楊　慧，張　余，陳旭義，趙長(zhǎng)余，武慧麗，邢　冉，趙永青△

(1.天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津 300073；2.武警后勤學(xué)院附屬醫(yī)院，天津 300162)

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三七總皂苷對(duì)脊髓損傷大鼠運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)的作用*

楊慧1，張余1，陳旭義2，趙長(zhǎng)余2，武慧麗2，邢冉1，趙永青2△

(1.天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津 300073；2.武警后勤學(xué)院附屬醫(yī)院，天津 300162)

目的：探討三七總皂苷對(duì)大鼠脊髓損傷(SCI)后運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)的作用。方法：正常SD大鼠隨機(jī)分為5組(n=8)：正常對(duì)照組(Normal)、假手術(shù)組(Sham)、脊髓損傷(SCI)和脊髓損傷+三七總皂苷組(PNS)(n=8)。所有大鼠分別在造模前及造模后第1、3、7、14、21和28天接受運(yùn)動(dòng)功能評(píng)分(BBB)和運(yùn)動(dòng)誘發(fā)電位(MEP)檢查，觀察大鼠后肢運(yùn)動(dòng)功能的恢復(fù)情況。結(jié)果：造模后，Sham組、PNS組、SCI組BBB評(píng)分低于正常；MEP波幅低于正常；潛伏期較正常延長(zhǎng)。PNS組與同期SCI組比較，第7、14、21、28天的BBB評(píng)分差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；第7天、14天、21天、28天，MEP檢查波幅(Amp)和潛伏期(Lat)組內(nèi)有顯著差異，并且與同期SCI組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論：三七總皂苷可促進(jìn)大鼠SCI后運(yùn)動(dòng)功能的恢復(fù)。

脊髓損傷；三七總皂苷；運(yùn)動(dòng)誘發(fā)電位；大鼠

脊髓損傷(spinal cord injuey,SCI)是一種以脊髓結(jié)構(gòu)破壞，功能細(xì)胞凋亡為主要表現(xiàn)的損傷，SCI的機(jī)制主要是脊髓血流減少，致脊髓缺血、缺氧，引起機(jī)體代謝紊亂；神經(jīng)元損失、軸突聯(lián)系的中斷，進(jìn)行性的脫髓鞘病變，目前臨床上尚未找出完全治愈SCI，恢復(fù)其結(jié)構(gòu)和功能的治療方法，一是由于中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system,CNS)損傷后其再生能力有限，二是對(duì)CNS損傷的再生和調(diào)控缺乏足夠的認(rèn)識(shí)[1]。并且SCI是一種具有較高致殘率的疾病，給社會(huì)和人們的日常生活帶來沉重的負(fù)擔(dān)。目前SCI治療仍是一個(gè)相當(dāng)棘手的問題，一直以來對(duì)SCI后運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)的研究是醫(yī)學(xué)界關(guān)注的熱點(diǎn)[2]。而近年來由于神經(jīng)生理學(xué)方面的研究取得了極大進(jìn)展，為SCI病情的評(píng)估、治療方案的選擇、治療后療效的判定及預(yù)后的評(píng)估提供了相對(duì)客觀的指標(biāo)。目前研究認(rèn)為三七總皂苷(panax notoginseng saponins,PNS)對(duì)SCI后的神經(jīng)功能的恢復(fù)有一定促進(jìn)作用，本文通過運(yùn)動(dòng)誘發(fā)電位檢測(cè)來觀察PNS對(duì)大鼠SCI后運(yùn)動(dòng)神經(jīng)功能的作用，為臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1主要儀器

手術(shù)顯微鏡(鎮(zhèn)江中天光學(xué)儀器有限公司)，顯微手術(shù)器械(奧斯卡醫(yī)療器械有限公司)，誘發(fā)電位儀(美國(guó)Nicolet公司)

1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、分組及給藥情況

取35只月齡3個(gè)月的清潔級(jí)雌性SD大鼠，體重200～250 g(由軍科院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)。19只大鼠建立T10節(jié)段的SCI模型，有16只建模成功，隨機(jī)分為2組(n=8)：脊髓損傷+三七總皂苷組(PNS)組，SCI組；另假手術(shù)組和正常組各8只。PNS組在傷后30 min腹腔注射PNS注射液20 mg/kg，隨后每天腹腔注射1次；SCI組、假手術(shù)組和正常組在傷后30 min腹腔注射生理鹽水20 mg/kg，每天1次，每次0.2 ml。

1.3動(dòng)物模型制備

實(shí)驗(yàn)大鼠手術(shù)前夜禁食不禁水。以5%的水合氯醛0.6 ml/100 g腹腔麻醉，背部手術(shù)區(qū)備皮，T10棘突的定位，常規(guī)消毒鋪巾，背部正中切口，剪開T9-T11皮膚及皮下組織，分離雙側(cè)棘突旁肌肉，撐開器將切口處撐開，此后操作在顯微鏡下進(jìn)行。彎鉗固定T10椎板，小號(hào)持針器咬除椎板至暴露出脊髓，剪開硬脊膜，利用虹膜刀橫斷脊髓，明膠海綿輕輕壓迫止血，分層縫合肌肉和皮膚。Sham組咬除棘突后，分層縫合肌肉皮膚。正常組不做處理。術(shù)后腹腔注射青霉素20萬單位，每日一次，連續(xù)3 d。

1.4BBB行為學(xué)評(píng)分[3]

造模前35只SD大鼠行BBB運(yùn)動(dòng)功能評(píng)分，造模后第1、3、7、14、21、28天分別對(duì)各組大鼠進(jìn)行BBB運(yùn)動(dòng)功能評(píng)分。分別把每只大鼠放置于平坦不滑，光線充足寬闊地面上，自由行走5 min，觀察后肢各關(guān)節(jié)的活動(dòng)狀況。兩名實(shí)驗(yàn)觀察者使用BBB行為學(xué)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)[3]分別對(duì)每只大鼠施行盲檢。0分為無任何肢體功能，21分為正常運(yùn)動(dòng)功能。

1.5運(yùn)動(dòng)誘發(fā)電位檢測(cè)

MEP檢測(cè)采用美國(guó)Nicolet公司產(chǎn)Viking Quest型電生理檢測(cè)系統(tǒng)。參考 Levy[4]等的方法，刺激電極為一對(duì)EEG針電極，置于大鼠左、右中央點(diǎn)前方，記錄電極置于雙下肢脛前肌，單個(gè)方波電脈沖刺激，刺激強(qiáng)度5～50 V,波寬0.2 ms。采用觸發(fā)(trigger)方式，不需疊加。每次測(cè)試至少重復(fù)刺激2次以獲得穩(wěn)定的波形。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2　結(jié)果

2.1BBB評(píng)分結(jié)果

術(shù)前所有動(dòng)物BBB運(yùn)動(dòng)功能評(píng)分均為21分。Sham組因牽拉、局部充血水腫致脊髓輕度損傷，術(shù)后即刻BBB評(píng)分略低于正常，隨時(shí)間延長(zhǎng)，BBB評(píng)分逐漸增高，至第14天BBB評(píng)分恢復(fù)至正常水平。PNS組和SCI組造模即刻，實(shí)驗(yàn)大鼠雙后肢全癱，BBB評(píng)分為0分；恢復(fù)期SCI組恢復(fù)較PNS組慢，PNS組3天后部分大鼠出現(xiàn)一個(gè)關(guān)節(jié)或兩個(gè)關(guān)節(jié)輕微運(yùn)動(dòng)，第7天3只大鼠出現(xiàn)兩個(gè)關(guān)節(jié)大幅運(yùn)動(dòng)，至第28天，后肢頻繁而持續(xù)的負(fù)重步行，無前后肢協(xié)調(diào)運(yùn)動(dòng)，未恢復(fù)至正常水平。SCI組3天后僅1只出現(xiàn)一個(gè)關(guān)節(jié)輕微運(yùn)動(dòng)；第7天1只大鼠出現(xiàn)兩個(gè)關(guān)節(jié)大幅運(yùn)動(dòng)，6只大鼠出現(xiàn)一個(gè)關(guān)節(jié)輕微運(yùn)動(dòng)；至第28天，后肢功能評(píng)分低于PNS組。第3、7、14、21和28天，隨時(shí)間延長(zhǎng)，PNS組BBB評(píng)分分值逐漸增高，與同期Sham組評(píng)分結(jié)果比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，第7、14、21和28天，PNS組與同期SCI組評(píng)分結(jié)果比較，評(píng)分結(jié)果上升幅度大，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05表1)。

Tab.1　BBB motor function score of rats in each group at different days after ±s，n=8)

SCI：Spinal cord injuey；PNS：Panax notoginseng saponins;BBB:Basso beattie bresnahan

*P<0.05 vs normal；#P<0.05 vs sham；△P<0.05 vs SCI

2.2運(yùn)動(dòng)誘發(fā)電位檢查結(jié)果

2.2.1運(yùn)動(dòng)誘發(fā)電位波幅(amplitude)結(jié)果術(shù)前所有大鼠運(yùn)動(dòng)誘發(fā)電位(motor evoked potentials,MEP波幅均在正常范圍內(nèi)，其中PNS組和SCI組損傷即刻，MEP波形消失；Sham組造模即刻MEP波幅略低于正常?；謴?fù)期各模型組大鼠與正常組相比，Sham組直至第14天MEP波幅恢復(fù)至正常水平。PNS組3 d后2只大鼠MEP波形出現(xiàn)，但波幅較低；第7天4只大鼠MEP波形出現(xiàn)，波幅較前略升高；至第28天，MEP波幅仍未恢復(fù)正常。SCI組3 d后1只大鼠MEP波形出現(xiàn)，但波幅極低；第7天2只大鼠MEP波形出現(xiàn)，波幅較前略升高，升高幅度較PNS組小；至第28天，MEP波幅仍未恢復(fù)正常，且低于同期PNS組。第7、14、21和28天，隨時(shí)間增長(zhǎng)，MEP波幅逐漸升高，PNS組與同期Sham組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；PNS組與同期SCI組比較，波幅上升幅度大(P<0.05,表2)。

Tab.2　Amplitude of MEP in different days after injury of rats(mv,±s，n=8)

SCI：Spinal cord injuey；PNS：Panax notoginseng saponins;MEP:Motor evoked potentials

*P<0.05 vs normal；#P<0.05 vs sham；△P<0.05 vs SCI

2.2.2MEP潛伏期結(jié)果術(shù)前所有大鼠MEP潛伏期均在正常范圍內(nèi)，其中PNS組和SCI組損傷即刻，MEP波形消失；Sham組造模即刻MEP潛伏期略長(zhǎng)于正常值范圍?；謴?fù)期各模型組大鼠與正常組相比，Sham組直至第14天MEP潛伏期恢復(fù)至正常范圍；PNS組3天后2只大鼠MEP波形出現(xiàn)，但潛伏期較長(zhǎng)，第7天4只大鼠MEP波形出現(xiàn)，潛伏期較前略縮短，至第28天，MEP潛伏期仍未恢復(fù)至正常范圍；SCI組3 d后1只大鼠MEP波形出現(xiàn)，但潛伏期較長(zhǎng)；第7天2只大鼠MEP波形出現(xiàn)，潛伏期較前略縮短，但縮短幅度較PNS組??；至第28天，MEP潛伏期仍未恢復(fù)正常，且長(zhǎng)于同期PNS組。第7、14、21和28天，隨時(shí)間增長(zhǎng)，MEP潛伏期逐漸縮短，PNS組與同期Sham組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；PNS組與同期SCI組比較，潛伏期縮短幅度大，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，表3)。

Tab.

SCI：Spinal cord injury；PNS：Panax notoginseng saponins;MEP：Motor evoked potentials

*P<0.05 vs normal；#P<0.05 vs sham；△P<0.05 vs SCI

3　討論

SCI僅靠臨床體檢及電子計(jì)算機(jī)X射線斷層掃描技術(shù)(Computed Tomography,CT)、核磁共振成像(magnetic resonance imaging,MRI)等檢查，有時(shí)難以準(zhǔn)確地判斷脊髓的神經(jīng)功能。MEP是一項(xiàng)能為臨床提供直接了解和評(píng)定脊髓神經(jīng)功能情況的輔助檢查方法。Gorodnichev等[5]研究結(jié)果顯示，MEP診斷SCI的準(zhǔn)確率為92.8%。國(guó)外學(xué)者[6]研究顯示2例臨床體檢為全癱患者，電生理檢查仍可記錄到MEP，由隨訪證實(shí)為不全癱。由此可見，MEP對(duì)SCI有較高的診斷價(jià)值。

SCI后脊髓功能喪失主要是由繼發(fā)性改變引起的。而在其急性期，通過減輕或消除繼發(fā)性病理反應(yīng)來保護(hù)殘存的神經(jīng)元不再遭受二次損傷，以期改善SCI的預(yù)后。這些繼發(fā)改變主要由創(chuàng)傷本身引起的原發(fā)性損傷和血管痙攣、循環(huán)血流下降、局部出血水腫及缺血引起的。針對(duì)SCI后的繼發(fā)性損害，目前三七是研究較多且認(rèn)為是潛力較大的有效中藥，是目前SCI藥物治療研究的重點(diǎn)和熱點(diǎn)。而三七總皂苷是從三七中提取的活性有效成份。皮賦等[7]通過研究發(fā)現(xiàn)，PNS在SCI早期有明顯的抗脂質(zhì)過氧化反應(yīng)和減輕繼發(fā)性損害作用，并且SCI后PNS能減輕局部組織的壞死，明顯減少灰質(zhì)區(qū)的空洞和白質(zhì)區(qū)的空囊變，并可見神經(jīng)元核周體和神經(jīng)纖維修復(fù)再生。研究顯示[8]，脊髓纖維中只要有不到5%的腹側(cè)白質(zhì)殘留，大鼠就可以有相當(dāng)明顯的后肢運(yùn)動(dòng)功能的恢復(fù)甚至恢復(fù)負(fù)重行走功能。本實(shí)驗(yàn)顯示，PNS組比SCI組MEP波幅升高，潛伏期縮短更明顯，由此可見，PNS能促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)。其可能機(jī)制為三七具有活血化淤，直接擴(kuò)張血管、抑制血小板凝集及清除自由基的作用，在一定程度上保證了損傷區(qū)脊髓的血流量，阻斷鈣離子內(nèi)流，改善了局部微循環(huán)，抑制血小板聚集及抗脂質(zhì)過氧化，進(jìn)而減輕了繼發(fā)性損害的惡性循環(huán)，從而保護(hù)神經(jīng)元的傳導(dǎo)功能。

MEP對(duì)大鼠SCI后運(yùn)動(dòng)功能的評(píng)估中顯示，MEP與運(yùn)動(dòng)功能間存在著很好地相關(guān)性。SCI后MEP的潛伏期和波幅均有敏感而準(zhǔn)確的改變，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及臨床研究結(jié)果均可顯示，運(yùn)動(dòng)功能的異?？偸前橛蠱EP波形的改變，如波幅的降低、潛伏期的延長(zhǎng)、甚至MEP波形完全消失等，故將MEP作為評(píng)價(jià)運(yùn)動(dòng)功能的一個(gè)重要指標(biāo)。對(duì)于運(yùn)動(dòng)功能受損者，MEP還可以作為預(yù)測(cè)以后運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)的一個(gè)指標(biāo)。本研究顯示，MEP波形的恢復(fù)可以先于運(yùn)動(dòng)功能的改善，對(duì)于SCI實(shí)驗(yàn)大鼠，如能早期記錄到MEP的恢復(fù)，將是其運(yùn)動(dòng)功能預(yù)后良好的一個(gè)標(biāo)志。實(shí)驗(yàn)期間，SCI組存在1只2周后MEP波形未出現(xiàn)的情況，后期運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)較差，MEP波形出現(xiàn)早，其運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)相對(duì)較好。MEP與BBB評(píng)分均可對(duì)SCI后大鼠運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)情況進(jìn)行檢測(cè)。其中MEP是對(duì)皮層和皮層以下的運(yùn)動(dòng)通路進(jìn)行檢測(cè)，其波幅的變化是運(yùn)動(dòng)系統(tǒng)功能改變的可靠且靈敏指標(biāo)[9]，MEP可較準(zhǔn)確的反應(yīng)SCI的病情變化，并能快速判斷從大腦中樞到肌肉整個(gè)運(yùn)動(dòng)系統(tǒng)的完整性；據(jù)研究報(bào)道，大鼠脊髓內(nèi)可能存在行走中樞模式發(fā)生器(CPG)，給予適當(dāng)?shù)拇碳ぜ纯杉ぐl(fā)其活動(dòng)，產(chǎn)生行走樣運(yùn)動(dòng)[10]。而BBB評(píng)分通過大鼠負(fù)重行走或前后左右協(xié)調(diào)運(yùn)動(dòng)，以對(duì)其后肢運(yùn)動(dòng)功能進(jìn)行評(píng)分，不能分辨損傷輕重及是否假損傷，受人的主觀因素影響較大，并且后肢運(yùn)動(dòng)有多少是自發(fā)恢復(fù)的，目前研究尚無法回答[11]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，SCI組第3天、7天MEP檢測(cè)較BBB評(píng)分敏感；MEP波幅和潛伏期的變化更能直接反應(yīng)SCI后運(yùn)動(dòng)功能的恢復(fù)程度。目前MEP已成為診斷脊髓損傷和評(píng)價(jià)脊髓功能的重要手段[12]。

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Effect of Panax NotoginSeng Saponins on motor evoked potentials of spinal cord injured rats with motion function

YANG Hui1,ZHANG Yu1,CHEN Xu-yi2,ZHAO Chang-yu2,WU Hui-li2,XING Ran1,ZHAO Yong-qing2△

(1.Tianjin University of Traditional Chinese Medicine，Tianjin 300073;2.The Affiliated Hospital of Logistics College of CAPF，Tianjin 300162,China)

Objective:To investigate the effect of Panax NotoginSeng Saponins(PNS)on functional recovery of rats with spinal cord injury(SCI)after exercise.Methods:SD normal rats were randomly divided into normal control group(Normal)and control group(Sham),spinal cord injury(SCI)and spinal cord injury(SCI)+ panax notoginseng saponins group(PNS)(n=8).All rats were given basso beattie bresnahan motor function score(BBB)and motor evoked potentials(MEP)examination to observe rat hind limb motor function recovery before operation and 1,3,7,14,21,28 days after operation.Results:After operation,the BBB scores of Sham group,PNS group,SCI group were lower than that of normal;MEP amplitude was lower than that of normal group;the incubation time was prolonged compared with that in normal group.In PNS group compared with that in the SCI group,BBB scores at 7,14,21 and 28 days was significantly different(P<0.05).There were significant differences in the latency(Lat)and amplitude(Amp)of MEP within PNA subgroups or between the PNS and the SCI groups at 7,14,21,28 days(P<0.05).Conclusion:PNS can promote the recovery of motor function after SCI in rats.

spinal cord injury;panax notoginseng saponins(Traditional Chinese Medicine);motor evoked potentials;rats

2015-04-14

2015-10-08

△Tel:15022484780；E-mail：yongqing650912@163.com

R3

A

1000-6834(2016)02-142-04

10.13459/j.cnki.cjap.2016.02.012