李　蕾

(淮北師范大學(xué)體育學(xué)院，安徽 淮北 235000)

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運(yùn)動對高脂飼料喂養(yǎng)大鼠骨骼肌和肝臟組織脂聯(lián)素-脂聯(lián)素受體-腺苷酸活化蛋白激酶通路的影響*

李蕾△

(淮北師范大學(xué)體育學(xué)院，安徽 淮北 235000)

目的：探討運(yùn)動影響高脂喂養(yǎng)大鼠骨骼肌和肝臟組織在腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)通路上的可能機(jī)制。方法：40只雄性SD大鼠隨機(jī)分為4組(n=10)：正常對照組(C組)：正常飲食不運(yùn)動；正常飲食運(yùn)動組(E組)：正常飲食同時進(jìn)行10周游泳運(yùn)動；高脂飲食對照組(H組)：高脂飼料喂養(yǎng)不運(yùn)動；高脂飲食運(yùn)動組(HE組)：高脂飼料喂養(yǎng)同時進(jìn)行10周游泳運(yùn)動。采用實(shí)時熒光定量PCR檢測大鼠骨骼肌和肝臟脂聯(lián)系受體1(AdipoR1)，AdipoR2 mRNA表達(dá)，Western blot檢測大鼠骨骼肌和肝臟腺苷酸活化蛋白激酶α(AMPKα)蛋白表達(dá)及磷酸化水平。結(jié)果：股四頭肌AdipoR1 mRNA、肝臟AdipoR2 mRNA表達(dá)在H組顯著低于C組(P<0.05)；HE組股四頭肌和肝臟AMPKα(Thr172)磷酸化水平顯著高于H組(P<0.05)，分別較H組高43.2%和51.1%。結(jié)論：高脂喂養(yǎng)導(dǎo)致大鼠骨骼肌和肝臟AdipoR1/R2 mRNA表達(dá)下調(diào)，運(yùn)動提高了大鼠骨骼肌和肝臟AMPKα(Thr172)磷酸化水平。

大鼠；脂聯(lián)素；運(yùn)動干預(yù)；脂聯(lián)素受體1/2；AMPK

脂聯(lián)素(adiponectin)是迄今為止發(fā)現(xiàn)的唯一一種在脂肪容積增大時分泌減少的蛋白[1]。其在肥胖、2型糖尿病(T2DM)患者及存在胰島素抵抗但未發(fā)生T2DM的一級親屬體內(nèi)下降，提高脂聯(lián)素水平可提高胰島素敏感性[2]。脂聯(lián)素受體(AdipoR)的克隆為研究脂聯(lián)素各種功能及作用機(jī)制提供了新的線索。在脂聯(lián)素受體介導(dǎo)的多條信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路研究進(jìn)展中發(fā)現(xiàn)，腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase,AMPK)是其中的關(guān)鍵。因此，Adiponectin-AdipoR-AMPK通路成為脂聯(lián)素發(fā)揮生物學(xué)作用的重要信號通路。有關(guān)運(yùn)動和膳食因素對不同組織脂聯(lián)素受體影響的研究較少，且結(jié)論不一[3]。本研究通過觀察運(yùn)動對高脂飼料喂養(yǎng)大鼠不同組織(骨骼肌和肝臟)Adipo RmRNA以及AMPKα蛋白表達(dá)及磷酸化水平的影響，以探討運(yùn)動影響高脂喂養(yǎng)大鼠骨骼肌和肝臟組織在AMPK通路上的可能機(jī)制。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動物及運(yùn)動干預(yù)

40只SPF級SD純系6周齡雄性大鼠，體重170～200 g。隨機(jī)分為4組(n=10)：對照組(C組)、正常飲食運(yùn)動組(E組)、高脂飲食對照組(H組)、高脂飲食運(yùn)動組(HE組)。適應(yīng)性喂養(yǎng)后，C組和E組維持正常飲食，H組和HE組改高脂飲食，E組和HE組同時開始無負(fù)重游泳訓(xùn)練。高脂飼料配方為基礎(chǔ)飼料基礎(chǔ)上增加15%豬油和2%的大豆粉，熱卡百分比為蛋白質(zhì)占23.5%，脂肪44.1%，碳水化合物32.4%，提供能量約408 kcal/100 g。訓(xùn)練方案參照Ploug 方法[4]。運(yùn)動持續(xù)時間從30 min/d逐漸過渡至90 min/d直至實(shí)驗(yàn)?zāi)?，每? d，共持續(xù)10周。

1.2方法

1.2.1取材待E組和HE組末次運(yùn)動結(jié)束48 h，全部大鼠禁食12 h，以2%戊巴比妥鈉40 mg/kg體重腹腔內(nèi)麻醉，大鼠仰臥固定，取肝臟和雙側(cè)股四頭肌。EP管分裝，投液氮，-80℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2大鼠骨骼肌AdipoR1 mRNA和肝臟AdipoR2 mRNA實(shí)時熒光定量PCR檢測取0.5 g肝臟組織，低溫粉碎，制備組織勻漿，離心取上清液分裝，-80℃冰箱凍存?zhèn)渖蠘?。采用SDS-PAGE電泳，灌膠，上樣，電泳，之后盡快使用Bio-Rad蛋白轉(zhuǎn)移裝置轉(zhuǎn)膜。將膜轉(zhuǎn)移至含有封閉液的平皿中，室溫下脫色搖床上搖動封閉1 h。將一抗(兔抗大鼠AMPKα單克隆抗體和兔抗大鼠AMPKαThr172磷酸化單克隆抗體)用TBST稀釋液稀釋(1∶2 000)，封閉液中取出膜，膜蛋白面朝下置于抗體液面上，37℃孵育1 h后4℃孵育過夜，TBST洗滌3次。培養(yǎng)皿內(nèi)加入10 ml二抗稀釋液TBST(1∶3 000)稀釋辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的二抗，搖床上室溫孵育1～2 h，TBST洗滌3次后，進(jìn)行化學(xué)發(fā)光反應(yīng)。X光膠片曝光，顯影，定影，自來水沖洗，室溫下晾干。掃描膠片保存，使用凝膠圖象處理系統(tǒng)(Totallab V2.01)進(jìn)行分析。磷酸化程度以磷酸化AMPKα的條帶灰度與總AMPKα條帶灰度的比值來計(jì)算。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2　結(jié)果

2.1大鼠骨骼肌AdipoR1、肝臟AdipoR2 mRNA表達(dá)的實(shí)時熒光定量PCR結(jié)果

大鼠骨骼肌AdipoR1 mRNA、肝臟AdipoR2 mRNA表達(dá)在H組顯著低于C組(P<0.05，表1)，其余組別無顯著性差異。

GroupAdipoR1mRNA(Skeletalmuscle)AdipoR2mRNA(Liver)C3.71±0.203.8±0.38E3.42±0.173.5±0.19H3.01±0.16*2.81±0.13*HE2.78±0.122.91±0.10

C：Control group；E：Normal dietary exercise group；H：High fat dietary control group；HE：High fat dietary exercise group；AdipoR：Adiponectin receptor

*P<0.05 vs C group

2.2大鼠骨骼肌AMPKα蛋白表達(dá)及磷酸化水平檢測結(jié)果

四組大鼠骨骼肌之間AMPKα蛋白表達(dá)沒有顯著性差異。HE組AMPKα(Thr172)磷酸化水平顯著高于H組(P<0.05)，較H組高43.2%；E組AMPKα(Thr172)磷酸化水平非常顯著性高于C組(P<0.01)，較C組高83.7%(圖1，表2)。

Fig.1Testing results of AMPKα protein expression and phosphorylation in rats skeletal muscle

GroupSkeletalmuscleLiver C0.32±0.030.42±0.04E1.97±0.10**0.53±0.04H0.47±0.030.38±0.02HE0.83±0.06#0.79±0.05#

C：Control group；E：Normal dietary exercise group；H：High fat dietary control group；HE：High fat dietary exercise group；AdipoR：Adiponectin receptor

**P<0.01 vs group C;#P<0.05 vs group H

2.3大鼠肝臟AMPKα蛋白表達(dá)及磷酸化水平檢測結(jié)果

四組大鼠肝臟組織之間AMPKα蛋白表達(dá)沒有顯著性差異。AMPKα(Thr172)磷酸化水平在HE組和H組間有顯著性差異，HE組顯著高于H組(P<0.05)，較H組高51.1%(圖2，表2)。

Fig.2Testing results of AMPKα protein expression and phosphorylation in rats liver

3　討論

脂聯(lián)素(adiponectin)主要由脂肪組織分泌，與體脂含量負(fù)相關(guān)，通過與脂聯(lián)素受體結(jié)合，發(fā)揮其抗炎、抗動脈粥樣硬化和胰島素增敏等作用。其分子量約30 kD，也被稱為脂肪補(bǔ)體相關(guān)蛋白30 kD(adipocyte complement-related protein of 30 kD,Acrp30)。研究表明，在調(diào)解糖、脂代謝中發(fā)揮更強(qiáng)生物學(xué)作用的并非含有244個氨基酸殘基的多肽-全長脂聯(lián)素，而是全長脂聯(lián)素經(jīng)過白細(xì)胞彈性蛋白酶裂解后產(chǎn)生的球形脂聯(lián)素。

脂聯(lián)素受體目前發(fā)現(xiàn)有3種，分別是2003年Yamauchi等發(fā)現(xiàn)的AdipoR1和AdipoR2，以及后續(xù)發(fā)現(xiàn)的T鈣黏素，但介導(dǎo)脂聯(lián)素生物學(xué)功能的受體主要是AdipoR1和AdipoR2。脂聯(lián)素受體在脂肪組織表達(dá)與脂肪分布、胰島素抵抗有關(guān)；在骨骼肌表達(dá)與血糖血脂代謝有關(guān)；在肝臟表達(dá)與胰島素敏感性有關(guān)。脂聯(lián)素受體在各器官組織分布的差異提示其存在不同的調(diào)節(jié)機(jī)制[5-7]。本實(shí)驗(yàn)未發(fā)現(xiàn)運(yùn)動對骨骼肌和肝臟AdipoR1/R2 mRNA水平產(chǎn)生顯著性影響。查閱文獻(xiàn)，運(yùn)動影響AdipoR的研究結(jié)果存在不確定結(jié)論。本實(shí)驗(yàn)可能與運(yùn)動干預(yù)持續(xù)時間有關(guān)；也有可能在運(yùn)動過程中誘導(dǎo)出某些抑制修正效應(yīng)；或者與運(yùn)動條件下脂肪細(xì)胞因子間可能的交互作用(如瘦素和脂聯(lián)素)有關(guān)[5]。

脂聯(lián)素的活性形式通常有全長型結(jié)構(gòu)域(fAcrp30)和球型結(jié)構(gòu)域(gAcrp30)兩種。前者幾乎全部存在于血漿中，主要在抑制肝臟糖異生和葡萄糖釋放中起作用；后者被認(rèn)為是實(shí)現(xiàn)脂聯(lián)素生物學(xué)效應(yīng)的主要區(qū)域。Tomas E等[8]用2.5 μg/ml的gAcrp30對趾長伸肌進(jìn)行預(yù)處理，以及給C57BL/6J小鼠在體注射gAcrp30兩個實(shí)驗(yàn)，均發(fā)現(xiàn)了AMPK磷酸化增強(qiáng)、乙酰輔酶A脫羧酶磷酸化和丙二酰輔酶濃度受到抑制的現(xiàn)象，提示gAcrp30與AICAR和運(yùn)動有相似的促進(jìn)糖脂代謝的作用，并且這種作用與AMPK激活有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)中，運(yùn)動顯著提高大鼠股四頭肌AMPKα(Thr172)磷酸化水平，提示運(yùn)動持續(xù)激活并提高了高脂喂養(yǎng)大鼠股四頭肌AMPKα的活性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果吻合Sriwijitkamol A等的研究[9,10]?？赡苤饕{(diào)節(jié)了ACC、MCA脫羧酶(MCD)、激素敏感性脂肪酶(HSL)等。結(jié)合前期對AdipoR1/2在骨骼肌和肝臟分布的實(shí)驗(yàn)[5]，提示運(yùn)動可能激活了高脂喂養(yǎng)大鼠骨骼肌gAcrp30-AdipoR1-AMPK通路。本實(shí)驗(yàn)中，運(yùn)動顯著提高大鼠肝臟AMPKα活性，提示運(yùn)動持續(xù)激活并提高了高脂喂養(yǎng)大鼠肝臟AMPKα的活性。由于全長的脂聯(lián)素受體主要在肝臟表達(dá)并激活肝臟AMPK，因此推測運(yùn)動可能激活了高脂喂養(yǎng)大鼠肝臟Acrp30-AdipoR2-AMPK通路。

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rat;adiponectin;exercise intervention;adiponectin R1/R2；AMPK

安徽高校優(yōu)秀青年人才基金重點(diǎn)項(xiàng)目(2013SQRL032ZD)；淮北市科技人才培育計(jì)劃(20140304)

2015-02-10

2015-10-10

△Tel：13909615572；E-mail：lisulei73@aliyun.com

G804.4;R285.5

A

1000-6834(2016)02-109-03

10.13459/j.cnki.cjap.2016.02.004