樣性較毛竹林豐富。影響土壤固氮微生物群落結(jié)構(gòu)以及多樣性的因素包括植被[25]、土地利用[9]、養(yǎng)分[26]、溫度和pH[27-28]等，其中植被是土壤微生物賴以生存的有機(jī)營養(yǎng)物和能量的重要來源，影響著土壤微生物的定居環(huán)境。土壤中自生固氮菌大部分為異養(yǎng)，需要碳源來滿足繁殖和代謝活動。因此，闊葉林植被種類豐富，改種毛竹后，群落結(jié)構(gòu)變得單一，植物多樣性低，植被和土壤的碳儲量都減少了[29-30]，這可能是導(dǎo)致以上差異的重要原因。

一般認(rèn)為微生物種類越多，各物種的數(shù)量(individual population)越多，則功能基因的拷貝數(shù)越多。由以上一般規(guī)律推測，DGGE方法檢測到條帶數(shù)多——即固氮細(xì)菌種類多的闊葉土壤應(yīng)該比毛竹土壤具有較高的nifH基因拷貝數(shù)。然而，定量PCR分析結(jié)果沒有支持以上規(guī)律，毛竹林土壤固氮細(xì)菌的nifH基因豐度反而高于闊葉林(圖5)。本研究支持毛竹林土壤固氮細(xì)菌的nifH基因豐度高的理由有兩方面: 一是毛竹林土壤較高的pH更有利于固氮細(xì)菌的活動，因?yàn)榇蟛糠滞寥拦痰?xì)菌數(shù)量受pH的影響較大，有其最適pH范圍[31-32]; 二是毛竹林土壤除有效磷外的其它所測養(yǎng)分指標(biāo)均優(yōu)于闊葉林(表2)，也有利于土壤固氮細(xì)菌活動。劉駿等[33]通過對竹林-闊葉林界面兩側(cè)土壤養(yǎng)分差異的研究發(fā)現(xiàn)，由于毛竹細(xì)根的作用，毛竹林土壤有機(jī)碳和總氮的含量分別高出闊葉林34.53%和60.35%，而毛竹林土壤全磷含量低于闊葉林25.54%，這與本文研究結(jié)果一致。Reardon等[34]研究發(fā)現(xiàn)，土壤微生物總生物量高的土壤nifH基因豐度高，毛竹林土壤微生物量高于闊葉林(圖1)。毛竹林土壤pH和土壤養(yǎng)分改善的綜合結(jié)果有利于土壤固氮細(xì)菌活動。

導(dǎo)致PCR-DGGE和定量PCR分析兩種方法結(jié)果不一致有以下兩種可能: 1)如果兩個(gè)土壤固氮微生物群落的物種組成有差別，由于不同DNA片段擴(kuò)增效率不同，出現(xiàn)的結(jié)果也會有差異[35]， 如有的物種的擴(kuò)增效率特別高，會出現(xiàn)條帶少而基因拷貝數(shù)總數(shù)高的結(jié)果; 雖然條帶數(shù)量較少但某些條帶亮度特別大，也可能出現(xiàn)條帶少而基因拷貝數(shù)總數(shù)高的結(jié)果，但這都不符合本研究的情況。兩種林地土壤的固氮細(xì)菌物種(DGGE中條帶位置)基本相同(圖3)，且闊葉林土壤大部分條帶亮度比毛竹林土壤強(qiáng)。2)與兩種分析方法的靈敏度不同有關(guān)。DGGE技術(shù)雖然克服了微生物培養(yǎng)過程中的一些困難，但是土壤中的微生物種群和數(shù)量的變化本身就是一個(gè)非常復(fù)雜的過程。并且，DGGE方法通常只能反映總DNA中占1%以上的菌群，數(shù)量太少的目標(biāo)片段無法顯示出來[36]，而定量分析則能擴(kuò)增微量的目標(biāo)片段; 前者好比放大鏡，難以清楚地觀察到微小的生物，而后者好比顯微鏡，能檢測到毛竹林土壤中存在著的低含量的目標(biāo)DNA。因此，DGGE方法可能低估了土壤固氮細(xì)菌的多樣性。當(dāng)然這一推測需要進(jìn)一步應(yīng)用其它方法來證實(shí)。類似的現(xiàn)象也發(fā)生在雷竹(Phyllostachysviolascens)林不同施肥處理對土壤氨氧化細(xì)菌的影響試驗(yàn)中，不同處理土壤功能基因(amoA)的DGGE多樣性差異與定量PCR正好相反[37]。

毛竹林土壤固氮細(xì)菌nifH基因豐度高意味著比闊葉林土壤固定更多的氮，雖然毛竹林通過挖筍和砍伐竹材帶走了不少養(yǎng)分，但毛竹林土壤有效養(yǎng)分水平總體改善明顯，而毛竹林土壤氮素水平的增加也可能是土壤固氮能力增強(qiáng)的結(jié)果。長此以往，土壤養(yǎng)分與土壤微生物相互促進(jìn)，形成良性循環(huán)。

綜合以上結(jié)果，闊葉林改種毛竹100多年后，土壤pH和氮、鉀的有效養(yǎng)分有所提高; DGGE檢測到的毛竹土壤固氮細(xì)菌多樣性明顯下降，但定量PCR檢測的土壤固氮基因(nifH)豐度顯著提高，定量結(jié)果與毛竹林土壤氮素水平提高結(jié)果吻合，因此，闊葉林改種毛竹后有利于土壤固氮細(xì)菌活動，從而改善土壤氮素供應(yīng)。

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Variation ofnifHgene diversity of soil nitrogen-fixing bacteria in Moso bamboo(Phyllostachyspubescens)plantation converted from broadleaf forest

SHEN Qiu-lan， HE Dong-hua， XU Qiu-fang*， CHENG Min， MAO Xin-wei， LI Yong-chun， CHEN Jun-hui

(CollegeofEnvironmentandResource，ZhejiangA&FUniversity/ZhejiangProvincialKeyLaboratoryofCarbonCyclinginForestEcosystemsandCarbonSequestration,Linan311300,China)

【Objectives】 Nitrogen plays an important role in promoting the growth of Moso bamboo, the major source of nitrogen in forest soil is derived from biological nitrogen fixation. However, little is known about the impact of conversion of broadleaf forest to bamboo (Phyllostachyspubescens) plantation on changes in soil nitrogen contents and soil nitrogen-fixing bacterial community structure.【Methods】 Two plots of broadleaf forest and Moso bamboo stands with the same site condition were selected. And 4 standard areas (10 m×10 m) were chosen randomly on the northeast slope in each plot. Soil samples were collected from the topsoil (0-20 cm) and subsoil (20-40 cm) layers separately. Soil pH, organic matter, available N, available P and readily available K were analyzed. The structure and abundance of nitrogen-fixing bacterial community were measured with primers AQER and PolF via denaturing gradient gel electrophoresis(DGGE) and qPCR based onnifHgene. Preliminary identifying of soil nitrogen-fixing bacteria was sequenced by cloning. 【Results】The results showed that compared to the broadleaf forest, Moso bamboo stands had significant higher pH, moisture, contents of available N in both topsoil and subsoil and readily available K in topsoil, while the soil available P was much lower. The DGGE profiles indicated that Moso bamboo stands had lower numbers of band and Shannon-Wiener index (H). Both cluster analysis and principal components analysis (PCA) of the DGGE profiles showed the separation of the two soils clearly, and there was little difference between topsoil and subsoil for the same treatment. The real-time PCR analysis revealed that copy number ofnifHgene in Moso bamboo was higher than that in broadleaf forest. Sequencing of 14 DGGE bands isolated revealed that 13 of them were affiliated withBradyrhizobiumand 1 withAzohydromonas, with the similarities ranging from 93% to 98% in known species of Gene Bank.【Conclusions】 This results showed that the conversion of broadleaf forest to bamboo plantation decreased the diversity of nitrogen-fixing bacterial community, but increased its abundance and nitrogen contents, indicating an enhanced nitrogen-fixing ability of soil.

Phyllostachyspubescens; soil nitrogen-fixing bacteria; nitrogen

2015-01-14接受日期: 2015-03-31網(wǎng)絡(luò)出版日期: 2015-12-11

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(41271274); 浙江省高等學(xué)校訪問學(xué)者教師專業(yè)發(fā)展項(xiàng)目(FX2013057)資助。

沈秋蘭(1989—)，女，浙江海寧人，碩士研究生，主要從事土壤生物與生物化學(xué)研究。 E-mail: lynnsql@163.com

E-mail: xuqiufang@zafu.edu.cn

S154.38+1; S795

A

1008-505X(2016)03-0687-10