朱曉媛，楊　斌，和兆榮，王崇云*，張滋第，劉　偉

( 1. 云南大學(xué) 生態(tài)學(xué)與地植物學(xué)研究所，昆明 650091； 2. 云南大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，昆明 650091； 3. 文山學(xué)院，云南 文山 663000 )

?

不同干擾生境下河口蓮座蕨遺傳多樣性分析

朱曉媛1，楊斌1，和兆榮2，王崇云1*，張滋第2，劉偉3

( 1. 云南大學(xué) 生態(tài)學(xué)與地植物學(xué)研究所，昆明 650091； 2. 云南大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，昆明 650091； 3. 文山學(xué)院，云南 文山 663000 )

該研究利用 ISSR 分子標(biāo)記，對(duì)不同生境下的6個(gè)河口蓮座蕨種群進(jìn)行遺傳多樣性分析。結(jié)果表明：從44條ISSR引物中篩選出8條能夠擴(kuò)增出清晰、穩(wěn)定條帶的引物，對(duì)6個(gè)河口蓮座蕨種群進(jìn)行基因組 DNA 擴(kuò)增，共擴(kuò)增出144條帶，其中多態(tài)性條帶119個(gè)，多態(tài)性條帶比率為93.7%，Nei’s遺傳多樣性指數(shù)(H)為0.296，Shannon多樣性指數(shù)(I)為0.457，遺傳分化指數(shù)(Gst)為0.152 0，種群遺傳一致度和遺傳距離分別為0.913 8～0.954 8和0.058 4～0.090 1；UPGMA聚類分析表明，種群間遺傳距離與空間距離和生境類型有關(guān)。河口蓮座蕨在不同干擾程度的生境中，種群具有高水平的遺傳多樣性，一定強(qiáng)度或頻率的干擾生境中，種群遺傳多樣性較高，與海拔、坡度和坡向無(wú)相關(guān)性。

河口蓮座蕨, 干擾, ISSR, 遺傳多樣性

近年來(lái)，生物遺傳多樣性(Genetic diversity)研究越來(lái)越受到重視，其中大多以分子標(biāo)記(RAPD標(biāo)記、ISSR標(biāo)記、SSR標(biāo)記等)展開(kāi)研究，為生物多樣性保護(hù)、中度干擾、系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系、交配系統(tǒng)等提供理論依據(jù)(潘麗芹等，2005；文隴英等，2006；周媛等，2009)。遺傳多樣性是生物多樣性的重要組成部分，是生態(tài)系統(tǒng)和物種多樣性的基礎(chǔ)。物種以種群為具體的存在形式，任何一個(gè)物種都具有獨(dú)特的基因庫(kù)和遺傳結(jié)構(gòu)，同時(shí)物種多樣性也顯示了基因多樣性(施立明，1990)。對(duì)一個(gè)物種而言，其遺傳多樣性既是維持繁殖活力和長(zhǎng)期適應(yīng)環(huán)境變化的基礎(chǔ)，又是生物多樣性保護(hù)的重要方面(陳靈芝等，2001)。中度干擾假說(shuō)(Intermediate Disturbance Hypothesis)指出群落中物種豐富度在中等干擾水平時(shí)最大(Connell，1978；文隴英等，2006)。環(huán)境干擾導(dǎo)致選擇壓力差異，或引起種群波動(dòng)，對(duì)種群遺傳多樣性分布與格局也會(huì)產(chǎn)生重要影響，但對(duì)此認(rèn)識(shí)還比較欠缺(Banks et al, 2013)。中國(guó)水青岡在人為活動(dòng)頻繁的環(huán)境下，幾乎沒(méi)有實(shí)生苗，種群即使能生存主要也是靠根蘗萌生更新，這將不利于遺傳多樣性的保存(李俊清，1996)。瀕危物種夏臘梅(Sinocalycanthuschinensis)在人為干擾的適宜生境中具有較高的遺傳多樣性(張文標(biāo)等，2005);觀光木(Tsoongiodendeonodorum)的遺傳多樣性也較高，但對(duì)生境要求嚴(yán)格，生境干擾是觀光木瀕危的主要原因之一(黃九香等，2002)。廣布種冷蒿(Aremisafrigida)隨干擾強(qiáng)度的增加，遺傳多樣性降低(王靜等，2004)；荒漠地帶性廣布種紅砂(Reaumuriasoongorica)在不同的干擾生境下，具有不同水平的遺傳多樣性，無(wú)干擾的自然保護(hù)區(qū)種群遺傳多樣性水平較高(張穎娟等，2008)。不同干擾環(huán)境下，瀕危種或廣布種檢測(cè)出不同的遺傳多樣性分布式樣。對(duì)于一些具有較高遺傳多樣性的瀕危植物來(lái)說(shuō)，其瀕危的主要因素之一是生境的破壞，隨生境的破壞程度加強(qiáng)，遺傳多樣性逐漸降低，但有些植物在一定頻率或強(qiáng)度干擾的適宜生境中可維持較高的遺傳多樣性。中度干擾假說(shuō)是否適用于解釋種群遺傳多樣性的分布與格局呢？

河口蓮座蕨(Angiopterishokouensis)為蓮座蕨科蓮座蕨屬植物，屬?gòu)V布種。河口蓮座蕨產(chǎn)于云南羅平、西疇、麻栗坡、馬關(guān)、屏邊、河口、金平、綠春、江城等地(錢崇澍等，1959；朱維明等，2006；王崇云等，2012)，生于常綠闊葉林及混交林下溪邊，常為植物群落中草本層的優(yōu)勢(shì)種，其分布生境多樣化，從原生性山地雨林到香蕉園地橡膠林，林緣農(nóng)田溝邊都有該植物生長(zhǎng)，可見(jiàn)河口蓮座蕨具有較廣的分布范圍并適應(yīng)異質(zhì)性的生境。野外觀察到河口蓮座蕨葉柄瘤突明顯程度、大小和排列狀況等存在較大形態(tài)變異，此外，云南植物志卷(二十卷)對(duì)該種收錄了13個(gè)異名(朱維明等，2006)，一度分類處理的混亂側(cè)面反映了其豐富的形態(tài)變異。本文以河口蓮座蕨為研究對(duì)象，利用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)不同干擾生境下的河口蓮座蕨種群開(kāi)展遺傳多樣性研究，分析其遺傳多樣性格局和種群遺傳分化程度，探討不同干擾強(qiáng)度的河口蓮座蕨種群遺傳多樣性特征，為蓮座蕨科中的廣布種、狹域種、瀕危種的遺傳多樣性和種群分化，及其與生境干擾的關(guān)系研究積累資料，為這一類大型肉質(zhì)蕨類植物的保護(hù)提供理論指導(dǎo)。

1　材料與方法

1.1 材料

以河口蓮座蕨主要分布區(qū)—紅河州河口縣為中心，對(duì)滇東南的該物種分布區(qū)(圖1)進(jìn)行了生境實(shí)地調(diào)查，根據(jù)人類干擾強(qiáng)度劃分群落生境類型并記錄海拔、坡度、坡向，同時(shí)采集6個(gè)種群(表1)，每個(gè)種群最少采集15株個(gè)體的新鮮葉片，選取植株上較好(鮮嫩、干凈、無(wú)生蟲(chóng)、發(fā)黃等)的葉片，去除中間的主脈及葉邊有破損的地方，后放入裝有干燥硅膠的密封袋保存，同時(shí)保存一定數(shù)量的憑證標(biāo)本。

1.2 方法

1.2.1 總DNA提取及檢測(cè)采用改良的CTAB法(Murray et al，1980；鄒喻萍等，2001)提取DNA，用0.8%瓊脂糖凝膠電泳后于凝膠成像系統(tǒng)檢驗(yàn)DNA質(zhì)量。DNA樣品置于-20 ℃冰箱中保存、備用。

1.2.2 ISSR引物篩選及反應(yīng)體系選取8個(gè)DNA模板，根據(jù)加拿大哥倫比亞大學(xué)公布的ISSR引物序列設(shè)計(jì)44個(gè)ISSR引物進(jìn)行篩選。經(jīng)過(guò)反復(fù)實(shí)驗(yàn)，選擇擴(kuò)增條帶清晰、反應(yīng)穩(wěn)定且多態(tài)性較好的8個(gè)ISSR引物(表2)對(duì)所有DNA樣品進(jìn)行擴(kuò)增。

PCR反應(yīng)體系的總體積為25 μL，模板DNA 32 ng·μL-1，Taq聚合酶1U，dNTP 0.2 mmol·L-1，引物1.3 mmol·L-1，Mg2+1.5 mmol·L-1。擴(kuò)增程序: 94 ℃，5 min，38個(gè)循環(huán)；94 ℃，45s；48～58 ℃，1 min；72 ℃，1 min；72 ℃，5 min，4 ℃保存。PCR產(chǎn)物用2% (含EB約0.5 μg·mL-1) 的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，電壓為3 V·cm-1，電泳2 h。電泳結(jié)果用Gene System凝膠成像系統(tǒng)照相，記錄結(jié)果。

表 1　分子實(shí)驗(yàn)材料采集地群落樣地綜合簡(jiǎn)表Table 1　General description of communit of Angiopteris hokouensis

圖 1　分子實(shí)驗(yàn)材料采集地分布圖Fig. 1　Distribution of Angiopteris hokouensis

1.2.3 統(tǒng)計(jì)與分析每個(gè)樣品的擴(kuò)增條帶通過(guò)UVIPhoto軟件判讀，POPGENE32軟件進(jìn)行遺傳多樣性參數(shù)分析，遺傳多樣性參數(shù)分別為多態(tài)性位點(diǎn)比(PPB)、有效等位基因數(shù)、Shannon多樣性指數(shù)(I)、Nei’s遺傳多樣性指數(shù)(H)、基因分化系數(shù)(Gst)、Nei’s遺傳一致度、遺傳距離；采用SPSS17.0軟件進(jìn)行平均數(shù)差異的顯著性檢驗(yàn)和相關(guān)性分析。

表 2　ISSR引物序列Table 2　Sequence of 8 primers

2　結(jié)果與分析

2.1 遺傳多樣性及遺傳分化

8個(gè)ISSR引物在6個(gè)種群中共擴(kuò)增出127條，平均每個(gè)引物擴(kuò)增出14.88條帶，多態(tài)性條帶數(shù)為119個(gè)，PPB為93.7%。

表3顯示，Shannon指數(shù)的遺傳多樣性各種群大小順序?yàn)槔渌疁?>冷水溝3>南溪1>冷水溝1>王國(guó)卡>南溪2，與多態(tài)位點(diǎn)比率稍有差異。Nei’s基因多樣性指數(shù)計(jì)算的結(jié)果與Shannon指數(shù)計(jì)算的結(jié)果一致，各種群在0.230～0.270 0之間變化。

表 3　6個(gè)河口蓮座蕨種群多態(tài)性及遺傳差異統(tǒng)計(jì)Table 3　Polymorphic loci and genetic diversity in 6 Angiopteris hokouensis populations

根據(jù)Nei’s基因多樣性指數(shù)計(jì)算的種群遺傳分化結(jié)果，6個(gè)種群總的遺傳多樣性Ht=0.295 2，種群內(nèi)遺傳多樣性Hs=0.250 3，種群間遺傳多樣性Dst=0.044 9，各種群間存在一定遺傳變異，遺傳分化系數(shù)Gst=0.152 0，即15.2%的變異存在于種群間，84.8%的遺傳變異存在于種群內(nèi)?；诜N群間遺傳分化系數(shù)計(jì)算的基因流Nm=2.789 4>1，說(shuō)明不同生境的種群間存在一定基因流，防止因遺傳漂變導(dǎo)致的種群間的遺傳分化。

2.2 種群遺傳一致度和聚類分析

Nei’s遺傳一致度和遺傳距離反映了種群間的親緣關(guān)系遠(yuǎn)近。河口蓮座蕨6個(gè)種群的遺傳一致度在0.913 8～0.954 8之間，遺傳距離在0.046 3～0.090 1之間(表4)。

根據(jù)遺傳距離，運(yùn)行POPGENE32軟件，采用UPGMA法構(gòu)建的種群遺傳關(guān)系聚類圖(圖2)。聚類圖中可看出，6個(gè)種群可分為兩大類群：第一類群僅南溪2種群；第二類群包括其余的5個(gè)種群，即冷水溝1、冷水溝2、冷水溝3、南溪1和王國(guó)卡種群。

表 4　河口蓮座蕨種群的遺傳一致度和遺傳距離Table 5　Genetic identity and genetic distance among the populations of Angiopteris hokouensis

注：對(duì)角線上為遺傳一致度；對(duì)角線下為遺傳距離。

Note: On the diagonal, genetic identity; below diagonal, genetic distance.

圖 2　ISSR-PCR種群遺傳距離聚類圖Fig. 2　Dendrogram of ISSR cluster analysis of 6 populations

在第二類群中，冷水溝2和冷水溝3的遺傳距離最小，為0.046 3，首先聚為一支，其次冷水溝1與它們的距離也較小，分別為0.066 4和0.058 4，再聚為一支；再次是南溪1和王國(guó)卡種群聚為一支，二者的遺傳距離為0.071 9。

其中冷水溝1、冷水溝2、冷水溝3空間分布上較為接近，其次是南溪1和南溪2空間分布上較為接近，但冷水溝2、冷水溝3與冷水溝1生境類型不同，南溪1和南溪2生境類型也不同，有著較大的遺傳距離。

2.3 海拔、坡度和坡向與遺傳多樣性

6個(gè)河口蓮座蕨的遺傳多樣性與海拔、坡度和坡向進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果表明海拔、坡度和坡向與多態(tài)位點(diǎn)比率(r=0.606，P=0.202)、Shannon多樣性指數(shù)(r=0.740，P=0.092 )和Nei’s遺傳多樣性指數(shù)(r=0.763，P=0.077)均無(wú)顯著相關(guān)關(guān)系。

圖 3　生境類型與遺傳多樣性的相關(guān)性Fig. 3　Relationship between habitat types and genetic diversity

2.4 生境與遺傳多樣性

結(jié)合采集地的不同干擾程度，將6個(gè)種群分為兩類，即人工林型種群的冷水溝2、冷水溝3、南溪1、王國(guó)卡為一類，代表天然林種群的冷水溝1(次生林)和南溪2(原生林)為一類，兩種生境類型的種群，多態(tài)位點(diǎn)比率、Shannon多樣性指數(shù)、Nei’s遺傳多樣性指數(shù)(P>0.05)顯著性差異(圖3)。

3　討論

Connell(1978)通過(guò)大量生態(tài)學(xué)研究提出了中度干擾假說(shuō)，即中等程度的干擾水平能維持高度生物多樣性。中度干擾假說(shuō)是生態(tài)學(xué)中引用率最高的假說(shuō)之一，但也存在廣泛的質(zhì)疑，F(xiàn)ox(2013)指出僅有少于20%的研究顯示中度干擾水平下生物多樣性水平達(dá)到最高峰。干擾，尤其是中度干擾能增加生境及生態(tài)過(guò)程的多樣性(葉林奇，2000)，導(dǎo)致歧化選擇過(guò)程，并發(fā)生遺傳分化，形成不同的遺傳多樣性水平。廣布種出現(xiàn)瀕危狀況的主要原因之一是生境遭到人類的破壞，導(dǎo)致其生境類型改變，這些廣布種往往具有較高水平的遺傳多樣性，因此，干擾對(duì)其種群遺傳結(jié)構(gòu)將會(huì)有重要的影響。

本研究野外觀察發(fā)現(xiàn)，作為林下植物的河口蓮座蕨在不同群落生境中長(zhǎng)勢(shì)有明顯差異，人工林和次生林中長(zhǎng)勢(shì)較好。本研究6個(gè)調(diào)查種群均表現(xiàn)出較高程度的遺傳多樣性，在不同干擾程度的群落生境中具有不同水平的遺傳多樣性，一定強(qiáng)度干擾的種群與其它種群相比，具較高的遺傳多樣性，但無(wú)顯著性差異。同時(shí)，遺傳多樣性與海拔、坡度、坡向無(wú)顯著相關(guān)關(guān)系。產(chǎn)于英屬Pitcairn島的Angiopterischauliodonta及產(chǎn)于臺(tái)灣的伊藤氏原始蓮座蕨(Archangiopterisitoi)為瀕危及特有種，這兩物種的RAPD分子標(biāo)記表明，在人類干擾下其遺傳多樣性較低(Naomi et al，2004；Xu et al，2000)。與上述兩物種相比，河口蓮座蕨遺傳多樣性較高，具更好的環(huán)境適應(yīng)能力，且不同群落生境類型下的河口蓮座蕨種群都有較高的遺傳多樣性，存在一定強(qiáng)度人為干擾的生境中，種群具有相對(duì)高的遺傳多樣性水平。

通常良好的環(huán)境資源、較高的空間異質(zhì)性和一定強(qiáng)度的歧化選擇，都有利于植物維持較高的遺傳多樣性(紅雨等，2006；張志紅等，2005；黎中寶等，2000)。因此，對(duì)于適應(yīng)環(huán)境能力較強(qiáng)、分布較廣的河口蓮座蕨來(lái)說(shuō)，自然環(huán)境條件的不同(海拔、坡向)并不是造成其遺傳多樣性較高的因素，但一定強(qiáng)度或頻率的干擾可能對(duì)維持其遺傳多樣性水平有更重要的意義。較高的遺傳多樣性可能是對(duì)干擾的一種適應(yīng)，其它廣布種也存在類似的情況(張穎娟等，2008)。

4　結(jié)論

(1)用8條引物進(jìn)行ISSR分析，擴(kuò)增共產(chǎn)生127條帶，其中119為多態(tài)性條帶，PPB為93.7%，說(shuō)明6個(gè)河口蓮座蕨種群具有高水平的遺傳多樣性。(2)河口蓮座蕨采自河口縣不同地方，地形因子存在一定的差異，相關(guān)性分析顯示海拔、坡度和坡向的差異對(duì)遺傳多樣性無(wú)顯著影響。(3)不同干擾生境中，河口蓮座蕨的遺傳多樣性存在一定差異。不同生境類型中，遺傳多樣性差異不顯著，但一定程度或頻率的干擾種群和其它種群相比，遺傳多樣性水平更高。

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Analysis on the genetic diversity of Angiopterishokouensisin habitats under different disturbances

ZHU Xiao-Yuan1, YANG Bin1, HE Zhao-Rong2,WANG Chong-Yun1*, ZHANG Zi-Di2, LIU Wei3

( 1. Institute of Ecology and Geobotany, Yunnan University, Kunming 650091, China; 2. College of Life Sciences,YunnanUniversity, Kunming 650091, China; 3.WenshanTeachers’College, Wenshan 663000, China )

Genetic diversity of 6Angiopterishokouensispopulations collected from different habitats were analyzed by means of intersimple sequence repeat (ISSR) markers, and 8 proper primers with rich polymorphism and stable bands were selected from a total of 44 ISSR’s primers. The genome DNAs of the 6 populations were amplified to a total of 144 putative bands by the 8 primers, in which 96 were polymorphism bands. Polymorphism rate was 93.7%; Nei’s gene diversity index was 0.296, Shannon information index was 0.457, andGst was 0.152 0. The genetic distance coefficient and the genetic similarity were 0.058 4-0.090 1 and 0.913 8-0.954 8. Cluster analysis by UPGMA indicated that the genetic distance between the populations related to spatial distance, as well as to habitats. The results showed thatA.hokouensispopulations had high levels of genetic diversity at disturbed habitats. Even there was no significant differentiation of genetic diversity among populations,the populations in moderate disturbed habitats had higher genetic diversity. The genetic diversity was not significantly related toaltitude,slope and aspect．

Angiopterishokouensis, disturbance,ISSR, genetic diversity

10.11931/guihaia.gxzw201312056

2014-12-30

2015-03-27

國(guó)家自然科學(xué)基金(30260011，31260078) [Supported by the National Natural Science Foundation of China (30260011，31260078)]。

朱曉媛(1987- )，女，云南玉溪人，碩士研究生，主要從事外來(lái)入侵生物分子標(biāo)記技術(shù)研究，(E-mail)zhuxiaoyuan1987@126.com。

王崇云，博士，副教授，研究方向?yàn)橹参锷鷳B(tài)學(xué)、進(jìn)化生態(tài)學(xué)、生物多樣性保護(hù)等，(E-mail)cywang@ynu.edu.cn。

Q943

A

1000-3142(2014)07-0818-06

朱曉媛，楊斌，和兆榮，等. 不同干擾生境下河口蓮座蕨遺傳多樣性分析 [J]. 廣西植物，2016，36(7):818-823

ZHU XY,YANG B,HE ZR，et al. Analysis on the genetic diversity ofAngiopterishokouensisin habitats under different disturbances [J]. Guihaia，2016，36(7):818-823