王正鳳，李秀璋，李春杰*

(1.草地農(nóng)業(yè)系統(tǒng)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,蘭州大學(xué)草地農(nóng)業(yè)科技學(xué)院,甘肅 蘭州 730020；2.白銀市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所,甘肅 白銀 730900)

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鴨茅香柱菌形態(tài)學(xué)、生理學(xué)及系統(tǒng)發(fā)育研究

王正鳳1,2，李秀璋1，李春杰1*

(1.草地農(nóng)業(yè)系統(tǒng)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,蘭州大學(xué)草地農(nóng)業(yè)科技學(xué)院,甘肅 蘭州 730020；2.白銀市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所,甘肅 白銀 730900)

本文對新疆鴨茅進(jìn)行采樣調(diào)查，發(fā)現(xiàn)在鴨茅的分蘗上長有真菌子座，子座圓柱狀，成熟期為黃色，表面粗糙，子座長45～55 mm；在PDA培養(yǎng)基上25℃培養(yǎng)2周后，菌落直徑45～54 mm，菌落正面白色，棉質(zhì)，質(zhì)地緊密，中央隆起或稍有皺褶，背面白色至黃色；菌絲體細(xì)長，分枝，分隔，不易產(chǎn)生分生孢子。在受到脅迫時(shí)產(chǎn)生孢子，孢子梗長13～33 μm，基部寬2.7～4.1 μm，頂端變尖小于1 μm；分生孢子無色透明，橢圓形或腎形，單個(gè)頂生，(4.1±0.5) μm×(2.2±0.5) μm；為典型的Epichloё屬真菌。利用碳源能力由強(qiáng)到弱依次為：蔗糖>果糖>葡萄糖>淀粉。利用硝酸銨的能力最強(qiáng)，之后依次為蛋白胨和硝酸鉀，具有分解酪蛋白淀粉能力。選擇菌株Ed0907，利用rDNA-ITS序列分析構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果表明分離菌株(Ed0907)與Epichloёtyphina聚為一枝，相似率為100%。根據(jù)以上結(jié)果，確定分離菌株為Epichloё真菌。

內(nèi)生真菌；Epichloё-Dactylisglomerata共生體；培養(yǎng)特征；ITS序列

鴨茅(Dactylisglomerata)又名雞腳草、果園草，是禾本科疏叢型多年生優(yōu)質(zhì)牧草[1]，營養(yǎng)豐富，草質(zhì)柔軟，適口性好，產(chǎn)草量高，耐旱、耐熱、耐瘠薄以及耐蔭能力均較強(qiáng)[2]，近年來，鴨茅在我國四川、重慶、山西、甘肅、黑龍江、青海、新疆、陜西、貴州、云南、湖北、吉林、江蘇等省廣泛栽培應(yīng)用[3]。據(jù)報(bào)道，2004年在美國俄勒岡州生產(chǎn)的鴨茅種子幾乎均感染香柱菌，由此造成的損失約為820000美元；在法國，被香柱菌侵染的鴨茅在一年或兩年后將失去再生產(chǎn)能力；英國一年生的鴨茅發(fā)生香柱菌的幾率很低，但是二年生和五年生的鴨茅其侵染率分別達(dá)到33%和81%[4]。國內(nèi)有關(guān)香柱菌侵染鴨茅的研究鮮見于報(bào)道。

香柱菌(Epichloё)是一類侵染禾本科植物的麥角菌科的內(nèi)生真菌, 其主要分布于宿主禾草地上部分，往往與宿主形成較為穩(wěn)定的互惠共生關(guān)系。攜帶這類真菌的大部分宿主禾草可產(chǎn)生大量的吲哚乙酸、麥角纈氨酸和波胺等次級代謝物，增加宿主分蘗數(shù)，促進(jìn)禾草生長，提高宿主禾草抗病蟲、抗食草動(dòng)物等[5-6]。在一些生長環(huán)境條件下，部分Epichloё屬真菌在宿主禾草分蘗上產(chǎn)生子座，阻礙該分蘗的抽穗和結(jié)實(shí)，嚴(yán)重影響種子發(fā)育[7]。

目前，已報(bào)道Epichloё屬真菌共有43種[15]，中國7種，我國內(nèi)生真菌資源較為豐富，仍有許多未知內(nèi)生真菌有待于進(jìn)一步挖掘[15-16]。Li等[17]首次從分布于新疆的鴨茅葉鞘上發(fā)現(xiàn)了香柱菌形成的子座，并對其形態(tài)特征進(jìn)行了初步報(bào)道。本文以這一內(nèi)生真菌菌株為研究材料，對其形態(tài)學(xué)、生理學(xué)特征及系統(tǒng)發(fā)育學(xué)進(jìn)行深入研究，為香柱菌與鴨茅的共生機(jī)制及其這一真菌資源的有效利用提供基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料

2009年在新疆阿勒泰地區(qū)采集葉鞘上長有真菌子座的鴨茅。將植物樣品從莖基部剪斷，取其地上部分，樣品于4℃低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2香柱菌屬真菌的分離、培養(yǎng)和保存

將植物樣品組織切成小段(5 mm)，經(jīng)NaClO(1%)消毒后置于PDA 培養(yǎng)基上，培養(yǎng)皿置于25℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～7 d。待組織切口處長出菌絲，及時(shí)轉(zhuǎn)接至新鮮PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)，重復(fù)純化4次以上，然后接到試管斜面放入4℃冰箱保存。

1.3香柱菌屬真菌分類學(xué)及生理學(xué)特征研究

香柱菌在PDA平板上25℃培養(yǎng)3周后，用滅菌的打孔器(孔徑6 mm)在培養(yǎng)基的周圍新鮮菌絲上打孔，將菌餅接入盛有PDA、不同的碳源(蔗糖、果糖、葡萄糖和淀粉)、氮源(硝酸鉀、硝酸銨和蛋白胨)、淀粉-牛奶平板培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿(9 cm)上，每皿接一個(gè)菌餅(設(shè)置3個(gè)重復(fù))，25℃培養(yǎng)3周。采用十字法測量菌落直徑大小，測定該菌對4種碳源、3種氮源的利用情況，分解酪蛋白和淀粉的能力。使用SPSS 17.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

1.4目的DNA序列的測序和系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析

將rDNA-ITS序列PCR產(chǎn)物交由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進(jìn)行測序，引物為ITS4 (5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)和ITS5 (5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′)。獲得序列后，在GenBank中 BLAST進(jìn)行同源性搜索，從中調(diào)出與該序列相似性較高的核酸序列。使用Clustal X(1.83)軟件進(jìn)行多重序列匹配排列和聚類分析，使用 Mega 6.0軟件，采用最大似然法(maximum likelihood)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，并通過自舉分析(bootstrap)進(jìn)行置信度檢測，自舉數(shù)據(jù)集為1000次。

2　結(jié)果與分析

2.1真菌在植物中的形態(tài)特征

鴨茅的部分分蘗上長有真菌的子座(圖1A， B, C)。子座包裹著葉鞘，阻礙了宿主植物花序的生長,子座為黃色，表面粗糙，子座長45～55 mm；莖髓部菌絲體細(xì)長，粗細(xì)均勻，略帶彎曲，很少分叉(圖1D)。所發(fā)現(xiàn)的鴨茅群落中，長有子座的植株較少。

2.2真菌的形態(tài)特征

從形成子座的鴨茅上分離的香柱菌屬真菌，在PDA培養(yǎng)基上25℃培養(yǎng)2周后，菌落直徑45～54 mm，正面白色，棉質(zhì)，質(zhì)地緊密，中央隆起或稍有皺褶，背面白色至黃色；菌絲體細(xì)長，分枝，分隔(圖2A, B, C)不易產(chǎn)生分生孢子。在受到脅迫時(shí)產(chǎn)生孢子，孢子梗長13～33 μm，基部寬2.7～4.1 μm，頂端變尖小于1 μm；分生孢子無色透明，舟形或腎形，單個(gè)頂生，(4.1±0.5) μm×(2.2±0.5) μm(圖2D)。

圖2　從鴨茅中得到的真菌菌落及培養(yǎng)特征Fig.2　Colony characteristics of fungal isolate from glomerata　A:菌落正面 Obverse of the colony; B:菌落背面 Reverse of the colony; C:菌絲體 Hyphae; D:分生孢子梗和分生孢子(標(biāo)尺=5 μm) Conidiophores and conidia (Scale=5 μm).

內(nèi)生真菌Endophyte分生孢子梗Phialide長Length(μm)基部寬Base(μm)分生孢子大小Conididiumsize(μm)分生孢子形狀Conidiashape數(shù)據(jù)來源OriginEpichloёamarillans23.4±6.51.7±0.2(4.5±0.7)×(1.9±0.2)透明Transparent,半月形Half-moonshaped,腎形Kidney-shaped[29]Epichloёbaconii24.8±3.72.2±0.3(4.4±0.6)×(1.7±0.3)透明Transparent,半月形Half-moonshaped,腎形Kidney-shaped[28]Epichloёbrachyelytri16±32.0～2.8(4.1±0.6)×(2.8±0.3)透明Transparent,橢圓形Oval,舟形Funagata[7]Epichloёbromicola8～231.2～2.9(3.8±0.4)×(2.0±0.3)舟形Funagata,橢圓形Oval,無隔膜Undivided[22]Epichloёclarkii33.8±0.62.0±0.2(4.4±0.4)×(1.9±0.1)透明Transparent,半月形Half-moonshaped,腎形Kidney-shaped[28]Epichloёelymi17±32(4.4±0.4)×(2.2±0.2)透明Transparent,橢圓形Oval,舟形Funagata[7]Epichloёfestucae12～250.5～2.0(4.7±0.6)×(2.2±0.3)透明Transparent,半月形Half-moonshaped,腎形Kidney-shaped[23]Epichloёglyceriae31±52.5(3.8～6.2)×(2.2～2.8)透明Transparent,橢圓形Oval,舟形Funagata[7]Epichloёsylvatica15～331.0～1.7(5.0±1.1)×(2.0±0.5)舟形Funagata,橢圓形Oval,無隔膜Undivided[22]Epichloёtyphina22.5±5.92.2±0.5(4.9±0.4)×(2.5±0.4)透明Transparent,半月形Half-moonshaped,腎形Kidney-shaped[28]Epichloёyangzii16.5～25.82.2～2.9(4.7～5.2)×(2.0～2.9)透明Transparent,無隔膜Undivided,舟形Funagata,橢圓形Oval[26]Thisstudy13～332.7～4.1(4.1±0.5)×(2.2±0.5)透明Transparent,橢圓形Oval,腎形Kidney-shapedThisstudy

本文分離的菌株與已經(jīng)報(bào)道的Epichloё屬菌株的形態(tài)特征比較結(jié)果顯示，從鴨茅子座分離的真菌是典型的Epichloё屬真菌，但此菌株在形態(tài)上與已報(bào)到的菌株有一定的差異。分離的菌株可以從不同的特征方面與已報(bào)到的11個(gè)香柱菌加以區(qū)別(表1)：該菌的分生孢子梗和分生孢子與Epichloёclarkii、Epichloёsylvatica、Epichloёglyceriae這三種相近，與其他種類相差較大。此外，不同Epichloё屬菌株分生孢子的形狀各異，主要為透明橢圓形、舟形、腎形、半月形，本文分離的菌株分生孢子形狀為透明橢圓形和腎形。

2.3真菌的生理學(xué)特征

從表2可以看出，本文所分離的Epichloё真菌對碳源利用能力由強(qiáng)到弱依次為：蔗糖>果糖>葡萄糖>淀粉。5種Epichloё內(nèi)生真菌對蔗糖的利用能力最強(qiáng)，本文所分離的Epichloё真菌和Epichloёtyphina香柱菌對果糖的利用能力大于葡萄糖，其他3種香柱菌利用葡萄糖的能力大于果糖。無論何種碳源，本文所分離得到的香柱菌利用碳源能力均高于其他種類。由此可以看出，不同種類的香柱菌對碳素營養(yǎng)的利用能力各不相同。對于分解淀粉和酪蛋白的能力也存在差異，本文從鴨茅子座分離的Epichloё真菌與其他3種香柱菌(Epichloёbaconii、Epichloёclarkii、Epichloёtyphina)分解酪蛋白和淀粉能力(酪蛋白>淀粉)相似。這反映了它們在生理適應(yīng)與宿主是緊密相關(guān)的。

表2　部分香柱菌屬真菌培養(yǎng)特征比較Table 2　Cultural characters of Epichloё sp.

由表3可知，不同Epichloё真菌對氮源的利用也存在一定的差異性，醉馬草、高羊茅、羊茅內(nèi)生真菌利用蛋白胨的能力最強(qiáng)，其次為硝酸鉀，利用硝酸銨的能力很小，甚至于不能利用，而從鴨茅子座分離的Epichloё真菌恰恰相反，其利用硝酸銨的能力最強(qiáng)，依次為蛋白胨和硝酸鉀。

表3　部分內(nèi)生真菌利用氮源特征比較Table 3　Morphological characters of Epichloё sp. growth on different nitrogen sources

2.4分離菌株的分類學(xué)鑒定

將測序結(jié)果在NCBI/GenBank 數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行Blast比對，結(jié)果表明菌株(Ed0907)與Epichloёtyphina(LN714543)聚為一枝，相似率為100%，這表明這兩個(gè)真菌親緣關(guān)系十分接近(圖3)。綜合外部形態(tài)、菌落、顯微形態(tài)特征與ITS基因序列分析結(jié)果，將菌株Ed0907初步鑒定為子囊菌門Ascomycota、肉座菌目Hypocreales、麥角菌科Clavicipitaceae、香柱菌屬的Epichloёtyphina。

圖3　根據(jù)rDNA-ITS序列進(jìn)行構(gòu)建的鴨茅香柱菌最大簡約系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3　The maximum parsimony tree based on rDNA-ITS sequences of Epichloё endophyte with Dactylis glomerata　分支上的數(shù)字代表該分支的自展支持率(bootstrap值，1000次重復(fù)，顯示>50%)。The number on each branch denotes bootstrap value (>50%, 1000 replication).

3　討論

鴨茅近年來在我國被廣泛栽培應(yīng)用，張盼盼等[18]對新疆昭蘇種馬場阿克達(dá)拉草原和昭蘇小洪納海禁牧草場的鴨茅帶菌率進(jìn)行了檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這兩個(gè)地方的鴨茅種子糊粉層和種皮帶菌率檢測結(jié)果也各不相同，分別為48.40%，42.90%和83.90%，70.00%，同一種屬的不同地理位置檢測到的感染率不同。

但有關(guān)新疆分布的鴨茅屬植物Epichloё屬的真菌形態(tài)、生理及系統(tǒng)發(fā)育學(xué)方面沒有報(bào)道。本研究首次從我國新疆分布的鴨茅中發(fā)現(xiàn)并分離得到了Epichloё屬真菌[17]，內(nèi)生真菌在鴨茅植株上形成的子座、體內(nèi)形態(tài)及分離的植株形態(tài)學(xué)特征均呈現(xiàn)典型的Epichloё屬真菌特征，與其他各地鴨茅屬植物中分離的菌株形態(tài)特征類似。本研究發(fā)現(xiàn)的鴨茅香柱菌的子座長達(dá)45～55 mm。調(diào)查發(fā)現(xiàn)，香柱菌子座長約5～10 cm，未成熟時(shí)呈淺綠色，成熟時(shí)的子囊孢子呈橘黃色[19-21]。Alderman等[22]調(diào)查發(fā)現(xiàn)鴨茅Epichloёtyphina子座長為150～200 mm。

本文從鴨茅分離的真菌菌株(Ed0907)分生孢子梗長為13～33 μm；分生孢子大小(4.1±0.5) μm×(2.2±0.5)μm(表1)，已報(bào)到的Epichloё屬真菌的分生孢子梗長度為15～76 μm；分生孢子大小為(5.0±1.1) μm±(1.7±0.25) μm，本文所分離地菌株與Epichloё屬真菌的變幅近似。由此可見，宿主植物的分類地位及分布地區(qū)在Epichloё屬真菌的鑒定中起著很重要的作用，來自不同宿主植物的菌株往往自成一種[23]。例如，來自歐洲和北美洲的Agrostis屬植物中的Epichloё屬真菌在形態(tài)上及遺傳上存在明顯不同，因此分別被鑒定為E.baconii和E.amarillans。E.typhina是目前發(fā)現(xiàn)的該屬內(nèi)分布最廣[24]，宿主植物種類最多的一個(gè)種[17]，但與本試驗(yàn)所得菌株相比，在形態(tài)和生理學(xué)上也存在差異(表2，表3)，呈現(xiàn)出了內(nèi)生真菌形態(tài)的多樣性[25]。

本研究所得的菌株(Ed0907)對碳源利用范圍比較廣，己糖、二糖、多糖都可以利用，而利用蔗糖的能力比較強(qiáng)(表2)；對于氮源來說，利用硝酸銨的能力最強(qiáng)，之后依次為蛋白胨和硝酸鉀(表3)，與Kulkarni和Nielsen[27]將31種碳源對E.coenophiala(N.coenophialum)的利用能力篩選和Li等[26]對羊茅香柱菌研究結(jié)果基本一致。

從鴨茅中分離到的Epichloё菌株(Ed0907)分解酪蛋白的能力強(qiáng)于分解淀粉的能力，White等[28-30]對E.baconii、E.clarkii、E.typhina三種菌分解淀粉以及酪素結(jié)果表明，E.baconii分解酪素能力顯著強(qiáng)于E.clarkii、E.typhina種，而分解淀粉的能力較低。E.mollis(N.typhinum)可形成子座的菌系從植物獲取果糖和葡萄糖的能力顯著強(qiáng)于那些不形成子座的菌系(P<0.05)。Li等[26]對羊茅香柱菌研究結(jié)果表明，乳糖的促進(jìn)作用顯著高于其他碳源；蛋白胨可顯著促進(jìn)甘肅內(nèi)生真菌、高羊茅內(nèi)生真菌和羊茅香柱菌3種內(nèi)生真菌的生長。White等[30]對E.baconii、E.clarkii、E.typhina三種菌分解淀粉以及酪蛋白結(jié)果表明，E.baconii分解酪素能力顯著強(qiáng)于E.clarkii、E.typhina種，而分解淀粉的能力較低。本試驗(yàn)結(jié)果表明，菌株(Ed0907)分解酪蛋白的能力低于前3種，而其分解酪素的能力強(qiáng)于分解淀粉的能力。

本研究從采自我國新疆鴨茅中分離得到的一株內(nèi)生真菌(Ed0907)，采用形態(tài)學(xué)與分子生物學(xué)方法對其鑒定。菌株形態(tài)學(xué)特征包括生長速度、菌落特征、分生孢子特征等呈現(xiàn)香柱菌屬(Epichloё)真菌特征，基于獲得的ITS基因序列測定結(jié)果在NCBI上的同源性比對，同時(shí)結(jié)合基于ITS序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果得出，該菌株與香柱菌(Epichloёtyphina)高度聚類，相似性達(dá)100%。因此根據(jù)菌株形態(tài)學(xué)特征、系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析，將菌株Ed0907鑒定為香柱菌屬的Epichloёtyphina。

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*Morphological, physiological and phylogenetic characteristics ofEpichloё endophyte associated withDactylisglomerata

WANG Zheng-Feng1,2, LI Xiu-Zhang1, LI Chun-Jie1*

1.StateKeyLaboratoryofGrasslandandAgro-ecosystems,CollegeofPastoralAgricultureScienceandTechnology,LanzhouUniversity,Lanzhou730020,China; 2.AgricultureScienceInstituteofBaiyin,Baiyin730900,China

Surveys conducted in Xinjiang revealed aDactylisglomeratapopulation infected byEpichloё endophyte. The conidial stroma on the grass tillers were waxy, yellow and 45-55 mm in length. The endophyte was isolated and incubated on PDA (potato dextrose agar) medium for two weeks at 25℃. The diameter of colonies ranged from 45-54 mm. They were compact, centrally raised with a white cottony mass of aerial hyphae and white to yellow on the underside. Hyphae were long with septum and conidia very sparse unless the colony was stressed. Conidiophores were hyaline, smooth, 13-33 μm long, 2.7-4.1 μm at base and less than 1.0 μm at the tip. Conidia were hyaline, oval to reniform and size ranged; (4.1±0.5) μm×(2.2±0.5) μm. These dimensions are typical ofEpichloё endophytes. The preference of these isolatedEpichloё endophytes for carbon source was sucrose>fructose>glucose>starch and for nitrogen sources, ammonium nitrate>peptone>potassium nitrate. These isolations exhibited differences in the hydrolysis of casein and starch. ITS sequence of isolation-Ed0907 was analysis and the phylogenetic tree constructed; it showed that the tested isolation clustered withEpichloё typhina with 100% similarity rate. Based on these morphological, physiological and phylogenetic characteristics, the endophyte isolated fromD.glomeratawas identified asEpichloё spp.

endophyte;Epichloё-Dactylisglomeratasymbionts; culture character; ITS sequence

10.11686/cyxb2015419

http://cyxb.lzu.edu.cn

2015-09-07；改回日期：2015-11-02

國家973計(jì)劃課題(2014CB138702)和國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31372366)資助。

王正鳳(1983-)，女，甘肅靖遠(yuǎn)人，農(nóng)藝師，碩士。E-mail:wangzhengfeng222@163.com

Corresponding author. E-mail: chunjie@lzu.edu.cn

王正鳳，李秀璋，李春杰. 鴨茅香柱菌形態(tài)學(xué)、生理學(xué)及系統(tǒng)發(fā)育研究. 草業(yè)學(xué)報(bào), 2016, 25(6): 118-125.

WANG Zheng-Feng, LI Xiu-Zhang, LI Chun-Jie. Morphological, physiological and phylogenetic characteristics ofEpichloё endophyte associated withDactylisglomerata. Acta Prataculturae Sinica, 2016, 25(6): 118-125.