張夢(mèng)曉，孫小錦，張智瑞，潘　瓊，趙素容，劉　浩

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·基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)·

鈣蛋白酶抑制劑Calpeptin對(duì)乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞遷移的影響

張夢(mèng)曉，孫小錦，張智瑞，潘瓊，趙素容，劉浩

目的：探討鈣蛋白酶抑制劑Calpeptin對(duì)乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞遷移能力的影響，為治療乳腺癌轉(zhuǎn)移提供思路。方法：MTT法檢測(cè)不同濃度Calpeptin對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞增殖的影響；細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)及Transwell遷移實(shí)驗(yàn)檢測(cè)不同濃度的Calpeptin對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞遷移的影響；Western blot法檢測(cè)不同濃度Calpeptin對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞基質(zhì)金屬蛋白酶-2表達(dá)的影響。結(jié)果：Calpeptin可抑制MDA-MB-231細(xì)胞的增殖，其增殖抑制作用隨濃度的增大而增加(P<0.01)。Calpeptin作用MDA-MB-231細(xì)胞24 h后，細(xì)胞的遷移能力明顯下降(P<0.01)。Western blot結(jié)果顯示，Calpeptin可下調(diào)MDA-MB-231細(xì)胞中細(xì)胞基質(zhì)金屬蛋白酶-2的表達(dá)。結(jié)論：Calpeptin能夠抑制乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞遷移，其機(jī)制可能與下調(diào)MMP-2的表達(dá)有關(guān)。

乳腺腫瘤；MDA-MB-231細(xì)胞；鈣蛋白酶；Calpeptin；遷移；細(xì)胞基質(zhì)金屬蛋白酶-2

乳腺癌是女性最常見(jiàn)的惡性腫瘤，全身系統(tǒng)性轉(zhuǎn)移是乳腺癌發(fā)展的最終結(jié)果，也是導(dǎo)致患者死亡的主要原因，其具體機(jī)制仍不完全清楚。鈣蛋白酶(calpain)是依賴(lài)于Ca2+的蛋白水解酶，其在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用是近年來(lái)的研究熱點(diǎn)[1-2]，calpain抑制劑也是抗腫瘤藥物開(kāi)發(fā)的重要方向[3]。本研究以乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞為對(duì)象，觀察了calpain抑制劑Calpeptin對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞增殖及遷移能力的影響，并對(duì)其作用機(jī)制進(jìn)行初步探討，以期為乳腺癌轉(zhuǎn)移的治療提供思路。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1細(xì)胞人乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231，購(gòu)自美國(guó)ATCC，蚌埠醫(yī)學(xué)院生化藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)室凍存。

1.1.2主要試劑及耗材DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco公司；胎牛血清(FBS)購(gòu)自杭州四季青工程材料有限公司；Calpeptin購(gòu)自Sigma公司；兔抗人MMP-2抗體購(gòu)自Abcam公司；鼠抗人β-actin抗體、山羊抗兔IgG、山羊抗鼠IgG購(gòu)自Biosharp公司；Transwell小室、細(xì)胞培養(yǎng)瓶及培養(yǎng)板購(gòu)自Corning公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)MDA-MB-231細(xì)胞培養(yǎng)于含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基中，置于37 ℃、飽和濕度、5%CO2的條件下培養(yǎng)。

1.2.2MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，以5×104/mL的密度接種于96孔板中，每孔100 μL，24 h后換用無(wú)血清DMEM培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)設(shè)置調(diào)零組、對(duì)照組和不同濃度Calpeptin(10、20、50、100 μmol/L)處理組。培養(yǎng)24 h或48 h后，每孔加入MTT溶液 15 μL，放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，棄上清，每孔加入DMSO 150 μL，振蕩10 min，490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值。以(OD給藥組-OD調(diào)零組)/(OD對(duì)照組-OD調(diào)零組)×100%計(jì)算細(xì)胞存活率。

1.2.3細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，以1×105/mL的密度接種于6孔板，每孔2 mL，培養(yǎng)24 h。待細(xì)胞生長(zhǎng)至90%融合時(shí)，用200 μL的無(wú)菌槍頭沿孔中心刻痕，棄去原有培養(yǎng)基，用PBS漂洗3次。每孔加入含1% FBS的DMEM培基2 mL。實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組和不同濃度的Calpeptin(10、20、50 μmol/L)處理組。分別于處理的0 h和24 h觀察劃痕愈合情況并拍照。采用Image J軟件分析劃痕愈合率。

1.2.4Transwell遷移實(shí)驗(yàn)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，消化后用無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基重懸，Transwell小室的上室中加入200 μL含或不含藥物的細(xì)胞懸液，每孔5×104個(gè)細(xì)胞；下室加入600 μL含5%FBS的DMEM培養(yǎng)基。實(shí)驗(yàn)分組同細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)。于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h后，取出小室，PBS漂洗3次，室溫下置于4%多聚甲醛固定15 min，濕棉棒擦除上室細(xì)胞后，1%結(jié)晶紫染液室溫下染色15 min，顯微鏡下每孔隨機(jī)取5個(gè)視野拍照，細(xì)胞計(jì)數(shù)。

1.2.5Western blot法檢測(cè)蛋白表達(dá)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，接種于6 cm培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)至90%融合。實(shí)驗(yàn)分組同細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)。處理24 h后，消化收集細(xì)胞，加入含有蛋白酶抑制劑的細(xì)胞裂解液冰上裂解30 min，離心后吸取上清液，BCA法測(cè)定蛋白濃度。每組取20 μg蛋白，經(jīng)SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)至PVDF膜，5 %脫脂牛奶室溫封閉4 h后，一抗4 ℃孵育過(guò)夜，TPBS洗膜后，二抗室溫孵育2 h，ECL發(fā)光顯影，Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)獲取圖像。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用方差分析和q檢驗(yàn)。

2　結(jié)果

2.1不同濃度Calpeptin對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞增殖的影響MTT結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較， 10、20、50、100 μmol/L的Calpeptin作用于MDA-MB-231細(xì)胞24 h和48 h存活率均明顯降低(P<0.01)，且Calpeptin對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞的增殖抑制作用均隨濃度和作用時(shí)間的增加而增強(qiáng)(見(jiàn)表1)。

q檢驗(yàn)：與對(duì)照組比較**P<0.01；與10 μmol/L Calpeptin組比較△△P<0.01；與20 μmol/L Calpeptin組比較##P<0.01；與50 μmol/L Calpeptin組比較&&P<0.01

2.2不同濃度Calpeptin對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞遷移的影響劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，經(jīng)不同濃度Calpeptin處理后，MDA-MB-231細(xì)胞的劃痕愈合率明顯低于對(duì)照組(P<0.01)，且隨著Calpeptin濃度增加，MDA-MB-231細(xì)胞劃痕愈合率顯著降低(P<0.01)(見(jiàn)圖1、表2)。

q檢驗(yàn)：與對(duì)照組比較**P<0.01；與10 μmol/L Calpeptin組比較△△P<0.01；與20 μmol/L Calpeptin組比較##P<0.01

Transwell遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，使用不同濃度Calpeptin處理MDA-MB-231細(xì)胞后，穿膜進(jìn)入Transwell下室的細(xì)胞數(shù)目均較對(duì)照組明顯減少(P<0.01)，且下室細(xì)胞數(shù)目隨Calpeptin濃度的增加而減少(P<0.01)(見(jiàn)圖2、表3)。

2.3Calpeptin下調(diào)MDA-MB-231細(xì)胞中MMP-2的表達(dá)Western blot法結(jié)果顯示，采用Calpeptin處理24 h后，MDA-MB-231細(xì)胞中MMP-2的表達(dá)下降(見(jiàn)圖3)。

q檢驗(yàn)：與對(duì)照組比較**P<0.01；與10 μmol/L Calpeptin組比較△△P<0.01；與20 μmol/L Calpeptin組比較##P<0.01

3　討論

Calpain是一類(lèi)鈣依賴(lài)性的半胱氨酸蛋白酶，已知有16種亞型，其中calpain-1和calpain-2是最主要的同工酶。calpain通過(guò)有限的蛋白水解作用調(diào)控多種蛋白質(zhì)的生物學(xué)活性，在細(xì)胞骨架重構(gòu)、神經(jīng)發(fā)育、細(xì)胞周期調(diào)控與凋亡、葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)、細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等生理過(guò)程中有重要作用。惡性腫瘤細(xì)胞中calpain的表達(dá)或活性常明顯升高，如calpain在膽囊癌組織內(nèi)呈高表達(dá)，且表達(dá)陽(yáng)性率明顯高于癌旁組織，提示其可能與癌癥的疾病進(jìn)展正相關(guān)[4]；而乳腺腫瘤中，calpain的活性明顯增高，可剪切乳腺癌細(xì)胞表面的人表皮生長(zhǎng)因子受體2，降低腫瘤細(xì)胞對(duì)內(nèi)分泌治療的敏感性[5]。以往的研究結(jié)果顯示，抑制calpain的活性可導(dǎo)致多種腫瘤細(xì)胞的死亡[1]，因此calpain抑制劑的開(kāi)發(fā)是抗腫瘤藥物研發(fā)的重要方向。calpeptin是一種人工合成的高效、具有細(xì)胞滲透性的、廣泛的calpain抑制劑，其在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中顯示出較好的對(duì)腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用，提示其有可能被開(kāi)發(fā)成藥物應(yīng)用于臨床。MATAGA等[6]的研究結(jié)果表明，calpeptin可將MDA-MB-231細(xì)胞阻滯在S期并增加其早期凋亡。本研究結(jié)果證實(shí)，calpeptin可濃度依賴(lài)地抑制MDA-MB-231細(xì)胞的增殖(P<0.01)。

腫瘤轉(zhuǎn)移是一個(gè)多因素調(diào)控、多階段、連續(xù)復(fù)雜的生物學(xué)過(guò)程，細(xì)胞遷移能力的大小被認(rèn)為是腫瘤轉(zhuǎn)移的限速環(huán)節(jié)。腫瘤細(xì)胞在細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)中的運(yùn)動(dòng)可分為4個(gè)步驟：(1)細(xì)胞前緣偽足形成與延伸；(2)細(xì)胞前段局部黏著斑形成；(3)肌動(dòng)-肌球蛋白復(fù)合體介導(dǎo)細(xì)胞體收縮；(4)細(xì)胞尾部黏著斑解離。calpain的活化是導(dǎo)致細(xì)胞遷移能力增強(qiáng)的重要原因。已證實(shí)，參與黏著斑形成的多種蛋白，如黏著斑激酶、整合素、ezrin、talin等均是calpain的底物[2]，calpain通過(guò)蛋白水解作用，切斷整合素與肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的聯(lián)結(jié)，使細(xì)胞尾部黏著斑解體，促進(jìn)細(xì)胞的遷移。此外，CORTESIO等[8]發(fā)現(xiàn)，在乳腺癌細(xì)胞中，calpain-2的活化對(duì)于偽足的形成是必需的，使用RNA干擾降低calpain-2的表達(dá)后，偽足的形成及細(xì)胞的侵襲能力被明顯抑制。因此，抑制calpain的活性可能成為抑制腫瘤細(xì)胞遷移的重要手段。本研究采用細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)及Transwell遷移實(shí)驗(yàn)證明，calpeptin能夠抑制MDA-MB-231細(xì)胞的遷移，且其抑制作用隨藥物濃度的增大而增加(P<0.01)。

在腫瘤轉(zhuǎn)移的過(guò)程中，ECM的降解和基膜的破壞是一個(gè)關(guān)鍵步驟?；|(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMP)是一類(lèi)鋅離子依賴(lài)的蛋白水解酶，能降解幾乎所有ECM成分。一般認(rèn)為MMP-2與腫瘤轉(zhuǎn)移的關(guān)系十分密切。多個(gè)研究表明calpain可增加MMP-2的表達(dá)。calpain的小亞基(Capn4)可通過(guò)磷酸化FAK及Src激活FAK-Src信號(hào)通路，進(jìn)而上調(diào)肝癌細(xì)胞中MMP-2的表達(dá)[8]，使用siRNA下調(diào)calpain的表達(dá)后，肝癌細(xì)胞的MMP-2和MMP-9的分泌顯著降低；而在鼻咽癌細(xì)胞中，Capn4通過(guò)活化核因子-κB增加MMP-2的表達(dá)，增加腫瘤細(xì)胞的侵襲遷移能力[9]。本研究結(jié)果表明，Calpeptin能降低MDA-MB-231細(xì)胞中MMP-2的表達(dá)。

總之，本研究發(fā)現(xiàn)，鈣蛋白酶抑制劑Calepetin對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞遷移具有明顯的抑制作用，其機(jī)制可能與其下調(diào)靶細(xì)胞內(nèi)MMP-2的表達(dá)有關(guān)。本研究為calpeptin抗腫瘤作用的開(kāi)發(fā)提供了理論基礎(chǔ)，也為以calpain為抗腫瘤治療靶點(diǎn)提供了思路。

[1]STORR SS,CARRAGHER NN,FRAME MM,etal.The calpain system and cancer[J].Nat Rev Cancer,2011,11(5):364.

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[3]LELOUP LL,WELLS AA.Calpains as potential anti-cancer targets[J].Expert Opin Ther Targets,2011,15(3):309.

[4]LUO WW,REN ZZ,GAO SS,etal.Clinical correlation of calpain-1 and glypican-3 expression with gallbladder carcinoma[J].Oncol Letters,2016,11(2):1345.

[5]PU XX,STORR SS,AHMAD NN,etal.Calpain-1 is associated with adverse relapse free survival in breast cancer:a confirmatory study[J].Histopathology,2016,68(7):1021.

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[9]ZHENG PP,CHEN XX,ZHU HH,etal.Capn4 is a marker of poor clinical outcomes and promotes nasopharyngeal carcinoma metastasis via nuclear factor-κB-induced matrix metalloproteinase 2 expression[J].Cancer Sci,2014,105(6):630.

(本文編輯劉璐)

Effect of calpain inhibitor Calpeptin on the migration of MDA-MB-231 breast cancer cells

ZHANG Meng-xiao,SUN Xiao-jin,ZHANG Zhi-rui,PAN Qiong,ZHAO Su-rong,LIU Hao

(DepartmentofPharmacy,BengbuMedicalCollege,AnhuiEngineeringTechnologyResearchCenterofBiochemicalPharmaceuticals,BengbuAnhui233030,China)

Objective:To investigate the effects of calpain inhibitor Calpeptin on the migration of MDA-MB-231 breast cancer cells for providing an idea in treating the metastatic breast cancer.Methods:The effects of different concentrations of Calpeptin on the proliferation of MDA-MB-231 cells were determined using MTT assay.The effects of different concentrations of Calpeptin on the migration of MDA-MB-231 cells were detected using the wound healing assay and transwell migration assay.The effects of different concentrations of Calpeptin on the expression of matrix metalloproteinase-2(MMP-2) in MDA-MB-231 cells were detected using Western blot.Results:Calpeptin could suppress the proliferation of MDA-MB-231 breast cancer cells,the inhibiting effects of which increased with the increasing of the concentrations of Calpeptin(P<0.01).The migration ability of MDA-MB-231 cells decreased significantly after 24 h of treatment with Calpeptin(P<0.01).The result of Western blot showed that Calpeptin could down-regulate the expression of MMP-2 in MDA-MB-231 cells.Conclusions:Calpeptin can inhibit the migration of MDA-MB-231 cells,the mechanism of which may involve in the down-regulation of MMP-2.

breast neoplasms;MDA-MB-231;cells calpain;Calpeptin;migration;matrix metalloproteinase-2

2016-05-21

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(81372899)；蚌埠醫(yī)學(xué)院自然科學(xué)基金項(xiàng)目(Byky1447)

單位] 蚌埠醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)系，安徽省生化藥物工程技術(shù)研究中心，安徽 蚌埠 233030

[作者簡(jiǎn)介] 張夢(mèng)曉(1988-)，女，碩士，助教.

劉浩，博士，碩士研究生導(dǎo)師，教授.E-mail:liuhao6886@foxmail.com

1000-2200(2016)07-0841-04

R 737.9

A

10.13898/j.cnki.issn.1000-2200.2016.07.001