胡文婕,　郭丹丹,　梁　宇,　景　嵐

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院, 呼和浩特　010019)

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向日葵銹菌夏孢子萌發(fā)條件的研究

胡文婕,郭丹丹,梁宇,景嵐*

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院, 呼和浩特010019)

以向日葵銹菌330生理小種為材料,研究了夏孢子萌發(fā)的適宜條件和培養(yǎng)載體。向日葵銹菌夏孢子萌發(fā)適宜溫度范圍10～25℃,最適溫度15℃。15℃下在瓊脂薄膜上1 h即可萌發(fā),12 h達(dá)到萌發(fā)高峰,萌發(fā)率最高可達(dá)97%。孢子在無(wú)菌水中萌發(fā)最適濃度為20 mg/L,萌發(fā)率隨濃度增大而降低。光照在前5 h均抑制夏孢子萌發(fā),但7 h后光照對(duì)夏孢子總萌發(fā)率基本無(wú)影響。新鮮夏孢子萌發(fā)率較高,在室溫放置270 d后基本喪失萌發(fā)能力。最適條件下,在供試的6種不同萌發(fā)載體上,夏孢子萌發(fā)率、芽管長(zhǎng)度及萌發(fā)形態(tài)顯著不同,瓊脂薄膜載玻片、尼龍紗網(wǎng)、玻璃紙較適宜夏孢子萌發(fā),萌發(fā)率超過(guò)90%;在PVDF膜和親水濾膜上可觀測(cè)到芽管內(nèi)部黃色物質(zhì)轉(zhuǎn)移和特殊結(jié)構(gòu)的形成。

向日葵銹菌;夏孢子;萌發(fā)條件;萌發(fā)率

向日葵銹菌(Pucciniahelianthi)引起的向日葵銹病是向日葵生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中常見(jiàn)的真菌性病害,1822年美國(guó)科學(xué)家Schweinitz首次描述了向日葵銹菌[1]。近年來(lái),隨著向日葵種植面積的擴(kuò)大以及連年種植,致病力更強(qiáng)的小種的出現(xiàn)和發(fā)展[24]致使向日葵銹病流行的潛在威脅和涉及范圍不斷增加,從而嚴(yán)重威脅向日葵的生產(chǎn)。銹菌長(zhǎng)期以來(lái)受到高度重視的主要原因,一方面是其給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和國(guó)民經(jīng)濟(jì)帶來(lái)巨大的損失,另一方面是銹菌具有其獨(dú)特的生物學(xué)特性,具有很高的研究?jī)r(jià)值[5]。夏孢子作為銹菌的主要無(wú)性孢子形態(tài),是銹菌唯一能不斷重復(fù)發(fā)生的階段,不需要經(jīng)過(guò)休眠就能萌發(fā),落到新寄主上24 h內(nèi)即可萌發(fā)產(chǎn)生芽管變成雙核菌絲,雙核菌絲在幾天內(nèi)就可以形成新的夏孢子堆,對(duì)銹病的大規(guī)模暴發(fā)起著決定性作用。目前,銹菌夏孢子萌發(fā)相關(guān)研究較多,如小麥條銹菌(Pucciniastriiformisf.sp.tritici)[67]、松楊柵銹菌(Melampsoralarici-populina)[8]、苜蓿銹菌(Uromycesstriatus)[9]等,但是關(guān)于向日葵銹菌夏孢子萌發(fā)條件,僅1970年Hennessy等[10]有過(guò)簡(jiǎn)單報(bào)道。本研究采用超聲波水霧法[6],對(duì)向日葵銹菌夏孢子進(jìn)行萌發(fā)試驗(yàn),以探明影響向日葵銹菌夏孢子萌發(fā)的主要因素,并研究了不同載體對(duì)向日葵銹菌萌發(fā)率和芽管形態(tài)的影響,旨在通過(guò)對(duì)向日葵銹菌夏孢子人工萌發(fā)條件的研究,掌握適宜于其他研究目的的試驗(yàn)基礎(chǔ)條件,為進(jìn)一步研究夏孢子對(duì)寄主侵染和致病機(jī)制提供參考依據(jù)。

1　材料與方法

1.1供試菌株

供試向日葵銹菌(PucciniahelianthiSchw.)330生理小種由內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)植病研究室提供。在感病品種‘黑大片’上進(jìn)行隔離繁殖,收集新鮮銹菌夏孢子進(jìn)行萌發(fā)試驗(yàn)。

1.2試驗(yàn)方法

將1%的瓊脂培養(yǎng)基融化后用移液槍取500 μL于親水載玻片上制成瓊脂薄膜,用雙層紗網(wǎng)將少量夏孢子均勻抖落于瓊脂薄膜上,將載玻片置于保鮮盒中的玻璃彎管上,同時(shí)在保鮮盒底部加少量無(wú)菌水,用超聲波加濕器使保鮮盒內(nèi)處于水霧飽和,然后加蓋密閉培養(yǎng)。(以下試驗(yàn)如無(wú)特別說(shuō)明,均采用此方法。)

1.2.1溫度對(duì)夏孢子萌發(fā)的影響

在黑暗條件下培養(yǎng)溫度分別設(shè)置為-20、0、5、10、15、20、25、30、35、40℃,分別在2、4、8、12 h時(shí)統(tǒng)計(jì)各處理下新鮮夏孢子的萌發(fā)率。

1.2.2光照對(duì)夏孢子萌發(fā)的影響

將光照環(huán)境設(shè)置為全黑暗和全光照(2 400 lx)2種,置于15℃恒溫培養(yǎng)8 h,每小時(shí)觀察一次,統(tǒng)計(jì)各時(shí)間段夏孢子萌發(fā)率。

1.2.3存放時(shí)間對(duì)夏孢子萌發(fā)的影響

收集病葉上新鮮夏孢子,分別在20℃環(huán)境下干燥處理后密封離心管中并分別存放1、30、90、150、210、270 d,然后對(duì)夏孢子進(jìn)行萌發(fā)處理,置于黑暗條件下15℃恒溫培養(yǎng),分別于4、8、12、24 h觀察并統(tǒng)計(jì)夏孢子萌發(fā)率。

1.2.4孢子濃度對(duì)夏孢子萌發(fā)的影響

將200 mL無(wú)菌水倒入30 cm×45 cm的盤(pán)中,再將稱(chēng)量好的新鮮夏孢子均勻抖落于水面,使最終濃度為20、30、40、50 mg/L,置于黑暗條件下15℃恒溫培養(yǎng)。分別于2、4、8、12 h觀察并統(tǒng)計(jì)夏孢子萌發(fā)率。

1.2.5不同培養(yǎng)載體對(duì)夏孢子萌發(fā)的影響

采用親水載玻片、瓊脂薄膜載玻片、PVDF膜(polyvinylidene fluoride film, 0.45 μm孔徑)、親水濾膜(0.45 μm孔徑)、玻璃紙(cellophane paper)、尼龍紗網(wǎng)(250 μm孔徑)6種不同載體。將玻璃紙和尼龍紗網(wǎng)濕潤(rùn)后置于親水載玻片上,親水濾膜和PVDF膜安放在鋪有水飽和濾紙的親水載玻片上,用瓊脂培養(yǎng)基在親水載玻片上制成薄膜,并用親水載玻片作為參照進(jìn)行萌發(fā)試驗(yàn),分別于2、4、8 h觀測(cè)萌發(fā)率和芽管長(zhǎng)度,親水濾膜和PVDF膜采用側(cè)光照射,儀器型號(hào)為OLYMPLUS SZX16。

1.3統(tǒng)計(jì)與分析

以芽管長(zhǎng)度大于孢子直徑的1/2以上作為夏孢子萌發(fā)標(biāo)準(zhǔn)[11]。在普通光學(xué)顯微鏡下觀察夏孢子的萌發(fā)情況。每個(gè)處理3個(gè)重復(fù),每個(gè)重復(fù)取不同視野觀察不少于300個(gè)孢子。統(tǒng)計(jì)鏡檢總孢子數(shù)和萌發(fā)的孢子數(shù),計(jì)算夏孢子萌發(fā)率,運(yùn)用Microsoft Excel和SPSS軟件對(duì)各處理進(jìn)行差異顯著性分析。

2　結(jié)果與分析

2.1培養(yǎng)溫度對(duì)夏孢子萌發(fā)的影響

試驗(yàn)結(jié)果(圖1)表明,在供試溫度范圍內(nèi),夏孢子在-20℃和40℃時(shí)未見(jiàn)萌發(fā),其余0～35℃環(huán)境下均可萌發(fā),其中適宜萌發(fā)溫度為10～25℃,夏孢子在最適溫度15℃時(shí)2 h萌發(fā)率可達(dá)到51.5%,至4～8 h達(dá)到萌發(fā)高峰,12 h萌發(fā)率達(dá)97%。當(dāng)溫度低于5℃或高于30℃時(shí),夏孢子萌發(fā)率顯著降低,在35℃時(shí)只有極少量萌發(fā)。適宜的溫度條件下,培養(yǎng)時(shí)間越長(zhǎng),孢子萌發(fā)率越高。

2.2光照對(duì)夏孢子萌發(fā)的影響

如圖2所示,夏孢子在黑暗條件下處理1 h萌發(fā)率便可達(dá)33%,顯著高于光照條件下處理1 h 的萌發(fā)率(14%)。在夏孢子萌發(fā)初期,黑暗條件明顯促進(jìn)孢子萌發(fā),在1～5 h萌發(fā)率存在顯著差異,培養(yǎng)至6 h后萌發(fā)率無(wú)顯著差異,8 h均可達(dá)到95%左右。

2.3存放時(shí)間對(duì)夏孢子萌發(fā)的影響

研究結(jié)果顯示,新鮮夏孢子在培養(yǎng)24 h時(shí)萌發(fā)率為97%,顯著高于室溫干燥條件下存放的孢子萌發(fā)率。夏孢子在20℃,干燥條件下存放30、90、150、210、270 d后的24 h的萌發(fā)率分別為77%、24%、18%和7%,存放270 d后的夏孢子萌發(fā)率僅為3%,基本喪失萌發(fā)能力,說(shuō)明夏孢子萌發(fā)率隨著存放時(shí)間的增長(zhǎng)而明顯降低。

圖1　溫度對(duì)向日葵銹菌夏孢子萌發(fā)的影響Fig.1　Effects of temperature on the germination of urediniospores of Puccinia helianthi

圖2　光照對(duì)向日葵銹菌夏孢子萌發(fā)的影響Fig.2　Effects of light on the germination of urediniospores of Puccinia helianthi

圖4　孢子濃度對(duì)向日葵銹菌夏孢子萌發(fā)的影響Fig.4　Effects of spore concentration on the germination of urediniospores of Puccinia helianthi

2.4孢子濃度對(duì)夏孢子萌發(fā)的影響

由圖4可以看出,在與空氣接觸面積一致條件下,使用水培法使夏孢子萌發(fā),不同孢子濃度對(duì)夏孢子萌發(fā)影響很大,當(dāng)孢子濃度為20 mg/L時(shí)萌發(fā)率最高,12 h時(shí)可達(dá)到93%,隨著孢子濃度的增大,孢子萌發(fā)率呈下降趨勢(shì),當(dāng)孢子濃度為50 mg/L時(shí),12 h時(shí)萌發(fā)率僅為37%。

2.5不同培養(yǎng)載體對(duì)夏孢子萌發(fā)的影響

表1數(shù)據(jù)顯示,在不同培養(yǎng)載體上夏孢子萌發(fā)率存在顯著差異。供試的6種培養(yǎng)載體中,瓊脂薄膜最適合孢子的萌發(fā),培養(yǎng)8 h后萌發(fā)率可達(dá)93.5%,明顯高于其他載體。其次是尼龍紗網(wǎng)和玻璃紙,分別達(dá)到88.75%和86.13%,而孢子在PVDF膜、親水濾膜和親水載玻片上萌發(fā)率基本無(wú)差異,均在46%左右。

從芽管長(zhǎng)度來(lái)看(表2),培養(yǎng)2 h后,瓊脂薄膜上夏孢子萌發(fā)芽管最長(zhǎng),載玻片上的最短;PVDF膜、親水濾膜、玻璃紙及尼龍紗網(wǎng)上的芽管長(zhǎng)度沒(méi)有顯著差異,8 h時(shí)夏孢子芽管在瓊脂薄膜上平均長(zhǎng)度為473.85 μm,明顯高于其他載體,然后依次為是尼龍紗網(wǎng)、玻璃紙、親水濾膜。而親水載玻片和PVDF膜上芽管生長(zhǎng)與其他載體相比較慢,8 h時(shí)平均長(zhǎng)度分別為178.90 μm和168.16 μm。

表1　不同培養(yǎng)載體上向日葵銹菌夏孢子萌發(fā)率1)

1) 同列數(shù)據(jù)后不同小寫(xiě)字母表示差異顯著(P<0.05)。下同。

Different lowercase letters in the same column indicate significant difference (P<0.05). The same below.

表2　不同培養(yǎng)載體上向日葵銹菌夏孢子萌發(fā)芽管長(zhǎng)度

觀察不同載體上孢子萌發(fā)形態(tài),在瓊脂薄膜載玻片(圖5a)上可以清晰地看到夏孢子芽管伸長(zhǎng)和移動(dòng),芽管在瓊脂中伸長(zhǎng)沒(méi)有方向性;尼龍紗網(wǎng)(圖5b)上孢子萌發(fā)芽管較其他載體更為順直;在親水載玻片(圖5c)上可以觀察到夏孢子萌發(fā)時(shí)孢子內(nèi)部物質(zhì)隨芽管伸長(zhǎng)在芽管內(nèi)部顆粒狀不均勻分布。夏孢子在玻璃紙(圖5d)上萌發(fā)芽管清晰且萌發(fā)程度較為一致。使用側(cè)光照射親水濾膜(圖5e)可以觀察到孢子鮮黃色且有光澤,芽管伸長(zhǎng)時(shí)有黃色物質(zhì)從孢子內(nèi)流入芽管,而在PVDF膜(圖5f)上萌發(fā)后可觀察到芽管尾部膨大,黃色物質(zhì)隨芽管伸長(zhǎng)流入尾部膨大處,呈鮮黃色水滴狀,其他載體均未發(fā)現(xiàn)此現(xiàn)象。

圖5　不同培養(yǎng)載體上向日葵銹菌萌發(fā)夏孢子形態(tài)Fig.5　Forms of germinated urediniospores of Puccinia helianthi on different culture substrates

3　結(jié)論與討論

夏孢子反復(fù)侵染是向日葵銹病大規(guī)模發(fā)生的主要原因,研究銹病首先必須明確夏孢子的萌發(fā)因素及受環(huán)境影響的程度。國(guó)內(nèi)外對(duì)向日葵銹菌夏孢子的研究主要集中于侵染條件和侵染結(jié)構(gòu)方面[1213],對(duì)影響夏孢子萌發(fā)因素鮮有報(bào)道,因此本試驗(yàn)在前人研究的基礎(chǔ)上對(duì)溫度、光照、存放時(shí)間和孢子濃度以及不同培養(yǎng)載體對(duì)銹菌夏孢子萌發(fā)的影響進(jìn)行了研究。

試驗(yàn)結(jié)果表明,向日葵銹菌夏孢子的萌發(fā)與外界環(huán)境條件密切相關(guān),條件適宜的情況下,新鮮孢子1 h便開(kāi)始萌發(fā),8 h萌發(fā)率可達(dá)90%以上,萌發(fā)時(shí)芽管頂端略微膨大,一般每個(gè)夏孢子產(chǎn)生1個(gè)芽管,少數(shù)產(chǎn)生2個(gè)芽管,未發(fā)現(xiàn)多個(gè)芽管的現(xiàn)象。萌發(fā)時(shí)孢子內(nèi)部黃色的物質(zhì)隨著芽管伸長(zhǎng)流入芽管尾部。夏孢子萌發(fā)溫度范圍較廣,0～35℃均可萌發(fā),10～25℃為適宜萌發(fā)溫度,與Kochman等[10]在1983年得出的15～25℃最適侵染溫度及Shtienberg和Vintal[14]在1993年的研究結(jié)果10～24℃基本一致。黑暗環(huán)境在孢子萌發(fā)初期可以促進(jìn)孢子萌發(fā),但達(dá)到一定時(shí)間,光照對(duì)新鮮孢子萌發(fā)率基本無(wú)影響,這與小麥條銹菌持續(xù)光照抑制夏孢子萌發(fā),但光照對(duì)新鮮夏孢子影響較小的結(jié)果相近[1516]。使用新鮮的孢子進(jìn)行生物測(cè)定可以確保較高萌發(fā)率[17],試驗(yàn)證明銹菌夏孢子存放時(shí)間對(duì)孢子萌發(fā)影響很大,室溫條件下存放270 d的夏孢子基本喪失萌發(fā)能力。與新鮮夏孢子相比,即使存放30 d的夏孢子萌發(fā)率也存在顯著差異,結(jié)果與張永紅對(duì)小麥條銹菌夏孢子萌發(fā)研究結(jié)論一致[7]。存放時(shí)間影響孢子萌發(fā)率的現(xiàn)象在其他非專(zhuān)性寄生菌如蘋(píng)果樹(shù)腐爛病菌(Valsamali)[18]、稻曲病菌(Ustilaginoideavirens)[19]中也同樣存在,孢子萌發(fā)率會(huì)隨存放時(shí)間增長(zhǎng)而下降。夏孢子濃度低于20 mg/L時(shí)萌發(fā)率最高,超過(guò)30 mg/L時(shí)萌發(fā)率顯著降低。浸沒(méi)水中會(huì)抑制夏孢子萌發(fā),可能與其萌發(fā)需氧有關(guān);而夏孢子在水面上漂浮時(shí),萌發(fā)率會(huì)因孢子濃度過(guò)高或孢子聚集而降低[2021]。所以在水培條件下應(yīng)盡量降低孢子濃度。

鑒于水培法不利于對(duì)孢子萌發(fā)進(jìn)行觀察,試驗(yàn)設(shè)置了不同培養(yǎng)載體進(jìn)行夏孢子萌發(fā)試驗(yàn)。結(jié)果表明,在其他載體上孢子濃度對(duì)萌發(fā)率影響很小,只要均勻分散幾乎不受濃度影響。并且載體對(duì)夏孢子萌發(fā)的影響直接取決于它的保水性能,證明水分是夏孢子萌發(fā)的關(guān)鍵因素之一[56]。瓊脂薄膜載玻片上夏孢子萌發(fā)情況最佳,培養(yǎng)8 h后萌發(fā)率可達(dá)93.5%,芽管平均長(zhǎng)度為473.85 μm,便于開(kāi)展實(shí)時(shí)觀察,適用于觀察不同條件對(duì)孢子萌發(fā)的影響,但由于芽管在瓊脂薄膜上伸長(zhǎng)沒(méi)有方向性而且易長(zhǎng)入到瓊脂薄膜內(nèi),收集萌發(fā)孢子較為困難;親水載玻片上孢子萌發(fā)過(guò)程清晰易于觀察,但保濕能力較差,萌發(fā)率低且萌發(fā)程度差異較大;玻璃紙較親水載玻片保濕能力強(qiáng),8 h時(shí)萌發(fā)率為86.13%,萌發(fā)程度較為一致且透光性好,方便實(shí)時(shí)觀察和收集孢子,作為萌發(fā)載體較其他載體更具有優(yōu)越性;使用尼龍紗網(wǎng)做萌發(fā)載體,雖觀察孢子萌發(fā)芽管形態(tài)具有局限性,但萌發(fā)率高且芽管較長(zhǎng),適用于大量收集萌發(fā)孢子及芽管時(shí)使用;PVDF膜和親水濾膜作為載體雖然萌發(fā)率較低,但通過(guò)側(cè)光照射可全方位觀察到孢子萌發(fā)過(guò)程和形態(tài),并且可以清晰地看到芽管內(nèi)的黃色物質(zhì)的轉(zhuǎn)移過(guò)程,這與馬青、康振生等觀察到的向日葵葉片表面銹菌夏孢子芽管結(jié)合現(xiàn)象時(shí)芽管表現(xiàn)一致[12, 22]。使用紗網(wǎng)和親水濾膜進(jìn)行試驗(yàn)的結(jié)果與范龍泉等[6]針對(duì)不同載體對(duì)小麥條銹菌夏孢子萌發(fā)影響結(jié)果基本一致,但以PVDF膜為載體時(shí)觀察到向日葵銹菌夏孢子萌發(fā)時(shí)芽管尾部有明顯黃色水滴狀膨大,而小麥條銹菌夏孢子在PVDF膜上萌發(fā)時(shí)未見(jiàn)說(shuō)明。

鑒于目前針對(duì)向日葵銹菌夏孢子萌發(fā)條件和方法研究較少,對(duì)于研究向日葵銹病的發(fā)生規(guī)律和防治方法缺乏基礎(chǔ)依據(jù),本研究在探明向日葵銹菌夏孢子萌發(fā)的基本條件的同時(shí)通過(guò)對(duì)不同載體上夏孢子萌發(fā)率和萌發(fā)形態(tài)的比較,掌握了適用于不同試驗(yàn)?zāi)康牡南逆咦用劝l(fā)方法,為向日葵銹菌相關(guān)研究奠定了基礎(chǔ)條件,對(duì)于今后向日葵銹菌侵染機(jī)制及夏孢子萌發(fā)侵染相關(guān)的生物學(xué)研究具有重要意義。

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(責(zé)任編輯：田喆)

Germination conditions of the urediospores ofPucciniahelianthi

Hu Wenjie,Guo Dandan,Liang Yu,Jing Lan

(College of Agronomy, Inner Mongolia Agricultural University, Hohhot010019, China)

The urediniospores of the race 330 ofPucciniahelianthiwere used to explore the optimal germination conditions and culture substrates. The urediniospores began to germinate in 1 h at 15℃ and reached the maximum germination rate of 97% in 12 hoursinvitro. The results showed that the suitable range of temperature for urediniospore germination was 10-25℃, and the optimal temperature was around 15℃. The optimal inoculation concentration was 20 mg/L in water. Light had inhibitive effect on germination within 5 hours after inoculation, but no inhibitive effect at 7 h. Fresh spores were used for study to assure a high percentage of germination, and it was ascertained that the urediniospores had lost their germination abilities after stored for nine months at room temperature. By microscopy,we found that there was significant difference in germination rate and length of urediniospore germ tubes on the six culture substrates under the optimal temperature and humidity conditions. The germination rate of urediniospores exceeded 90% on hydrophilic slide, nylon gauze and cellophane paper. Moreover, we could observe movement of yellow particulates in the germinated tubes and formation of special structure on PVDF film and millipore filter.

Pucciniahelianthi;urediniospore;germination condition;germination rate

20150429

20150721

國(guó)家自然科學(xué)基金(3136042)；國(guó)家向日葵現(xiàn)代產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系(CARS-16)

E-mail:jinglan71@126.com

S 435.655

A

10.3969/j.issn.05291542.2016.03.012