馬國興，潘　峰，王慶波，溫春光，吳雅清，許瑞安*

（1.華僑大學 分子藥物研究院，福建 廈門 361021；2.分子藥物教育部工程研究中心，福建 廈門361021）

納豆激酶分子結構與潛在應用價值分析

馬國興1，2，潘峰1，2，王慶波1，2，溫春光1，2，吳雅清1，2，許瑞安*1，2

（1.華僑大學 分子藥物研究院，福建 廈門 361021；2.分子藥物教育部工程研究中心，福建 廈門361021）

納豆激酶因具有較強的溶血能力而著稱。目前國內(nèi)外大量研究人員聚焦于納豆激酶研究，其開發(fā)利用已經(jīng)獲得了長足發(fā)展，但同時許多問題與不足也隨之暴露出來。一方面是對納豆激酶的開發(fā)利用大多局限于溶栓活性的利用與開發(fā)，低估了納豆激酶應有的整體價值；其次是針對該酶開發(fā)和利用的方法過于傳統(tǒng)，尚未形成組學大數(shù)據(jù)和生物信息學技術相結合的探索思維。因此，需要利用更為開闊的研究思路和開發(fā)手段來實現(xiàn)納豆激酶開發(fā)利用的最大化。作者從納豆激酶分子水平和家族分類層次上系統(tǒng)地闡述該酶分子特征，同時對納豆激酶家族蛋白酶的應用現(xiàn)狀進行分析，并對納豆激酶研發(fā)前景進行了展望。

納豆激酶；保守區(qū)域；枯草芽孢桿菌蛋白酶；Peptidase-S8-subtilian-subset蛋白酶家族

Q 815

A

1673—1689（2016）04—0342—08

納豆激酶（Nattokinase，NK）最早是由日本學者Sumi等［1］從一種發(fā)酵食品納豆中分離得到的，他們通過纖維平板實驗發(fā)現(xiàn)NK具有優(yōu)異的溶解纖維平板活性而名聲大噪，NK也經(jīng)常被稱為纖溶酶（fibrinolysin）。納豆是日本的一種傳統(tǒng)大豆發(fā)酵食品，因此NK被人們喜聞樂道。隨后，Sumi等又發(fā)起了對NK分子特性的探究，深入研究發(fā)現(xiàn)NK是由納豆發(fā)酵中枯草芽孢桿菌分泌的一類絲氨酸蛋白酶（Serine protease）。NK的分子結構、分類和發(fā)掘利用廣泛引起國內(nèi)外其他研究人員關注，經(jīng)過多年的大量研究已經(jīng)基本摸清了NK的分子特性，生物信息學分析發(fā)現(xiàn)NK屬于枯草桿菌蛋白（Subtilisin）超家族，并且與 Subtilisin E十分接近都屬于Peptidase-S8-subtilian-subset家族。該家族蛋白酶在精細化工，醫(yī)藥和食品行業(yè)均表現(xiàn)出非常高的開發(fā)利用價值。同時對NK生物信息學分析必將為進一步開發(fā)利用NK提供更大的空間。

1　納豆激酶分子結構

1.1一級結構

1982年Nakamura［2］等通過E.coli宿主-載體系統(tǒng)中克隆出NK基因—aprN，并利用鳥槍法測定了包括調(diào)控序列在內(nèi)的1 473 bp的完整基因序列，使利用生物信息學研究NK基因成為可能。NK基因的起始密碼子為GTG，隨后的1 143 bp序列是由編碼信號肽、前導區(qū)域、成熟肽組成的 381個的氨基酸閱讀框架［3］。結構基因是TAA、TAA、TAG連續(xù)3個終止密碼子，該基因終止是以非依賴ρ因子終止方式，在密碼子之后一段回文序列可形成莖環(huán)結構輔助轉錄終止。起始密碼子的上游-17 bp處為核糖體結合起點AAAGGAG序列，SD序列上游是GC含量低于28%的轉錄調(diào)控區(qū)域［4］。成熟納豆激酶由長為275個氨基酸的單鏈多肽折疊而成。通過SDS-PAG凝膠電泳和蛋白序列預測分析NK相對分子質量約為28 000［4-5］，與Sumi等用Sephadex G-100柱凝膠過濾法測得結果存在一些差異。未經(jīng)修飾的NK是包含381個 氨基酸殘基的蛋白前體。蛋白前體分為3部分：其中從N端第 1-29個氨基酸殘基形成信號肽，第30～106個氨基酸殘基形成前導區(qū)域也稱前導肽（pro-peptide）。NK信號肽包含一個帶3個正電荷的親水N端以及一段不帶電荷的疏水殘基序列，使得NK正常分泌到胞外，其切割位點位于Ala-Glu-Ala保守序列之后。去掉信號肽的部分（含前導肽和成熟區(qū)域）為納豆激酶酶原（pronattokinase，pro-NK），該區(qū)域對重組NK意義重大。加工修飾后會切掉N端106個氨基酸基的前導肽，剩余的275個氨基酸殘基折疊成具有活性的成熟NK。

1.2保守結構域

NK 具有非常保守的結構域（conserve domains），這對NK的分類具有重要意義，根據(jù)保守區(qū)域分析NK屬于枯草桿菌蛋白酶（Subtilisin）超家族的一類（Peptidases-S8-Sub-tilisin-subset），與該家族蛋白酶類似，成熟NK的活性部位存在保守性，在Asp32、His64和Ser221表現(xiàn)出保守性，底物結合部位保守位點位于Ser125、Leu126、Gly127處，氧離子穴是Asn155［2，6］，這些位點均存在進化保守性，可以作為該家族蛋白酶身份識別位點。NK與該家族一些蛋白酶一級結構存在高度相似性，NK與枯草芽孢桿菌168（B.subtilis 168）產(chǎn)生的枯草桿菌蛋白酶E（Subtilisin E）基因序列存在13個堿基不同，在肽鏈序列組成上僅存在 2個氨基酸殘基的差異，序列同源性高達99.5%。相應的，NK與枯草桿菌解淀芽孢桿菌變種 （B.subtilis var.amylosacchariticus）產(chǎn)生的枯草桿菌蛋白酶（subtilisin amylosacchariticus）在核酸序列和肽鏈序列上僅有27個核苷酸和4個氨基酸的差異，成熟肽鏈序列同源性為 99.3%。此外，NK與解淀粉芽孢柑橘（Bacillus amyloliquefaciens）產(chǎn)生的枯草桿菌蛋白酶Bpn'（Subtilisin Bpn'）和地衣芽孢桿菌（Bacillus hcheniiformis）產(chǎn)生的枯草桿菌蛋白酶 Carlsberg （Subtilisin Carlsberg）的肽鏈序列同源性也高達86%和72%之多，并且催化中心不變。保守區(qū)域和序列信息為NK分類提供提供重要依據(jù)。

1.3高級結構

一些研究發(fā)現(xiàn)NK在結構上與其家族蛋白酶存在差異，這也是NK被看作成單獨的一種蛋白酶重要依據(jù)。隨著生物信息學深入研究發(fā)現(xiàn)NK與Subtilisin E的一級結構具有高度相似性，尤其是存在差異的突變位點的氨基酸對蛋白酶的結構活性基本不會產(chǎn)生什么影響［7］。因此可以推斷NK與其他的枯草芽孢桿菌的蛋白折疊與結構相似性極高。Subtilisin E的結構和機理研究比較清楚，其蛋白結構與折疊方式作為NK蛋白結構研究具有非常重要的參考價值［8］。與其他的subtilisins類似，具有高級結構的NK是由一條長的氨基酸序列折疊形成，并且不需要二硫鍵輔助折疊［2］，成熟區(qū)域的NK形成特定的空間結構域，包含催化三聯(lián)體（Asp32，His64，Ser221）和富氧離子穴（N155）［9-10］，保守結構位點都位于兩個α螺旋和7個β折疊鏈形成的口袋結構域中。NK的結晶呈針狀結晶，X射線晶體衍射分析NK屬于C2分子空間群屬，單晶格參數(shù)a，b，c分別為7.43，4.99，5.63 nm［11］。第一個模擬NK的3D結構［7］是由中國武漢大學病毒學重點實驗室使用MODELLER和PROCHECK模擬程序模擬完成。這有助于我們更形象的了解NK結構，空間結構顯示保守區(qū)域位點能夠在堿性環(huán)境中穩(wěn)定的存在于富氧離子穴中。NK是一種鈣離子結合蛋白，預測納豆激酶蛋白高級結構至少結合兩個鈣離子才能得以維持或者輔助NK形成特有的結構。subtilisin E存在一個與穩(wěn)定相關的高親和鈣離子結合位點，其他鈣離子結合位點則均表現(xiàn)出與折疊相關［12］。鈣離子與氨基酸殘基共同維持NK催化活性中心結構的準確性。目前對NK的高級結構研究還不是很透徹，但可以確定的是NK的高級結構與其他家族蛋白酶存在差異，并且活性中心保守，從結構角度可以說明了NK家族蛋白酶多樣性的可能。

1.4前導肽

NK基因成熟區(qū)與信號肽之間存在一段231bp序列，可表達包含77個氨基酸殘基在內(nèi)前導肽。該前導肽區(qū)域廣泛存在于Subtilisin家族蛋白酶的N端，非常有意思的是這一段氨基酸殘基的功能類似于分子伴侶功能（molecular chaperones）。它能輔助蛋白正確折疊功能，并且輔助折疊過程中不需要ATP提供能量，因此該段區(qū)域也被稱為分子內(nèi)伴侶（Intramolecular Chaperone）［13］。研究發(fā)現(xiàn)前導肽伴隨著整個蛋白的折疊過程，并且前導肽對輔助折疊的蛋白還表現(xiàn)出蛋白酶抑制活性，最終該前導肽也像分子伴侶那樣經(jīng)過自身的剪切被去掉，從而最后形成具有活性的蛋白酶，整個pro-subtilisin激活過程可分為3個步驟：（1）subtilisin結構域折疊，（2）前導肽輔助subtilisin自動折疊，（3）subtilisin的激活伴隨著前導肽切割［14］。整個的折疊過程如圖1所示。

沒有前導肽的成熟區(qū)折疊形成一個不具活性的形式的熔融球狀體結構［15］。在研究sbutilisin E中發(fā)現(xiàn)該區(qū)域不僅在輔助折疊過程，而且具有對變性蛋白具有很好的復性效果［13］。前導肽與枯草桿菌蛋白酶成熟活性具有密切的關系［14，16］，如果該區(qū)域發(fā)生突變對蛋白的正確折疊會帶來毀滅性的影響［17-18］。對前導肽的一些區(qū)域進行突變研究，發(fā)現(xiàn)許多氨基酸突變位置都對前導肽功能有很大影響，這也說明前導肽對蛋白酶的正確折疊具有至關重要的作用。多數(shù)NK編碼框中都有前導肽序列，最近也一直爭論重組的NK是否將前導肽與成熟區(qū)共表達的問題，但是隨著對前導肽的深入了解，成熟肽與前導肽共表達的方法更可取。此外，已在枯草桿菌和鏈激酶中發(fā)現(xiàn)一些NK同源基因。

圖1　NK正確折疊機制Fig.1　Foldingmechanism of NK

2　納豆激酶家族

2.1家族分類

早在1967年Markland和Smith等就對枯草芽孢桿菌中提取的Subtilisin進行了氨基酸測序［19］，此后，根據(jù)序列的保守區(qū)域分析該種Subtilisin與NK是同一家族的蛋白酶。近年來通過對NK的分子生物學特性的研究也表明其與大多數(shù)Subtilisin具有許多類似的性質，例如，NK在核苷酸序列及氨基酸組成上具有高度同源性，結構和性質上也表現(xiàn)出Subtilisin相似的特征。近年研究發(fā)現(xiàn)具有NK溶栓特性的酶不僅僅來源于納豆發(fā)酵菌，海洋中的一些枯草芽孢桿菌也存在大量的溶栓活性酶［20］。

NK與 常 見 的SubtilisinBPN’、Subtilisin Carlsberg、Subtilisin E和Subtilisin Savinase絲氨酸蛋白酶相比較，序列驚人的相似，同源性分別為84.9%、67.8%、98.9%和 62.92%［7］。其中Subtilisin E與納豆激酶最為相近，序列相似度達到98.9%，保守結構域完全一致，并且高級結構也達到99%的相似度。因此，NK分類可以劃分到微生物絲氨酸蛋白酶超家族Peptidases-S8-Subtilisin-subset家族中，其NCBI分類：cd07477。NK與家族分類關系（如圖2）。

該家族含有許多種 subtilisins，如 TK-subtilisin，SubtilisinCarlsberg，SubtilisinE和subtilisins BPN’等。其中有一些研究比較透徹的蛋白酶，如 Subtilisin BPN’，Subtilisin Carlsberg等。Subtilisin BPN’早在1965年［21］就被發(fā)現(xiàn)并報道，通過氨基酸測序發(fā)現(xiàn) Subtilisin BPN’與 Subtilisin Carlsberg中存在83個氨基酸的差異［22］。Subtilisin BPN’很早就被廣泛地應用到工業(yè)領域，例如在洗滌劑行業(yè)［23］。此家族中還一些極具工業(yè)開發(fā)利用價值的蛋白酶，例如TK-subtilisin，該酶是從一些極端環(huán)境微生物中發(fā)現(xiàn)的，具有非常強的熱穩(wěn)定性等特點［24］，更適應工業(yè)生產(chǎn)粗泛環(huán)境。藥用研究價值最相關的是Subtilisin E，它與NK結構和活性相似。這些家族蛋白酶開發(fā)利用對NK開發(fā)具有非常重要的參考價值，近10年來NK除溶栓以外，已逐漸被應用到其他應用領域（見表1）。

圖2　NK家族蛋白酶（cd07477）分類關系簡圖Fig.2　A taxonom ic chart of the NK proteinase fam ily（cd07477）

表1　近10年來年對NK非溶栓活性功能開發(fā)利用狀況Table 1　Development and utilization of NK in the past decade for the non-fibrinolytic properties

2.2多樣性分析

隨著微生物基因組學研究不斷推進和功能蛋白的深入挖掘，發(fā)現(xiàn)該蛋白家族存在分布廣，性質多樣，結構多樣等特點，而且均為枯草桿菌樣蛋白酶，說明該家族蛋白酶可能在枯草桿菌屬基因組中十分豐富，此外，常見的芽孢桿菌屬（Bacillus）的基因組也普遍存在該家族蛋白酶基因，例如目前發(fā)現(xiàn)的地衣芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、緩慢芽孢桿菌、嗜堿芽孢桿菌和南極嗜冷芽孢桿菌等［43］。最近隨著越來越多的微生物基因組的測序分析完成，發(fā)現(xiàn)該家族蛋白酶不僅僅存在于芽孢桿菌屬，在多種細菌，放線菌，真菌中亦有存在，表明該家族酶分布極為廣泛。

結構和性質多樣性主要是指蛋白分子結構多樣性從而體現(xiàn)的性質多樣，例如序列長度、蛋白晶體結構等信息。該蛋白家族除了保守區(qū)域以外，也發(fā)現(xiàn)存在一些其他的氨基酸殘基表達序列，這可能為酶分子結構和酶學性質的改變提供了一些線索。首先，酶的相對分子質量有變化，基因組中的一些蛋白酶的預測相對分子質量已經(jīng)遠遠超過常見28 000。該家族蛋白酶結構也存在多樣性，其中發(fā)現(xiàn)的同種TK-subtilisin就存在4種不同的晶體結構，發(fā)現(xiàn)有7個可能與鈣離子結合區(qū)域的不同，造成結構產(chǎn)生差異［12，15］。其次就是酶學性質的改變，例如嗜堿，耐高鹽，耐高溫，耐低溫等，同時還有一些表現(xiàn)出一定的表面活性劑耐受能力［44］。這說明該蛋白酶家族并非是特別嚴緊的特異性蛋白酶，也說明長期進化可能是該酶家族出現(xiàn)多樣性結果重要因素。

3　納豆激酶家族蛋白酶應用價值分析

3.1皮革行業(yè)中的應用

脫毛技術是皮革工業(yè)生產(chǎn)中的一個重要環(huán)節(jié)，是否有效的使用脫毛劑對皮革的生產(chǎn)質量至關重要，堿性絲氨酸蛋白酶（Alkaline Serine Protease）溶解毛羽是一種行之有效的脫毛方法，與傳統(tǒng)的皮革脫毛方法相比酶法脫毛不僅可以保護和軟化皮革并且環(huán)保高效［45］。皮革脫毛技術可選的酶種類比較多，放線菌、細菌、霉菌中均存在脫毛相關蛋白酶［46］。NK家族蛋白酶可以破壞毛發(fā)毛根固著結締組織讓毛發(fā)松動并脫落，是一種高效脫毛蛋白酶，因此也被應用到皮革脫毛技術中。Bassem等［47］從短芽孢桿菌US575菌株（Brevibacillus brevis US575）中分離得到的29 000角蛋白酶（Peptidases-S8-Subtilisinsubset）對雞、山羊、兔子、牛、綿羊毛皮均具有良好的脫毛效果。目前，國內(nèi)也展開了脫毛相關蛋白基因的克隆表達研究，如黃慶等［48］等短小芽孢桿菌（Bacillus pumilus）發(fā)現(xiàn)的脫毛蛋白酶也是NK蛋白酶家族的一員。肖懷秋等［49］從芽孢桿菌BX24中獲得一種中性蛋白酶，并對酶的性質進行了一系列研究。此外，毛羽處理與環(huán)境保護有關，酶法處理毛羽條件溫和且不易引起環(huán)境污染［50］。因此，表明該家族蛋白酶不僅具有較好的皮革工業(yè)應用價值，還具有一定的環(huán)境垃圾處理功能［51］，但目前仍缺乏NK在皮革行業(yè)脫毛工藝應用的相關研究。

3.2洗滌劑行業(yè)中的應用

洗滌劑添加酶是一個研究熱點，由于目前市場上流行的洗滌劑仍存在諸多缺點，例如不同的表面活性劑的物理作用，無法同時勝任多種頑固污漬的處理。蛋白酶能將一些不易溶于水的大分子蛋白類污漬酶解成易溶于水的或易被表面活性劑乳化、增溶的小分子片段。同時，將蛋白質大分子所黏附或包裹的污垢顆?？焖籴尫?，從而實現(xiàn)快速去污。當前市場上的許多洗滌劑產(chǎn)品都是通過添加蛋白酶來達到去蛋白質除污漬的目的，但存在洗滌劑中表面活性劑導致酶失活現(xiàn)象［52］。鹿桂乾等研究發(fā)現(xiàn)在9種液體洗滌劑添加表面活性劑中，只有AEO7和AEO9兩種對酶的活性影響相對較小［53］，并且洗滌環(huán)境相對比較粗放，所以對于洗滌劑添加用酶要求很高，一種對表面活性劑和洗滌環(huán)境具有很強耐受性的酶是作為洗滌劑添加酶的必要前提。

Anissa等在芽孢桿菌A21（Bacillusmojavensis A21）中發(fā)現(xiàn)BM1和BM2兩種堿性蛋白酶均具有很好的表面活性劑耐受能力，其中BM1通關過保守區(qū)域分析屬于NK蛋白酶家族，相對分子質量大約29 000，試驗中表現(xiàn)出很好的表面活性劑耐受和環(huán)境適應能力。日前發(fā)現(xiàn)血紅蛋白降解菌短小芽孢桿菌NJM4菌株（Bacillus pumilus NJM4）對頑固性污漬（血液污漬）具有很強的分解能力［54］，可以對蛋白污漬有很好去除效果。NK家族蛋白酶基因廣泛存在于微生物基因組中，因此使用基因組學篩選具有洗滌劑應用價值的基因是一種快速高效的辦法。這些具有工業(yè)應用價值的功能基因可以建立基因文庫，并且此家族蛋白酶的基因已經(jīng)被申請為洗滌劑添加劑專利［55］。

3.3醫(yī)藥行中的應用

NK作為輔助溶栓的保健品藥物，已在歐美和日本盛行20多年，在心腦血管疾病治療方面前景看好。不僅如此，NK家族蛋白酶在抗菌、抗線蟲、防止骨疏、阿爾茨海默病治療和臨床手術中同樣存在不可估量的潛在應用價值。該家族蛋白酶能溶解菌體，具有廣譜抗菌活性［56］。相關NK重組研究過程中NK表現(xiàn)出非常強的宿主菌毒性，重組工程菌株發(fā)酵過程常出現(xiàn)由NK溶菌活性所導致的菌體裂解現(xiàn)象，說明該家族蛋白酶具有非常好的溶菌抗菌價值。Antal等克隆得到的megA巨大芽孢桿菌抗菌肽基因中也含有NK家族蛋白酶保守區(qū)域閱讀框。推測巨大芽孢桿菌抗菌肽的抗菌功能與substllin溶菌能力具有密切關系。Niu等從芽孢桿菌B16 （Bacillus sp.B16）分離的NK家族絲氨酸蛋白酶具有很好的線蟲溶解活性，可以作為一種很好的線蟲治療藥物，在線蟲抑制堿性蛋白酶藥學領域具有巨大的應用價值。該家族蛋白酶在醫(yī)學領域也有非常大的開發(fā)利用價值，Takano等［26］把納豆激酶（substilin NAT）應用到玻璃體切割手術中，最近研究發(fā)現(xiàn)納豆激酶對淀粉樣蛋白具有很好的溶解活性，說明有納豆激酶可能對阿爾茨海默病也具有潛在醫(yī)療價值［27］。

3.4食品和飼料行業(yè)的應用

蛋白酶具有分解大分子蛋白形成多肽，從而提高食品或飼料營養(yǎng)的作用。NK本身的抗血栓和調(diào)節(jié)血脂的功效良好，因此豆豉和納豆均可作為非常好的保健功能性食品［5］。利用蛋白酶水解能力可顯著提高食品營養(yǎng)吸收，1999年Gesualdo等利用地衣芽孢桿菌 （Bacillus licheniformis）產(chǎn)生的Subtilisin Carlsberg蛋 白 酶 水 解 大 西 洋 鯡 魚 （Clupea harengus），從而提高營養(yǎng)價值。蛋白酶在飼料行業(yè)的應用也是傾向于蛋白酶對大分子蛋白的降解能力，提高家畜對飼料的利用率。NK蛋白酶家族具有活性高和種類多樣等特點，因此非常適合飼料行業(yè)高蛋白含量的豆粕和玉米餅的處理，可作為一種很好的飼料添加劑。

4　結語和展望

隨著組學大數(shù)據(jù)時代的到來和生物信息學的發(fā)展，NK的分子相關信息逐漸被一一解釋。從分子角度出發(fā)，可以把 NK定義為 Peptidases-S8-Subtilisin-subset家族的一員，由于該蛋白酶家族具有分布廣、結構多樣和性質多變等特點，因此該家族具有非常廣泛的開發(fā)和利用價值，例如醫(yī)藥、精細化工、食品和飼料等行業(yè)。但是，大量針對NK的研究還是局限和停留在基因發(fā)掘和血栓治療上，受最近的一些研究啟發(fā)，發(fā)現(xiàn)以目前研究方法思路遠遠無法實現(xiàn)NK價值開發(fā)和利用的最大化。目前，借助生物信息學技術從基因組尋找到更多更適合血栓治療的基因已經(jīng)成為可能，生物信息對功能基因發(fā)掘和利用都具有非常重要的意義。借鑒NK家族蛋白酶的相關性質和功能來挖掘NK工業(yè)和醫(yī)學的潛在價值是一種非常好的手段。

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AReview on theM olecular Structureof Nattokinaseand ItsPotentialApplication

MA Guoxing1，2，PAN Feng1，2，WANG Qingbo1，2，WEN Chunguang1，2，WU Yaqing1，2，XU Ruian*1，2
（1.Institute of Molecular Medicine，Huaqiao University，Xiamen 361021，China；2.Engineering Research Center of Molecular Medicine，M inistry of Education，Xiamen 361021，China）

Nattokinase（NK）iswellknown for its strong thrombolytic property.However，methods for exploring the enzyme are still traditionaland its value is thus underestimated.In this review，the structure and the classification for NK were summarized.Based on the applications of NK family proteases，the potentialutilizationsof NK were predicted.

Nattokinase（NK），conserved domains，subtilisin proteinase，Peptidase-S8-fam ily-subtiliansubset-superfam ily

2015-07-08

國家自然科學基金項目（81271692）；國家863計劃項目（2012AA020810）。

馬國興（1987—），男，河北唐山人，生物化工博士研究生，主要從事生物化工與基因工程藥物，生物信息學等研究。E-mail：mgxtongchi@163.com

許瑞安（1948—），男，福建泉州人，教授，主要從事微生物學、生物化學與分子生物學、海洋生物資源與環(huán)境、基因藥物等研究。E-mail：hmmedu@hqu.edu.cn