石春芳, 王志勇, 冷小云, 劉菊梅, 曹菊梅

(1. 內(nèi)蒙古科技大學(xué) 數(shù)理與生物工程學(xué)院, 內(nèi)蒙古 包頭　014010；2. 內(nèi)蒙古大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院, 內(nèi)蒙古 呼和浩特　010021；3. 內(nèi)蒙古包頭市土壤肥料工作站, 內(nèi)蒙古 包頭　014010； 4 內(nèi)蒙古包頭北郊污水處理廠, 內(nèi)蒙古 包頭　014010)

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土壤磷酸酶活性測(cè)定方法的改進(jìn)

石春芳1,2, 王志勇3, 冷小云1, 劉菊梅1, 曹菊梅4

(1. 內(nèi)蒙古科技大學(xué) 數(shù)理與生物工程學(xué)院, 內(nèi)蒙古 包頭014010；2. 內(nèi)蒙古大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院, 內(nèi)蒙古 呼和浩特010021；3. 內(nèi)蒙古包頭市土壤肥料工作站, 內(nèi)蒙古 包頭014010； 4 內(nèi)蒙古包頭北郊污水處理廠, 內(nèi)蒙古 包頭014010)

磷酸酶是土壤中非常重要的酶類,其活性可作為評(píng)價(jià)土壤磷素生物轉(zhuǎn)化方向與強(qiáng)度的指標(biāo)，快速、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確的測(cè)定方法對(duì)磷酸酶的研究具有促進(jìn)作用。在磷酸苯二鈉比色法基礎(chǔ)上進(jìn)行改進(jìn),用酶標(biāo)板/酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度,不僅減少了試劑使用量,而且縮短了測(cè)定時(shí)間,在樣品量較大時(shí)可降低操作人員的工作強(qiáng)度。

土壤； 磷酸酶活性； 測(cè)定方法

土壤酶來(lái)源于土壤微生物的生長(zhǎng)代謝活動(dòng)和植物根系分泌物,主要參與土壤中物質(zhì)的生物轉(zhuǎn)化和養(yǎng)分形態(tài)轉(zhuǎn)化。通過分析土壤酶活性大小,可以間接考察土壤微生物群落活性、土壤生物化學(xué)反應(yīng)程度、土壤肥力狀況及土壤污染狀況[1-4]。磷酸酶是土壤中一類重要的酶類,參與有機(jī)磷的轉(zhuǎn)化,可加速有機(jī)磷的脫磷速度,其活性高低與土壤中有機(jī)磷含量和pH值相關(guān),可作為評(píng)價(jià)土壤磷素生物轉(zhuǎn)化方向和強(qiáng)度的指標(biāo)[5-7]。磷酸酶活性的測(cè)定,其基本原理是根據(jù)酶促作用生成的有機(jī)基團(tuán)量或無(wú)機(jī)磷量來(lái)計(jì)算磷酸酶活性[8-9],前一種方法通稱為有機(jī)基團(tuán)含量法,是較為常用的測(cè)定磷酸酶活性方法,后一種稱為無(wú)機(jī)磷含量法。磷酸苯二鈉比色法即是一種采用有機(jī)基團(tuán)含量法測(cè)定磷酸酶活性的方法,所用基質(zhì)為磷酸苯二鈉,利用分光光度計(jì)測(cè)定A660[10-12]。本實(shí)驗(yàn)的改進(jìn)之處是縮小顯色液體積,吸光度測(cè)定利用酶標(biāo)儀,在減少試劑用量的同時(shí),縮短了讀數(shù)時(shí)間,當(dāng)測(cè)定樣本量較大時(shí),可降低操作人員的工作強(qiáng)度。

1　實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1儀器和主要試劑

儀器:酶標(biāo)儀、酶標(biāo)板、移液槍、恒溫培養(yǎng)箱。

試劑:硼酸鹽緩沖液，0.5%磷酸苯二鈉，氯代二溴對(duì)苯醌亞胺試劑，甲苯，0.3%硫酸鋁溶液，酚標(biāo)準(zhǔn)溶液(0.01mg/mL)。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1原有方法

實(shí)驗(yàn)步驟:稱5g土樣置于200mL三角瓶中,加2.5mL甲苯,輕搖15min后加入20mL、0.5%用硼酸鹽緩沖液配制的磷酸苯二鈉,搖勻后放入恒溫箱,37 ℃下培養(yǎng)24h；然后在培養(yǎng)液中加入100mL、0.3%硫酸鋁溶液并過濾；吸取3mL濾液于50mL容量瓶中,然后按繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線方法顯色。

標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制:取0、1、3、5、7、9、11、13mL酚工作液,置于50mL容量瓶中,每瓶加入5mL硼酸緩沖液和4滴氯代二溴對(duì)苯醌亞胺試劑,顯色后稀釋至刻度；30min后,在分光光度計(jì)上660nm處比色。以顯色液中酚濃度為橫坐標(biāo),吸光值為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.2改進(jìn)方法

實(shí)驗(yàn)步驟:稱5g土樣置于200mL三角瓶中,加2.5mL甲苯,輕搖15min后,加入20mL用硼酸鹽緩沖液配制的0.5%磷酸苯二鈉,搖勻后放入恒溫箱,37 ℃下培養(yǎng)24h；然后在培養(yǎng)液中加入100mL、0.3%硫酸鋁溶液并過濾；吸取0.3mL濾液于10mL試管中,然后按繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線方法顯色。

標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制:取0、0.1、0.3、0.5、0.7、0.9、1.1、1.3mL酚工作液,置于10mL試管中,每管加入0.5mL硼酸緩沖液和1滴氯代二溴對(duì)苯醌亞胺試劑,顯色后稀釋至5mL；30min后,吸取200μL加入酶標(biāo)板,在酶標(biāo)儀上測(cè)定A660。以顯色液中酚濃度為橫坐標(biāo),吸光值為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2　結(jié)果與討論

2.1標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

用移液槍分別吸取不同體積的酚工作液(0.01g/L)至10mL試管中,分別加入0.5mL硼酸緩沖液,1滴氯代二溴對(duì)苯醌亞胺試劑,顯色后分別加入相應(yīng)體積的蒸餾水,顯色液總體積為5mL；30min后用移液槍吸取200μL顯色液至于酶標(biāo)板中,在酶標(biāo)儀中測(cè)定A660。

顯色液體系及標(biāo)準(zhǔn)曲線分別見表1和圖1。

表1　標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制時(shí)的顯色液體系

圖1　酚標(biāo)準(zhǔn)曲線

由圖1可見,回歸系數(shù)為0.9983,線性較好。

2.2兩種方法對(duì)比

原方法與改進(jìn)方法的顯色液用量的比較見表2。

表2　兩種方法顯色液用量的比較

由表2可見,改進(jìn)方法中顯色液總體積大幅度降低,所需試劑使用量減少到原方法的1/10,可同時(shí)測(cè)定的樣品數(shù)由5個(gè)增加到96個(gè),改進(jìn)方法可大大縮短樣品分析測(cè)定時(shí)間,減少樣品及試劑使用量。

2.3土壤樣品堿性磷酸酶活性測(cè)定結(jié)果比較

利用兩種方法測(cè)定4個(gè)土壤樣品的堿性磷酸酶活性,測(cè)定結(jié)果見表3。

表3　土壤堿性磷酸酶活性

由表3可見,改進(jìn)方法測(cè)定的土壤堿性磷酸酶活性與原方法測(cè)定結(jié)果非常接近,t檢驗(yàn)表明,兩種方法測(cè)定結(jié)果之間無(wú)顯著差異(p=0.348)。

3　結(jié)論

(1) 改進(jìn)后的土壤堿性磷酸酶活性測(cè)定方法,可縮短樣品檢測(cè)分析時(shí)間,減少試劑的使用量。

(2) 利用改進(jìn)方法繪制的酚標(biāo)準(zhǔn)曲線結(jié)果表明線性回歸較好。

(3) 對(duì)4個(gè)土壤樣品堿性磷酸酶活性測(cè)定結(jié)果表明,改進(jìn)方法與原方法無(wú)顯著差異,樣品量較大時(shí)推薦采用改進(jìn)方法進(jìn)行測(cè)定。

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Improvementofsoilphosphataseactivitymeasurementmethod

ShiChunfang1,2,WangZhiyong3,LengXiaoyun1,LiuJumei1,CaoJumei4

(1.SchoolofMathematics,PhysicsandBiologicalEngineering;InnerMongoliaUniversityofScience&Technology,Baotou014010,China; 2.CollegeofLifeSciences,InnerMongoliaUniversity,Hohhot010021,China; 3.SoilandFertilizerStationofBaotou,Baotou014010,China；4.BaotouNorthSuburbWastewaterTreatmentPlant,Baotou014010,China)

Phosphatasewasveryimportantsoilenzymeswhichhasbeeninvolvedintheconversionoforganicphosphorusinthesoil,anditsactivitycouldbevaluedasindicatorofsoilphosphorusbiotransformationdirectionandstrength.Thefast,simpleandaccuratemeasuringmethodhasafacilitatingroleinphosphatasesresearch.ImprovementmethodisbasedonDisodiumphosphatebenzenecolorimetricmethod,andtheabsorbancewasmeasuredbymicrotiterplates/microplate.Notonlytheamountofreagentusehasbeenreduced,butalsothemeasurementtimehasbeenshortened,andtheoperators’workintensitycanbereducedwhentherewerelotsofsamples.

soil；phosphataseactivity；measurementmethod

DOI:10.16791/j.cnki.sjg.2016.07.012

2015-11-16

包頭市科技計(jì)劃項(xiàng)目(2014Z1010-3)；內(nèi)蒙古自治區(qū)自然科學(xué)基金項(xiàng)目(2015MS0332)

石春芳(1978—)，女(蒙古族)，內(nèi)蒙古包頭，碩士，副教授，主要從事環(huán)境生物技術(shù)方面的科研工作.

E-mail：13848273693@163.com

S151.9

B

1002-4956(2016)7-0048-02