吉海龍，史鵬飛，周　潔，毛天明，羅永康，陳　茜，周開宇△

(1.溫州醫(yī)科大學附屬第一臨床學院，浙江 溫州 325000；2.浙江省臺州學院醫(yī)學院，臺州 318000；3.浙江省臺州市立醫(yī)院神經外科，臺州 318000；4.浙江省臺州市立醫(yī)院病理科，臺州 318000)

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脾源性酪氨酸激酶基因啟動子甲基化與髓母細胞瘤細胞侵襲轉移的關系*

吉海龍1，史鵬飛1，周潔2，毛天明3，羅永康3，陳茜4，周開宇1△

(1.溫州醫(yī)科大學附屬第一臨床學院，浙江 溫州 325000；2.浙江省臺州學院醫(yī)學院，臺州 318000；3.浙江省臺州市立醫(yī)院神經外科，臺州 318000；4.浙江省臺州市立醫(yī)院病理科，臺州 318000)

目的：探討甲基化轉移酶抑制劑5-氮雜-2-脫氧胞苷(5-aza-CdR)抑制脾源性酪氨酸激酶(Syk)基因啟動子的甲基化后對髓母細胞瘤Daoy細胞侵襲轉移能力的影響。方法：用甲基化轉移酶抑制劑5-aza-CdR處理體外培養(yǎng)的髓母細胞瘤Daoy細胞，通過甲基化特異性PCR(MSP)、Real time-PCR、Western blot及Transwell實驗方法分別檢測不同濃度5-aza-CdR處理后髓母細胞瘤Daoy細胞中脾源性酪氨酸激酶(Syk)基因啟動子區(qū)甲基化、mRNA表達、蛋白表達及細胞穿膜數(shù)的變化。結果：髓母細胞瘤Daoy細胞中Syk基因啟動子存在過甲基化，與對照組比較，經不同濃度5-aza-CdR處理后，其Syk基因啟動子區(qū)甲基化受到不同程度抑制，Syk mRNA的表達量最高上調(3.40±0.24)倍(P<0.01)；Syk蛋白的表達量最高上調(3.23±0.19)倍(P<0.01)；細胞侵襲及轉移能力降低(P<0.05)，差異有統(tǒng)計學意義。結論：髓母細胞瘤Daoy細胞中Syk基因啟動子甲基化導致其表達下調，可能是髓母細胞瘤發(fā)生轉移的機制之一；而甲基化轉移酶抑制劑5-aza-CdR可抑制其啟動子區(qū)的甲基化，使Syk的表達水平上調，抑制腫瘤細胞侵襲及轉移能力。

髓母細胞瘤；脾源性酪氨酸激酶(Syk)基因；甲基化；5-氮雜-2-脫氧胞苷；侵襲轉移

髓母細胞瘤(medulloblastoma,MB)是一種兒童最常見的顱內惡性腫瘤，其治療手段主要包括手術切除和術后放化療，隨著手術技巧與放化療策略的逐步改進，患者的5年生存率有所提高，但仍有相當一部分患者死于腫瘤的早期復發(fā)和轉移，而放化療所帶來的嚴重的認知障礙、生長發(fā)育遲滯、血液系統(tǒng)抑制及內分泌系統(tǒng)紊亂等后遺癥，使大部分存活者飽受折磨。近年來隨著對MB發(fā)生發(fā)展的分子生物學研究的深入，分子靶向治療引起人們的重視。相對傳統(tǒng)的術后放化療，分子靶向治療藥物毒性低，更有針對性，產生的后遺癥也較少。但面臨的首要問題是MB發(fā)病的分子機制尚未完全明確。WHO將MB分為Ⅵ級：經典型(classic medulloblastoma)、促纖維增生/結節(jié)型(desmoplastic/nodular medulloblastoma,D/N)、廣泛結節(jié)形成型(medulloblastoma with extensive nodularity,MBEN)、大細胞型(large cell medulloblastoma)和間變型(anaplastic medulloblastoma)，其中大細胞型和間變型預后最差，統(tǒng)稱為LC/A型。部分學者為更好的解釋患者預后差異，從基因與分子水平將MB進一步分為Wnt型、SHH型、Group 3和Group 4四種類型[1]。這四種類型在發(fā)病年齡、臨床表現(xiàn)、預后等方面都有明顯區(qū)別，相較傳統(tǒng)病理分型，新的分型可以更好的反映出了腫瘤的生物學行為和惡性程度，也為分子靶向治療藥物的尋找提供了更明確的方向。

脾源性酪氨酸激酶(spleen tyrosine kinase,Syk)是一種蛋白酪氨酸激酶，在適應性免疫受體信號途徑有重要的作用，還參與調節(jié)其他多種生物功能，包括細胞粘附、固有免疫識別、破骨細胞成熟、血小板激活及血管形成等[2]。自從Syk首次被發(fā)現(xiàn)與乳腺癌的侵襲性相關，具有抑癌作用后，Syk作為一個具有抑癌作用的蛋白酪氨酸激酶成為研究熱點?，F(xiàn)已有大量研究表明[2,3]，在多種惡性腫瘤中Syk基因都存在啟動子區(qū)的甲基化，導致其表達降低或缺失，從而影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展、惡性程度、侵襲轉移及預后等。而Syk與MB的發(fā)生發(fā)展及其生物學行為的關系尚不明確。本研究將探討Syk在MB中是否存在甲基化及其與MB侵襲轉移的關系。

1　材料與方法

1.1材料

髓母細胞瘤Daoy細胞購自美國ATCC公司；甲基化轉移酶抑制劑5-氮雜-2-脫氧胞苷(5-aza -2-deoxycytidine，5-aza-CdR)購自Sigma公司；RNA抽提試劑Trizol購自Invitrogen公司；兔抗人Syk單克隆抗體(D3Z1E)購自Cell Signaling公司；兔抗人GAPDH抗體購自杭州賢至生物科技有限公司；辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG二抗購自北京索來寶生物科技有限公司；胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基及PBS緩沖液購自Gibco公司；EZ DNA Methylation-GoldTMKit(D5005)購自ZYMO Research公司；2×Taq PCR MasterMix、SYBR Green實時熒光定量PCR試劑盒、cDNA第一鏈合成試劑盒及甲基化特異性PCR試劑盒均購自北京天根生化科技有限公司；DNA提取試劑盒購自凱基生物公司；Transwell小室(3422，孔徑8.0 μm，直徑6.5 mm)購自Corning公司；Matrigel Basement Membrane Matrix 購自美國BD公司。

1.2細胞培養(yǎng)與藥物處理

髓母細胞瘤Daoy細胞接種于含10%胎牛血清、1×105U/L青霉素及1×105U/L鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液中(pH7.2)，在37℃、含5%CO2濕潤空氣的恒溫密閉式培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細胞貼壁至80%～90%時，用胰蛋白酶消化后按5×104cells/ml每瓶接種于25 cm2的培養(yǎng)瓶中，待細胞完全貼壁后，用含有不同濃度的5-aza-CdR(0.1 μmol/L、1 μmol/L、10 μmol/L)的培養(yǎng)液給細胞換液，繼續(xù)培養(yǎng)72 h后收集細胞。

1.3DNA提取及MSP(甲基化特異性PCR)

以PBS漂洗細胞兩次后胰酶消化，將細胞混懸液轉移至離心管中離心收集細胞，按DNA提取試劑盒說明書，以離心吸附柱法提取細胞基因組DNA。按照EZ DNA Methylation-Gold KitTM試劑盒操作步驟對提取的DNA樣品進行處理，使未甲基化的的胞嘧啶轉化為胸腺嘧啶。簡述如下：取DNA樣品20 μl，加入130 μl CT Conversion Reagent，98℃加熱10 min，64℃處理2.5 h，轉移到一個Zymo-Spin IC管中，再加入600 μl M-Binding Buffer，10 000×g離心30 s；加100 μl M-Wash Buffer，12 000×g離心30 s；加入200 μl M-Desulphonation Buffer，室溫放置15～20 min；12 000×g離心30 s后加入200 μl M-Wash Buffer 12 000×g離心30 s,并重復一次；將10 μl M-Elution Buffer 直接加到吸附柱基質中并12 000×g離心30 s洗脫DNA。修飾后的DNA于-20℃保存。采用巢式PCR對甲基化和非甲基化序列進行擴增。巢式PCR反應各引物序列及反應條件參照Yuan[6]等文獻。反應結束后，取5 μl產物經2.5%瓊脂糖凝膠電泳、EB染色后在凝膠分析系統(tǒng)檢測并分析。

1.4RT-PCR

按Trizol試劑說明書操作提取經不同濃度5-aza-CdR處理后的細胞總RNA，并用紫外分光光度計測定其A260/A280，比值在1.8～2.1之間為符合純度要求。以瓊脂糖凝膠電泳檢測18 S和28 S以觀察其完整性。按cDNA第一鏈合成試劑盒說明書進行逆轉錄反應合成cDNA，反應體系20 μl：取各處理組細胞總RNA 2 μl，oligo(dT)15 2 μl，Super Pure dNTPs(2.5 mmol/L each)2 μl，RNase-Free ddH2O定容至14.5 μl，70℃加熱5 min后迅速冰上冷卻2 min，簡短離心后加入4 μl 5×First-Strand Buffer(含DTT)，0.5 μl Rnasin，加入1 μl(200U)TIANScript M-MLV，42℃溫浴50 min，95℃加熱5 min終止反應，置于冰上，用RNase-Free ddH2O將反應體系稀釋至50 μl。參照實時熒光定量PCR試劑盒說明書，分別加入2 μl上述cDNA溶液，2.5×RealMasterMix/20×SYBR Solution混合反應液9 μl，正反向引物(10 μmol/L)各0.5 μl，加ddH2O定容至20μl。置于美國Applied Biosystems公司的Step One Real-Time PCR 儀中進行反應。Real-time PCR以GAPDH基因為內參照。Syk引物序列為：F：5’-CATGTCAAGGATAAGAA-3’，R：5’-AGTTCACCACGTCATAGTAGTAATT-3’；GAPDH引物序列為：F：5’-CATCAGCAATGCCTCCTGCAC-3’，R：5’-TGAGTCCTTCCACGATACCAAAGTT-3’。結果用相對定量法(Comparative Delta-delta Ct)計算。

1.5Western blot

將不同濃度5-aza-CdR處理后的細胞分別用5 ml預冷的PBS液漂洗兩次后各加入250 μl預冷的RIPA裂解液，置于冰上20 min使其充分裂解細胞。將細胞裂解液轉移至1.5 ml EP管中，4℃，12 000 r/min離心5 min，取上清，用BCA法檢測蛋白濃度。于樣品中加入5×SDS凝膠電泳上樣緩沖液，100℃變性10 min。制作10%分離膠和5%濃縮膠的SDS-聚丙烯酰胺凝膠，按藥物濃度由低到高的順序加樣進行電泳分離，然后將蛋白轉移至PVDF膜上，5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，一抗4℃孵育過夜，二抗室溫孵育1 h，ECL發(fā)光液反應5 min，置于曝光儀中進行檢測。每個樣本重復3次。實驗以GAPDH蛋白表達水平作為內參照，利用圖像分析軟件對各條帶進行分析，以Syk蛋白條帶與GAPDH條帶的比值作為Syk蛋白的相對表達量。

1.6細胞體外侵襲實驗

Matrigel從-20℃取出，4℃解凍后置于冰上，以0℃預冷的無血清DMEM培養(yǎng)基將matrigel稀釋至50 mg/L，按每孔50 μl加入Transwell小室的上室，超凈臺內風干過夜。使用前每孔加入100 μl含1%BSA的無血清DMEM培養(yǎng)液，37℃靜置1 h后吸去小室內液體備用。將經0.1 μmol/L、1 μmol/L、10 μmol/L的5-aza-CdR處理72 h的Daoy細胞制成3.0×105cells/ml的細胞懸液，每孔200 μl加入Transwell小室的上室，下室加入500 μl含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液。置于細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后，將Transwell小室取出，以90%乙醇固定15 min，0.1%結晶紫染色5 min，自來水漂洗5 min,然后用棉簽將小室濾膜上室面的細胞及Matrigel小心拭去，將小室置于33%醋酸溶液中洗滌10 min以脫色，取洗脫液于紫外分光光度計測570 nm處吸光度值，實驗重復3次，取平均值。

1.7細胞體外遷移實驗

實驗中Transwell小室的上室面無Matrigel包被，穿膜時間設定為12 h，其余操作與細胞侵襲實驗相同。

1.8統(tǒng)計學分析

2　結果

2.1Syk基因啟動子區(qū)甲基化情況

甲基化特異性PCR產物電泳檢測發(fā)現(xiàn)，髓母細胞瘤Daoy細胞Syk基因啟動子區(qū)存在甲基化，經甲基化轉移酶抑制劑5-aza-CdR處理后，Syk基因的甲基化被抑制(圖1)。

Fig.1MSP was carried out to detect Syk gene promotor methylation status of Daoy cell line

MSP:Methylation specific PCR;ME:Methylated;UM:Unmethylated;M:DL2000 Marker;1-3:Drug groups;4-6:Control groups

2.25-aza-CdR對髓母細胞瘤Daoy細胞中Syk mRNA表達的影響

髓母細胞瘤Daoy細胞經不同濃度的5-aza-CdR處理不同時間后，分別提取各組細胞總RNA，合成cDNA后進行Real-time PCR，結果用相對定量法2-ΔΔCt計算，未經藥物處理的細胞Syk表達量按100%計算。Real-time PCR結果顯示(表1)，與對照組相比，藥物組的mRNA表達量明顯增加，且該作用具有時間-濃度依賴性。

2.35-aza-CdR對髓母細胞瘤Daoy細胞中Syk蛋白表達的影響

未經藥物處理的細胞作為對照組，經不同濃度藥物處理后的細胞作為處理組，GAPDH蛋白量作為內參照。Western blot檢測結果見圖2。軟件分析結果顯示，與對照組比較，經濃度分別為0.1 μmol/L、1 μmol/L和10 μmol/L的5-aza-2-CdR處理72 h后，Syk蛋白相對表達量分別為1.97±0.15(P<0.05)、2.37±0.24(P<0.01)和3.23±0.19(P<0.01)。

Tab.

RT-PCR was carried out to determine the relative expression of Syk mRNA after treatment with different concentration of 5-aza-2-CdR(0.1 μmol/L,1 μmol/L and 10 μmol/L)for 24 h,48 h and 72 h.mRNA of GAPDH was used as internal control

RT-PCR:Real-time PCR

**P<0.01 vs control;#P<0.05,##P<0.01 vs 24 h;△P<0.05 vs 48 h

Fig.2Western blot analysis of Syk expression in Daoy cell line using the anti-sykmAb GAPDH was used as internal control

2.45-aza-CdR對髓母細胞瘤Daoy細胞侵襲和遷移能力的影響

Transwell侵襲和遷移是以穿過人工基底膜和聚酯碳酸膜的細胞數(shù)量表示細胞侵襲和運動能力的大小。實驗結果表明，與對照組相比，經不同濃度5-aza-2-CdR處理72 h的細胞，其侵襲和遷移能力均降低，且呈現(xiàn)一定的濃度依賴性(表2)。

5-aza-2-CdRAvalueofinvasionAvalueofmigrationControl0.376±0.0150.493±0.0140.1μmol/L0.359±0.0130.474±0.0181.0μmol/L0.238±0.018*0.324±0.021*10μmol/L0.143±0.021**0.220±0.017**

*P<0.05,**P<0.01 vs control

3　討論

表觀遺傳學改變與腫瘤發(fā)生和發(fā)展密切相關，這些改變包括抑癌基因的過甲基化、原癌基因的低甲基化以及基因印記丟失等。DNA的甲基化一直是表觀遺傳學研究的一個熱點，其在功能上與DNA突變一樣可導致基因功能缺失，但兩者的不同在于，DNA的甲基化修飾是可以被抑制的，如果能夠抑制其甲基化，那么原本因甲基化而沉默的基因將會重新表達。而5-aza-CdR作為一種甲基化轉移酶抑制劑，是第一個被美國FDA批準用于治療惡性腫瘤的去甲基化藥物，主要用于骨髓增生異常綜合征的治療[4]。一項體外實驗[5]顯示5-aza-CdR聯(lián)合DZNep、TSA共同作用于人AML細胞后表現(xiàn)出了明顯的協(xié)同抗腫瘤的作用。這些都表明5-aza-CdR作為臨床抗腫瘤藥物有著較好的應用前景。

Syk是一種非受體型酪氨酸蛋白激酶，最初被認為是造血細胞特有的信號分子，并且在淋巴細胞成熟和免疫細胞活化中起著重要作用[2]。而隨后的研究表明，Syk與多種腫瘤的增殖、轉移及患者的預后都有密切關系[3]，從而引起國內外的廣泛關注。Sada[6]等研究發(fā)現(xiàn)，Syk的表達缺失會導致免疫細胞發(fā)育、成熟障礙，從而引起機體免疫監(jiān)測功能下降，對突變或異常增生的細胞失去免疫力，最終導致腫瘤的發(fā)生。Yuan[7]等研究發(fā)現(xiàn)，乳腺癌中Syk基因啟動子區(qū)5’端CpG島的甲基化是其表達沉默的重要機制之一，而甲基化轉移酶抑制劑5-aza-2-CdR可以使其重新表達。多項研究發(fā)現(xiàn)，Syk在多種惡性腫瘤中都發(fā)揮著抑癌基因的作用。如在結直腸癌[8]、非小細胞肺癌[9]及胰腺癌[10]中,Syk抑制腫瘤侵襲轉移且與患者預后和生存率呈正相關性。

本研究以髓母細胞瘤Daoy細胞為研究對象，旨在探討Syk在髓母細胞瘤中是否存在過甲基化現(xiàn)象及其與髓母細胞瘤侵襲轉移的關系。結果發(fā)現(xiàn)，Syk基因在髓母細胞瘤Daoy細胞中存在啟動子區(qū)的過甲基化，導致其表達水平明顯降低。用甲基化轉移酶抑制劑5-aza-2-CdR處理細胞后，Syk在mRNA和蛋白水平的表達均顯著增加(P<0.01)；同時，髓母細胞瘤Daoy細胞的侵襲及遷移能力則明顯降低(P<0.05)。實驗結果表明Syk對髓母細胞瘤Daoy細胞的侵襲及遷移能力有明顯的抑制作用，其作用的IC50值分別為7.7 μmol/L與8.5 μmol/L。Syk基因啟動子甲基化導致其表達下調可能在髓母細胞瘤發(fā)生侵襲轉移的分子機制中起著一定的作用。

Carter[11]等研究認為，Syk是一個與癌基因HER2/neu的功能相反的抑癌基因，Syk通過抑制HER2/neu基因的收縮血管內皮細胞的作用，來抑制腫瘤細胞的轉移。Layton[10]等研究發(fā)現(xiàn)，胰腺癌中Syk表達缺失會導致CD171的表達上調，而CD171可以誘導侵襲轉移相關基因的表達，并且能增強體外培養(yǎng)細胞的侵襲和遷移能力。他們推測因Syk表達缺失而導致基因表達的“鏈式變化”，最終引起了腫瘤表型變化。張[12]等研究表明，5-aza-2-CdR可降低全基因組甲基化水平，這意味著原本由于甲基化而表達受抑制的某些癌基因也會因此而重新表達，因此如何尋找更具針對性的去甲基化藥物也是一個尚待解決的難題。目前為止，Syk基因的的具體作用及其所涉及的信號通路仍不清楚。Syk基因的表達缺失是多因素的，甲基化只是其機制之一，而且究竟是甲基化的發(fā)生促進了腫瘤的發(fā)生發(fā)展，還是腫瘤的形成引發(fā)了甲基化，這些問題都需要繼續(xù)深入的研究來解決。

本研究表明，在體外細胞水平，Syk在髓母細胞瘤Daoy細胞中發(fā)揮著一定的抑癌基因的作用，主要表現(xiàn)為抑制腫瘤細胞的侵襲性生長及遠處轉移，而在臨床實體腫瘤的發(fā)生與發(fā)展中是否存在Syk基因啟動子的過甲基化和表達水平下調，及其作用如何，需進一步研究以明確。

[1]Taylor MD,Northcott PA,Korshunov A,et al.Molecular subgroups of medulloblastoma:the current consensus[J].Acta Neuropathol,2012,123(4):465-472.

[2]Mócsai A,Ruland J,Tybulewicz VL.The SYK tyrosine kinase:a crucial player in diverse biological functions[J].Nat Rev Immunol,2010,10(6):387-402.

[3]Coopman PJ,Mueller SC.The Syk tyrosine kinase:a new negative regulator in tumor growth and progression[J].Cancer Lett,2006,241(2):159-173.

[4]Momparler RL,C?té S,Momparler LF,et al.Epigenetic therapy of acute myeloid leukemia using 5-aza-2'-deoxycytidine(decitabine)in combination with inhibitors of histone methylation and deacetylation[J].Clin Epigenetics,2014,6(1):19.

[5]Issa JP,Kantarjian HM,Kirkpatrick P.Azacitidine[J].Nat Rev Drug Discov,2005,4(4):275-276.

[6]Sada K,Takano T,Yanagi S,et al．Structure and function of Syk protein-tyrosine kinase[J].J Biochem,2001,130(2):177-186．

[7]Yuan Y,Mendez R,Sahin A,et al.Hypermethylation leads to silencing of the Syk gene in human breast cancer[J].Cancer Res,2001,61(14):5558-5561.

[8]Yang Z,Huo L,Chen H,et al.Hypermethylation and prognostic implication of Syk gene in human colorectal cancer[J].Med Oncol,2013,30(2):586-588.

[9]Peng C,Sun Q,Hao Y,et al.Syk is low-expressed in non-small-cell lung cancer and inversely correlates with patient's survival[J].Acta Biochim Biophys Sin,2013,45(2):149-151.

[10]Layton T,Stalens C,Gunderson F,et al.Syk tyrosine kinase acts as a pancreatic adenocarcinoma tumor suppressor by regulating cellular growth andinvasion[J].Am J Pathol,2009,175(6):2625-2636.

[11]Carter WB,Hoying JB,Boswell C,et al.HER2/neu over expression induces endothelial cell retraction[J].Int J Cancer,2001,91(3):295-299．

[12]張楹恬,田衛(wèi)平,梅玫.miR-21與DNA甲基化在不同乳腺癌細胞中的相互作用[J].中國應用生理學雜志,2015,31(3):220-224.

The relationship between hypermethylation of Syk gene promoter and medulloblastoma cell invasion and metastasis

JI Hai-long1,SHI Peng-fei1,ZHOU Jie2,MAO Tian-ming3,LUO Yong-kang3,CHEN Xi4,ZHOU Kai-yu1△

(1.The First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University,Wenzhou 325000;2.Taizhou University Medical School,Taizhou 318000; 3.Department of Neurosurgery,Zhejiang Taizhou Municipal Hospital,Taizhou 318000; 4.Department of Pathology,Zhejiang Taizhou Municipal Hospital,Taizhou 318000,China)

Objective:To investigate the effect of demethylation of Syk gene promoter by the methylation transferase inhibitor 5-aza-CdR on the invasion and metastasis of medulloblastoma cell line Daoy.Methods:Medulloblastoma cell line Daoy was treated with 5-aza-CdR in vitro.Methylation-specific PCR,real time-PCR and Western blot were used to detect Syk gene promoter methylation status,Syk mRNA and protein expression respectively.Transwell was employed to study the invasion and metastasis of medulloblastoma cell line Daoyby counting the cells that had invaded through Matrigel and migrated to the undersurface of the membrane before and after treatment of 5-aza-CdR.Results:In comparison to control group,Syk gene promoter of 5-aza-CdR-treated groups was demethylated and expression of Syk mRNA and protein was significantly up-regulated by 3.40±0.24 folds(P<0.01)and 3.23±0.19 folds(P<0.01)respectively.The invasiveness and metastasis of medulloblastoma cell line Daoy was decreased(P<0.05).Conclusion:Hypermethylation of Syk gene promoter is responsible for the down-regulation of Syk gene expression in medulloblastoma cell line Daoy,which may be one of the mechanisms that enhanced cell invasion and metastasis.While 5-aza-CdR can reverse the hypermethylation of Syk gene promoter and restore Syk gene expression and thus suppresses invasiveness and metastasis of tumor cells.

medulloblastoma;Syk gene;methylation;5-aza-CdR;invasion and metastasis

臺州市科技局科技計劃資助項目(14SF05)；浙江省中醫(yī)藥管理局科技計劃資助項目(2013ZA133,2015ZB133)

2015-11-02

2015-12-09

△Tel：13957680507；E-mail：kerry2000year@163.com

R-3

A

1000-6834(2016)02-132-05

10.13459/j.cnki.cjap.2016.02.010