尹小明，趙詩云，饒麗華，彭旦明，吳東風(fēng)，伍柏青

（1、江西省人民醫(yī)院檢驗科，江西南昌330006；2、江西省中醫(yī)藥研究院藥理研究所，江西 南昌330077；3、南昌市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院檢驗科，江西 南昌330003）

雞血藤不同成分抗AA誘導(dǎo)的血小板聚集作用的實驗研究

尹小明1，趙詩云2，饒麗華3，彭旦明2，吳東風(fēng)2，伍柏青1

（1、江西省人民醫(yī)院檢驗科，江西南昌330006；2、江西省中醫(yī)藥研究院藥理研究所，江西 南昌330077；3、南昌市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院檢驗科，江西 南昌330003）

目的 篩選由花生四烯酸（AA）誘導(dǎo)的雞血藤抗血小板聚集作用的有效成分。方法 采用水提醇沉法，得雞血藤浸膏（總成分），用AB-8大孔吸附樹脂提取其中的總黃酮成分，提取黃酮后剩下的濾液即為非黃酮成分。實驗分組：分為雞血藤浸膏組、總黃酮成分組、非黃酮成分組、阿司匹林對照組、生理鹽水對照組。分別給SD大鼠灌胃高、中、低不同劑量的雞血藤各組分。測定由AA誘導(dǎo)的血小板5min之內(nèi)的最大聚集率。結(jié)果 雞血藤浸膏高、中、低劑量各組的聚集率（%）分別為：4. 6±1.1、8.3±2.0、42.5±4.2；雞血藤總黃酮成分高、中、低劑量各組的聚集率（%）分別為：6.4±1.5、37.6±3.5、70.1±4.3；雞血藤非黃酮成分高、中、低劑量各組的聚集率（%）分別為：65.7±3.2、69.0±3.8、72.5±4.4；阿司匹林對照組的聚集率（%）為：41.6±3.8；正常對照組的聚集率（%）為：70.3±4.6。雞血藤浸膏組、雞血藤總黃酮成分組（低劑量組除外）、阿司匹林組分別顯著性低于正常對照組（P＜0.01）。雞血藤非黃酮成分高、中、低劑量各組與生理鹽水對照組比較，結(jié)果無顯著性差異（P＞0.05）。結(jié)論 雞血藤總黃酮具有顯著性的抗AA誘導(dǎo)的血小板聚集作用，為開發(fā)新的抗血小板聚集藥物打下基礎(chǔ)。

雞血藤；總黃酮；阿司匹林；花生四烯酸；血小板聚集率

雞血藤主要含有黃酮類、萜類、甾醇類、蒽醌類、內(nèi)酯類、苷類及其它類型化合物，具有抗貧血、抗腫瘤［1，2］，抗病毒［3］等作用。但是雞血藤抗血小板聚集作用的報道較少［4］。是什么組分在體內(nèi)具有抗AA誘導(dǎo)的血小板聚集作用？雞血藤總黃酮是否有抗AA誘導(dǎo)的血小板聚集作用，尚未見報道。篩選雞血藤抗AA誘導(dǎo)的血小板聚集作用的有效成分，可以避免因成分不明而帶來的毒副作用。

1　材料與方法

1.1材料雞血藤購于廣西普寧市百草中藥飲片有限公司，生產(chǎn)批號：13020202。為豆科密花豆屬植物密花豆的干燥藤莖。SD大鼠，均為雄性，SPF級，體質(zhì)量（200±5）g，合格證號：JZDW No：2013-0024。儀器與試劑AggRam血小板聚集儀。試劑為原裝配套試劑，花生四烯酸批號：21224990。

1.2方法

1.2.1雞血藤浸膏的提取雞血藤1.0kg，水煎半小時，共煎煮2次，合并濾液，濃縮，再用70%乙醇去蛋白，減壓蒸干，得雞血藤浸膏，精密稱量，用重蒸餾水配成10.93mg·ml-1，消毒，置4℃冰箱備用。

1.2.2雞血藤總黃酮的提取按上述方法獲得雞血藤的浸膏，參照文獻(xiàn)方法［5-9］，用AB-8大孔吸附樹脂吸附，依次用水和25%、50%、70%的乙醇洗脫，合并洗脫液并減壓蒸干，得雞血藤總黃酮化合物。精密稱量，用重蒸餾水配成6.00mg·ml-1，消毒，置4℃冰箱備用。

1.2.3雞血藤非黃酮成分的提取上述去黃酮的濾液濃縮減壓干燥，精密稱量，用重蒸餾水配成68.42mg·ml-1，消毒，置4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4動物實驗SD大鼠分為雞血藤浸膏組、總黃酮成分組、非黃酮成分組、阿司匹林對照組和正常對照組。雞血藤浸膏組、黃酮成分組、非黃酮成分組，各組又分別分為高、中、低劑量3個小組，每小組10只SD大鼠。陽性對照組和正常對照組各10只。雞血藤浸膏組高劑量為145.4mg·kg-1體質(zhì)量、中劑量為72.9mg·kg-1體質(zhì)量、低劑量為36.5mg· kg-1體質(zhì)量；黃酮部位高劑量為88.9mg·kg-1體質(zhì)量、中劑量為 66.6mg·kg-1體質(zhì)量、低劑量為44.5mg·kg-1體質(zhì)量； 非黃酮部位高劑量為120.0mg·kg-1體質(zhì)量、中劑量為60.0mg·kg-1體質(zhì)量、低劑量為30.0mg·kg-1體質(zhì)量。分別給SD大鼠灌胃上述不同劑量的雞血藤浸膏、總黃酮成分、非黃酮成分，以及阿司匹林50.0mg·kg-1體質(zhì)量；正常對照組給SD大鼠灌胃生理鹽水10.0ml·kg-1體質(zhì)量。每天一次，連續(xù)給藥2d，末次給藥后4.0h取血4.0ml，立即測定血小板5min內(nèi)最大聚集率，2h內(nèi)完成。

1.2.5雞血藤抗血小板聚集的測定參照尹小明等建立的 “SD大鼠血小板聚集試驗的測定方法”［10］，測定5min內(nèi)血小板最大聚集率。即：將225μl富血小板血漿放入比色杯中，并放入1顆磁珠，放置2～3min預(yù)熱，再加入25μl AA（濃度5000μg·ml-1），同時按下“按鈕”，儀器自動開始連續(xù)測定血小板5min內(nèi)最大聚集率。

1.3統(tǒng)計學(xué)方法應(yīng)用EXCEL軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理分析，正態(tài)分布計量資料采用均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，不同組分藥物進(jìn)行組間比較采用成組t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1阿司匹林組，給予阿司匹林50.0mg·kg-1體質(zhì)量，SD大鼠血小板的聚集率為41.62%。正常對照組，給予生理鹽水10.0ml·kg-1體質(zhì)量，SD大鼠血小板聚集率為70.3%。阿司匹林組與正常對照組比較，具有顯著性差異（P＜0.01）。

2.2雞血藤浸膏抗血小板聚集的結(jié)果雞血藤浸膏組高劑量145.4mg·kg-1、中劑量72.9mg·kg-1、低劑量36.5mg·kg-1體質(zhì)量，SD大鼠血小板5min內(nèi)的最大聚集率分別為：4.3%、8.3%、42.5%。各劑量組與正常對照組比較具有非常顯著性差異 （P＜0.01），見表1。

表1　雞血藤浸膏對AA誘導(dǎo)SD大鼠血小板聚集的影響（±s，n=10）

表1　雞血藤浸膏對AA誘導(dǎo)SD大鼠血小板聚集的影響（±s，n=10）

注：—：給予生理鹽水10.0ml·kg-1，與正常對照組比較**P＜0.01。

組別5min內(nèi)最大聚集率（%）血小板抑制率（%）正常對照組阿司匹林組高劑量組中劑量組低劑量組P值劑量（mg·kg-1）—50.0 145.4 72.9 36.5 70.3±4.6 41.6±3.8**4.6±1.1**8.3±2.0**42.5±4.2**0.00 40.8 93.5 88.2 39.5

2.3雞血藤總黃酮抗血小板聚集的結(jié)果雞血藤總黃酮組高劑量88.9mg·kg-1、中劑量66.7mg·kg-1、低劑量44.5mg·kg-1體質(zhì)量，SD大鼠血小板5min內(nèi)的最大聚集率分別為：6.6%、37.6%、70.1%。雞血藤總黃酮高、中劑量組與正常對照組比較具有非常顯著性差異（P＜0.01），低劑量組與正常對照組比較無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表2。

表2　雞血藤總黃酮對AA誘導(dǎo)SD大鼠血小板聚集的影響（±s，n=10）

表2　雞血藤總黃酮對AA誘導(dǎo)SD大鼠血小板聚集的影響（±s，n=10）

注：—：給予生理鹽水10.0ml·kg-1，與正常對照組比較**P＜0.01，與正常對照組比較ΔP＞0.05。

組別5min內(nèi)最大聚集率（%）血小板抑制率（%）正常對照組阿司匹林組高劑量組中劑量組低劑量組P值劑量（mg·kg-1）—50.0 88.9 66.7 44.5 70.3±4.6 41.6±3.8**6.4±1.5**37.6±3.5**70.1±4.3Δ0.00 40.8 91.0 46.5 0.28

3.4雞血藤非黃酮成分組抗血小板聚集的結(jié)果雞血藤非黃酮成分高劑量81.5mg·kg-1、中劑量40.7mg·kg-1、低劑量20.4mg·kg-1體質(zhì)量，SD大鼠血小板的 5min內(nèi)最大聚集率分別為：65.7%、69.0%、72.5%。各劑量組與正常對照組比較無顯著性差異（P＞0.05），見表3。

表3　雞血藤非黃酮成分對AA誘導(dǎo)SD大鼠血小板聚集的影響（±s，n=10）

表3　雞血藤非黃酮成分對AA誘導(dǎo)SD大鼠血小板聚集的影響（±s，n=10）

注：—：給予生理鹽水10.0ml·kg-1，與正常對照組比較**P＜0.01，與正常對照組比較ΔP＞0.05。

組別5min內(nèi)最大聚集率（%）血小板抑制率（%）正常對照組阿司匹林組高劑量組中劑量組低劑量組P值劑量（mg·kg-1）—50.0 81.5 40.7 20.4 70.3±4.6 41.6±3.8**65.7±3.2Δ69.0±3.8Δ72.5±4.4Δ0.00 40.8 6.5 1.3 1.8

3　討論

雞血藤主要用于治療月經(jīng)不調(diào)，血虛萎黃，麻木癱瘓，風(fēng)濕痹痛等。本研究結(jié)果顯示：雞血藤總黃酮具有良好的抗AA誘導(dǎo)的血小板聚集作用。因為SD大鼠的血小板聚集率檢測與人類的血小板聚集率檢測不完全一樣，為了保證數(shù)據(jù)的可信性，本實驗在數(shù)據(jù)采集前，建立了SD大鼠血小板聚集實驗的方法［10］。血小板聚集是指血小板與血小板之間相互黏附形成血小板團(tuán)，參與血小板聚集的主要因素有誘導(dǎo)劑、血小板膜糖蛋白Ⅱb、Ⅲa復(fù)合物（GPⅡb/Ⅲa）、纖維蛋白原和Ca2+。誘導(dǎo)劑主要有花生四烯酸（AA），二磷酸腺苷、膠原、凝血酶、腎上腺素等。在血小板聚集過程中，血小板會發(fā)生釋放反應(yīng)，釋放出AA，AA的代謝產(chǎn)物是血小板聚集作用的集中表現(xiàn)，AA代謝產(chǎn)物的血栓烷A2（TXA2）具有促進(jìn)血小板聚集和收縮血管的作用。

影響血小板聚集的藥物作用機(jī)制各不相同，有的具有雙重作用，如：乙二胺四乙酸鹽（EDTAK2）可使肝素誘導(dǎo)的血小板發(fā)生解聚［11］；同時，也會使少數(shù)病例引起血小板聚集，形成血小板假性減少［12-15］，硝苯地平則以濃度依賴的方式抑制血小板聚集［16］。而阿司匹林抗血小板聚集作用的靶點是TXA2。雞血藤抗血小板聚集具有類似阿司匹林樣作用，雞血藤抗AA誘導(dǎo)的血小板聚集作用的成分是總黃酮，其作用靶點也可能是TXA2。阿司匹林抗AA誘導(dǎo)的血小板聚集作用的過程中具有出血副反應(yīng)；而雞血藤總黃酮抗血小板聚集作用的過程中，是否也有出血副反應(yīng)尚未見報道，雞血藤總黃酮抗AA誘導(dǎo)的血小板聚集作用的毒理實驗正在研究中。

［1］Ha ES，Lee EO，Yoon TJ，et al.Methylene chloride fraction of Spatholobi Caulis induces apoptosis viacaspase dependent pathway in U937 cell［J］.Biol Pharm Bull，2004，27（9）：1348-1352.

［2］唐勇，何薇，王玉芝.雞血藤黃酮類組分抗腫瘤活性研究［J］.中國實驗方劑學(xué)雜志，2007，13（2）：51-54.

［3］郭金鵬，龐佶，王新為，等.雞血藤提取物抗柯薩奇B3病毒活性組分研究［J］.時鐘國醫(yī)國藥，2009，20（9）：2301-2310.

［4］張浩，王芳.雞血藤醇提物的體外抗血小板聚集與離體血管舒張作用研究［J］.中國藥房，2013，24（35）：3271-3273.

［5］王宏，何微，曾祖平，等.大孔吸附樹脂分離純化雞血藤總黃酮的研究［J］.時針國醫(yī)國藥，2008，19（10）：2447-2448.

［6］王婷婷，曹樹穩(wěn)，余燕影，等.大孔吸附樹脂吸附分離豐城雞血藤總黃酮的研究［J］.天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2008，20：477-481.

［7］張夏輝，蔣世云，傅鳳鳴，等.雞血藤中黃酮類化合物提取工藝的研究［J］.化學(xué)分析計量，2013，22（1）：92-94.

［8］舒順利，應(yīng)軍，劉軍民，等.雞血藤化學(xué)成分研究［J］.中藥新藥與臨床藥理，2012，23（2）：184-186.

［9］李斌，李宵，寧小青，等.廣西產(chǎn)野生與栽培雞血藤的總黃酮含量研究［J］.廣西中醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2012，15（2）：53-55.

［10］尹小明，趙詩云，彭旦明，等.SD大鼠血小板聚集實驗測定方法的研究［J］.南昌大學(xué)學(xué)報（醫(yī)學(xué)版），2013，52（8）：6-7.

［11］王秀媛.乙二胺四乙酸鹽對肝素鈉抗凝后血小板聚集的影響［J］.實驗與檢驗醫(yī)學(xué)，2013，31（5）：452-453.

［12］仝德勝，楊靜，沈國強.抗凝劑EDTA導(dǎo)致血小板性減少現(xiàn)象的分析［J］.實驗與檢驗醫(yī)學(xué)，2015，33（1）：102-103.

［13］洪英，董玉英.血液分析儀檢測血象時應(yīng)對異常結(jié)果樣本進(jìn)行涂片鏡檢［J］.實驗與檢驗醫(yī)學(xué)，2011，29（3）：314.

［14］王偉，王海梅，楊平，等.EDTA-K2和枸櫞酸鈉同時依賴的假性血小板減少病例分析［J］.中華全科醫(yī)學(xué)，2013，11（15）：786-787.

［15］田雪玲，陳濤，張偉鶴.EDTA引起假性血小板減少的分析［J］.中國實用醫(yī)藥，2013，8（15）：64-65.

［16］余曉慧，周理明，余超.不同濃度硝苯地平對血小板聚集功能的影響［J］.實驗與檢驗醫(yī)學(xué)，2012，30（2）：149-150.

Screening of the effective parts of spatholobus suberectus on anti-platelet aggregation

YIN Xiaoming1，ZHAO Shiyun2，RAO Lihua3，PENG Danming2，WU Dongfeng2，Wu Boqing1.1.Department of Clinical Laboratory，Jiangxi Provincial People's Hospital，Nanchang 330006，China；2.Institute of Chinese Medicine，Jiangxi Provincial Traditional Chinese Medicine Academy，Nanchang 330077，China；3.Department of Clinical Laboratory，Nanchang Hospital of Integrated Traditional Chinese Medicine and Westen Medicine，Nanchang 330003，China.

Objective To screen the effective parts of spatholobus suberectus on anti-platelet aggregation.Methods Overall composition of spatholobus suberectus（OCSS）were extracted by water extraction and alcohol precipitation，then total flavonoids（TFSS）and nonflavonoids parts（NFPSS）in overall composition of spatholobus suberectus were separated by AB-8 macroreticular resin. Healthy SD rats divided into 11 groups were given a high，medium，low dose of OCSS，TFSS，NFPSS by intragastric administration individually for 2 days，and the maximum aggregation rate of platelet（MARP）induced by arachidonic acid（AA）were detected.Results The MARPs in positive group，overall composition group and total flavonoids group（except the low dose group）were significantly lower than those in negative group（P＜0.01），while there was no significant difference between nonflavonoids part group and negative group（P＞0.05）.Conclusion Flavonoids is the effective part of spatholobus suberectus on anti-platelet aggregation.

Spatholobus suberectus；Total flavonoids；Aspirin；Arachidonic acid；Platelet aggregation

R446.11+1，R558+.9

A

1674-1129（2016）04-0422-03

10.3969/j.issn.1674-1129.2016.04.004

江西省衛(wèi)省廳中醫(yī)藥科研基金資助項目（2012A127）

尹小明，男，1966年10月出生，學(xué)士，副主任技師，主要從事血栓與止血檢驗之中醫(yī)藥抗血小板聚集的研究。Tel：15979109623.E-mail：YXM_168@126.com

（2016-03-18；

2016-07-10）