王佳慶　趙志剛　梅升輝首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京天壇醫(yī)：藥學(xué)部，北京100050

HPLC法測定人血漿中萬古霉素濃度的不確定度評定

王佳慶趙志剛梅升輝
首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京天壇醫(yī)：藥學(xué)部，北京100050

目的評定液相色譜（HPLC）法測定人血漿中萬古霉素（VCM）濃度的不確定度。方法采用Ag1ient ZORBAX SB-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動相為30 mmo1/L磷酸二氫鉀緩沖溶液-乙腈（91.5:8.5 pH值3.38），流速1.1 mL/min，檢測波長236 nm，柱溫35℃。分析并評定HPLC法測定人血漿中VCM濃度過程中的不確定度來源并進(jìn)行合成。結(jié)果人血漿中VCM低濃度（2.48 μg/mL）和高濃度（172.2 μg/mL）的擴(kuò)展不確定度分別為0.168 μg/mL和9.64 μg/mL（P=95%，k=2）。結(jié)論用HPLC法測定人體血漿中萬古霉素濃度的不確定度在高濃度時主要由基質(zhì)效應(yīng)、生物樣品的配制及重復(fù)性引入，在低濃度時主要由回收率、基質(zhì)效應(yīng)及生物樣品配制引入。

高效液相色譜法；萬古霉素；血清；不確定度

[Abstract]Objective To eva1uate the uncertainty on the determination of vancomycin(VCM)in human p1asma by HPLC method.Methods The chromatography was performed on an Ag1ient ZORBAX SB-C18(4.6 mm×250 mm,5 μm)co1umn with the mobi1e phase consisting of 30 mmo1/L potassiumdihydrogen phosphate-acetonitri1e(91.5:8.5,pH 3.38)at the f1ow rate of 1.1 mL/min.UV detection was set at 236 nm and the co1umn temperature was set at 35℃.The uncertainty sources in the determinationof VCM were ana1yzed and the uncertainty was eva1uated and combined.Results The expanded uncertainty of VCM at 1ow(2.48 μg/mL)and high(172.2 μg/mL)concentrations were 0.168 μg/mL and 9.64 μg/mL respective1y(P=95%,k=2).Conclusion The uncertainty on the determination of VCM in human p1asma by HPLC method is main1y caused by recovery,matrix effectand samp1e preparation for 1ow concentrations,and the matrix effect, samp1e preparation and repeatabi1ity for high concentrations.

[Key words]HPLC method;Vancomycin;Human p1asma;Uncertainty

萬古霉素（vancomycin，VCM）屬于三環(huán)糖肽類抗菌藥物，臨床上主要用于敏感革蘭陽性菌，特別是嚴(yán)重耐藥的金黃色葡萄球菌和表皮葡萄球菌所致的感染，因為此藥有耳、腎毒性和血栓性靜脈炎等嚴(yán)重的不良反應(yīng)，故臨床應(yīng)用時常進(jìn)行血藥濃度監(jiān)測以調(diào)整給藥方案[1]。萬古霉素、去甲萬古霉素的濃度測定方法國內(nèi)外多有報道[2-5]，本實驗建立了用HPLC法測定血漿中VCM的濃度。本文采用了測量不確定度來評價分析測試結(jié)果的質(zhì)量。當(dāng)不確定度值越小時，分析測試結(jié)果與真實值越接近，其質(zhì)量就越高，數(shù)據(jù)也越可靠[6]。本文根據(jù)相關(guān)規(guī)范和指南評價了HPLC法測定血清中VCM濃度的不確定度，為改進(jìn)實驗方法、提高檢測準(zhǔn)確度提供參考。

1　儀器與試劑

日本島津C1ass-VP高效液相色譜系統(tǒng)；UPW-20n多效蒸餾水器；Mett1er AE 163電子天平；ARK PH5-25酸度計；TGL-20M型高速臺式冷凍離心機(jī)（湘儀器械有限公司）；旋片式真空泵（上海市精工真空設(shè)備廠，型號：2XZ-1）。

VCM對照品（SIGMA，批號：BCBD7944V）；去甲萬古霉素內(nèi)標(biāo)對照品（中國藥品生物制品檢定所；批號：30339-200303）；乙腈：色譜純（Fisher公司，批號：67-55-1）；超純水。

2　方法與結(jié)果

2.1色譜條件

以去甲萬古霉素作為內(nèi)標(biāo)物質(zhì)，按內(nèi)標(biāo)法定量分析。液相色譜柱（Agi1ent，ZORBAX SB-C18，184.6 mm× 250 mm，5 μm，批號：880975-902），A相流動相為30 mmo1/L磷酸二氫鉀緩沖液（pH值3.38），B相流動相為乙腈，流速為1.1 mL/min，柱溫35℃，在波長為236 nm處檢測，91.5%的A相與8.5%的B相等度洗脫18 min。

2.2對照品和內(nèi)標(biāo)溶液的配制

精密稱取VCM對照品21.38 mg，定容到5.0 mL得S8（4 mg/mL）。取2.5 mL S8定容到5 mL，得S7。取2.5 mL S7定容到5.0 mL得S6。取2.5 mL S6定容到5.0 mL得S5。取2.5 mL S5定容到5.0 mL得S4，取2.0 mL S4定容到5.0 mL得S3，取2.5 mL S3定容到5 mL得S2，取4.0 mL S2定容到5.0 mL得S1。S8～S1對照品溶液濃度依次為4000、2000、1000、500、250、100、50、20 μg/mL，高、中和低濃度質(zhì)控樣品的濃度分別為3600、500、50 μg/mL。

精密稱取內(nèi)標(biāo)對照品5.15 mg，流動相定容到10 mL作為儲備液，配制濃度為0.515 mg/mL的內(nèi)標(biāo)液CIS備用。

2.3對照品、質(zhì)控品和待測樣品的配制

萬古霉素的系列對照品溶液和內(nèi)標(biāo)液CIS各10μL加入190 μL空白血漿中，渦旋30 s后加入60 μL高氯酸，渦旋30 s后13 000 r/min離心10 min，取上清液20 μL進(jìn)樣。

取待測樣品的配制內(nèi)標(biāo)液CIS10 μL加入200 μL待測樣品血漿中，渦旋30 s后加入60 μL高氯酸，渦旋30 s后13000 r/min離心10 min，取上清液20 μL進(jìn)樣。

2.4標(biāo)準(zhǔn)曲線

線性回歸方程：y=ax+b，其中：x為萬古霉素濃度，y為萬古霉素與內(nèi)標(biāo)的峰面積之比，a為斜率，b為截距。

2.5數(shù)學(xué)模型的建立

萬古霉素濃度的計算：C=（y-b）/a×CIS×f，其中：y為萬古霉素與內(nèi)標(biāo)物的峰面積之比，CIS為內(nèi)標(biāo)物的濃度，f為溫度對萬古霉素和內(nèi)標(biāo)物濃度測定的影響。

2.6測量不確定度來源的分析

本實驗建立的方法選擇性好，基本無干擾，日內(nèi)的精密度（RSD）低濃度＜13.17%，高濃度＜0.61%，日間的RSD低濃度＜10.61%，高濃度＜0.41%?；厥章试冢?8.92±4.35）%和（100.07±4.22）%之間。方法在室溫放置、冷凍放置和反復(fù)凍融3次的穩(wěn)定性良好。本文建立了不確定度的測試方法來考察實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性。通過分析測定過程可以得知測量不確定度的來源主要有：標(biāo)準(zhǔn)品的稱量、重復(fù)性、儀器允差、工作液的配制和生物樣品的制備、標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合、基質(zhì)效應(yīng)及萃取過程、溫度、樣品不均勻性和VCM濃度等諸多因素。見圖1。

圖1　測量不確定度來源分析

2.7測量不確定度的評定

2.7.1重復(fù)性（用A類評定程序）

重復(fù)性引入的不確定度，用質(zhì)控樣品重復(fù)測定值評估，低濃度（L）和高濃度（H）的質(zhì)控樣品共有3組（m=3），每組平行測量了5次（n=5），結(jié)果見表1。用貝塞爾公式計算合并樣本偏差：

其中：i為組數(shù)（i=1，2，…m），j為每組平行測定次數(shù)（j=1，2，…n）。每組5個測定值平均值的標(biāo)準(zhǔn)偏差為：，質(zhì)控的相對標(biāo)準(zhǔn)測量不確定度為：172.2 μg/mL，則低、高濃度的相對標(biāo)準(zhǔn)測量不確定度分別為：ur（1，L）=ur（x，L）=0.020，ur（1，H）=ur（x，H）= 0.0092。

表1　質(zhì)控樣品重復(fù)測定數(shù)據(jù)（±s，n=15）

表1　質(zhì)控樣品重復(fù)測定數(shù)據(jù)（±s，n=15）

組別濃度（2.50 μg/mL）濃度（180 μg/mL）123 2.490±0.207 2.510±0.191 2.430±0.175 165.000±0.511 177.000±0.638 175.000±1.204

2.7.2對照品稱量（用B類評定程序）

對照品稱量引起的不確定度一般可以表示為：

其中，天平的重復(fù)性誤差u（m）在重復(fù)性實驗中已經(jīng)計算，此處不再重復(fù)計算。隨機(jī)變量半寬a=0.5 e，天平檢定分度值e=0.01 mg。減重稱量時，自動調(diào)零作為一次扣皮，則a0=a，按均勻分布，包含因子k=，則自動調(diào)零u（△0）和天平的非線性誤差u（△）引起的標(biāo)準(zhǔn)測量不確定度為：0.0029（mg）

天平的標(biāo)準(zhǔn)測量不確定度計算為：

VCM稱量的質(zhì)量是21.38 mg，因為內(nèi)標(biāo)物的稱量不會對VCM的濃度測定造成影響，所以對照品稱量的相對標(biāo)準(zhǔn)測量不確定度計算為：

2.7.3對照品配制和生物樣品制備（用B類評定程序）

2.7.3.1容量瓶引入的測量不確定度由JJG196-2006常用玻璃量器檢定規(guī)程[13]查得A級5 mL容量瓶的容量允差為±0.010 mL。按三角形分布，包含因子k=，則由5 mL容量瓶引入的相對標(biāo)準(zhǔn)測量不確定度為

2.7.3.2移液器引入的測量不確定度實驗使用的Eppendorf移液器規(guī)格有：2～20 μL（P1）和20～200 μL（P2）。P1和P2在吸取10、60、190 μL時的相對最大允差分別為±1.2%、±1.0%、±0.6%。按三角形分布，包含因子，移液器引入的相對標(biāo)準(zhǔn)測量的不確定度分別計算為：

2.7.3.3移液管引入的測量不確定度實驗所用移液管（P）為A級，規(guī)格為2 mL和5 mL，最大允差分別為± 0.012 mL和±0.025 mL。按三角形分布，包含因子，移液管引入的相對標(biāo)準(zhǔn)測量不確定度分別計算為：

2.7.3.4對照品溶液配制過程中引入的測量不確定度對照品溶液配制過程中使用了2 mL移液管1次，5 mL的移液管6次，5 mL的容量瓶8次。內(nèi)標(biāo)物的配制不影響測定，因此對照品溶液配制引入的相對標(biāo)準(zhǔn)測量不確定度為：

2.7.3.5含藥的標(biāo)準(zhǔn)品和質(zhì)控品配制引入的測量不確定度含藥的標(biāo)準(zhǔn)品（S）和質(zhì)控樣品（QC）配制方法雖然相同，但是所用移液器的型號和次數(shù)分別為：P1吸取10 μL 2次，P2吸取60 μL 1次，190 μL 1次，則配制含藥標(biāo)準(zhǔn)品和質(zhì)控品的相對標(biāo)準(zhǔn)測量不確定度為：

則樣品制備引入的相對標(biāo)準(zhǔn)測量不確定度為：

2.7.4萃取過程中引入的測量不確定度（用B類評定程序）

萃取過程（RE）引入的不確定度可由萃取回收率進(jìn)行評估。評估方法：分別用空白溶劑和血漿配制高、低濃度質(zhì)控樣品，平行測定5次來評估回收率。計算公式：回收率（%）=血漿配制樣品萃取后的峰面積/經(jīng)過前處理的空白基質(zhì)配制樣品的峰面積×100%，內(nèi)標(biāo)歸一化的回收率（%）=VCM的回收率/IS的回收率× 100%。低、高濃度質(zhì)控樣品內(nèi)標(biāo)歸一化的回收率分別為（98.92±4.35）%和（100.07±4.22）%，則和回收率ur（5）引入的相對標(biāo)準(zhǔn)測量不確定度為：

2.7.5儀器量化引入的測量不確定度（用B類評定程序）

根據(jù)島津液相儀檢定證書，定量測量重復(fù)性RSD=2%，按均勻分布原則，k=?,則儀器量化引入的相對標(biāo)準(zhǔn)測量不確定度可以表示為：

2.7.6線性擬合過程中引入的不確定度（用B類評定程序）

標(biāo)準(zhǔn)曲線含有7個濃度，用VCM與IS峰面積的比值對萬古霉素濃度進(jìn)行線性擬合，見表2，用標(biāo)準(zhǔn)曲線反算出的對照品血漿的VCM濃度見表3。

表2　萬古霉素與IS峰面積比及回歸曲線參數(shù)

標(biāo)準(zhǔn)曲線包括了7個濃度，n=7，每個對照品濃度測定的次數(shù)均為3次，m=3，N為測定標(biāo)準(zhǔn)血漿溶液的總次數(shù)，N=m×n=21；xi為第i個標(biāo)準(zhǔn)血漿溶液的濃度，為7個標(biāo)準(zhǔn)血漿濃度的理論平均值，x=49.5 μg/mL；am為標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率；bm為標(biāo)準(zhǔn)曲線的截距；i為對照溶液的序數(shù)（i=1，2，…，N），j為測定血漿標(biāo)準(zhǔn)溶液的序數(shù)（j=1，2，…，N）。

表3　用擬合曲線計算出每個對照品血漿萬古霉素的濃度（μg/mL）

u（xL）=0.00486 μg/mL，u（xH）=0.006 71μg/mL則曲線擬合引入的相對標(biāo)準(zhǔn)測量不確定度為：

2.7.7溫度、對照品純度和樣品不均勻性引入的不確定度

實驗室溫度變化控制在±2°C以內(nèi)，并且標(biāo)準(zhǔn)曲線和待測樣品在同一室溫下制備和測定，溫度引入的不確定度可以忽略不計。由于對照品純度測定未提供不確定度，引入的不確定度則不予考慮。本實驗中的樣品為血漿，使用前經(jīng)過充分混勻，由樣品不均勻性引入的不確定度可以忽略。測量不確定度各分量大小的統(tǒng)計直方圖見圖2。

2.8標(biāo)準(zhǔn)測量不確定度的合成及擴(kuò)展

2.8.1標(biāo)準(zhǔn)測量不確定度的合成

依據(jù)不確定度傳播規(guī)律對各相對標(biāo)準(zhǔn)測量不確定度進(jìn)行合成公式為：

圖2　不確定度分量的統(tǒng)計直方圖

萬古霉素質(zhì)控樣品的合成標(biāo)準(zhǔn)測量不確定度分別為：

2.8.2標(biāo)準(zhǔn)測量不確定度的擴(kuò)展

用簡易評定法，對應(yīng)的置信概率P=95%（k=2），則擴(kuò)展不確定度分別為：

2.9測定結(jié)果的表示

當(dāng)置信概率P=95%（k=2），血漿中萬古霉素低、高濃度質(zhì)控的測定結(jié)果可以分別表示為（2.480± 0.168）μg/mL和（172.20±9.64）μg/mL。

3　討論

本試驗選取天壇醫(yī)：神經(jīng)外科開顱術(shù)后使用萬古霉素的患者。給藥方式為VCM 1.0 g靜脈內(nèi)輸注1 h，其后以125 mg/h（3 g/d）勻速持續(xù)靜脈輸注72 h。采集靜脈血標(biāo)本，用高效液相色譜法測定VCM濃度，樣品的濃度在3.4～103 μg/mL之間。

本文分析了HPLC法測定血漿中VCM濃度的實驗步驟和流程確定了不確定度的來源，根據(jù)規(guī)范、指南[7-9]并參考文獻(xiàn)[10-11]，將不確定度各分量進(jìn)行量化，最后進(jìn)行合成并擴(kuò)展。高、低質(zhì)控濃度回收率引入的不確定度差別很大。表明在進(jìn)行萃取操作時，為了減小誤差，應(yīng)當(dāng)制訂萃取的標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程并嚴(yán)格執(zhí)行。生物樣品配制引入的不確定度均較大，這與配制樣品使用移液器的精密度及使用次數(shù)有關(guān)。

線性回歸對低濃度的影響遠(yuǎn)大于高濃度，因此線性回歸時選擇合適的權(quán)重以保證低濃度測定的準(zhǔn)確性十分必要。由于實驗室溫度可以控制，而且標(biāo)準(zhǔn)曲線和待測樣品需要同時配制，溫度變化小，溫度引入的不確定度可以忽略不計。樣品不均勻性引入的不確定度在固體樣品中通常需要評定，而本實驗中的樣品均為液體，此項可忽略[5-7，9]。

綜上所述，用高效液相紫外檢測法測定血清中VCM含量的不確定度在高濃度時主要由生物樣品配制、回收率和基質(zhì)效應(yīng)引入，在低濃度時主要由重復(fù)性、生物樣品配制、基質(zhì)效應(yīng)和回收率引入。

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Uncertainty evaluation on the determination of vancomycinin human Plasma by HPLC method

WANG JiaqingZHAO ZhigangMEI Shenghui
Department of Pharmacy,Beijing Tiantan Hospita1,Capita1 Medica1 University,Beijing100050,China

R927.1

A

1673-7210（2016）04（a）-0030-05

北京市重點實驗室課題（2014DTYW03）。

王佳慶（1984-），女，碩士，主要從事臨床醫(yī)學(xué)和藥物分析研究。

梅升輝（1983-），男，博士，主要從事藥物化學(xué)和藥物分析研究。

（2015-12-24本文編輯：趙魯楓）