王章姐，李晶晶，胡容峰

（1.安徽新華學(xué)院 藥學(xué)院，安徽 合肥 230088；2.安徽中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，安徽 合肥 230031；3.安徽省中藥研究與開發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽 合肥230038）

星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法優(yōu)化柚皮素包合物的制備工藝

王章姐1，李晶晶1，胡容峰*2，3

（1.安徽新華學(xué)院 藥學(xué)院，安徽 合肥 230088；2.安徽中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，安徽 合肥 230031；3.安徽省中藥研究與開發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽 合肥230038）

研究星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法優(yōu)化柚皮素-β-環(huán)糊精（NAR-β-CD）包合物的制備工藝。采用攪拌法制備NAR-β-CD包合物，以β-CD與NAR的投料質(zhì)量比、包合時(shí)間、包合溫度為自變量，以包封率、包合物得率為因變量，采用星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面優(yōu)化法，對(duì)結(jié)果進(jìn)行多元線性回歸和二項(xiàng)式擬合，經(jīng)效應(yīng)面法預(yù)測(cè)最佳工藝條件，并作驗(yàn)證試驗(yàn)。并比較NAR-β-CD包合物和NAR的累積溶出率。NAR-β-CD包合物的最佳工藝：β-CD與NAR投料質(zhì)量比為5∶1，包合時(shí)間為1.412 h，包合溫度為48.11℃。包合率和包合物得率預(yù)測(cè)值與理論值的偏差分別為1.43%、1.99%。NAR和NAR-β-CD包合物的累積溶出率分別為37.15%，為83.24%。

NAR；β-環(huán)糊精；包合率；包合物得率；星點(diǎn)設(shè)計(jì)；效應(yīng)面

柚皮素（naringenin，NAR）是一種二氫黃酮類化合物，具有抗腫瘤、抗炎、鎮(zhèn)咳、抗氧化等多方面生物活性［1-3］，但NAR水溶性和脂溶性均較差、口服生物利用度較低，故其口服制劑在臨床上應(yīng)用受到了限制。目前包合物的制備多采用正交設(shè)計(jì)或均勻設(shè)計(jì)法進(jìn)行優(yōu)化，雖然實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)相對(duì)簡(jiǎn)單，實(shí)驗(yàn)次數(shù)較少，但精密度低。星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法是國(guó)內(nèi)近年來(lái)常用的集統(tǒng)計(jì)學(xué)和數(shù)學(xué)方法于一體的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和優(yōu)化方法，通過線性回歸和二項(xiàng)式擬合獲得最佳工藝參數(shù)［4-5］。作者采用星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法優(yōu)化NAR-β-CD包合物的制備工藝，并考察了NAR和NAR-β-CD包合物的累積溶出率。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

NAR原料藥 （批號(hào)HK20131222，質(zhì)量分?jǐn)?shù)98%，陜西慧科植物開發(fā)有限公司產(chǎn)品）；NAR對(duì)照品（批號(hào)110722-201018，中國(guó)藥品生物制品檢定所產(chǎn)品）；β-環(huán)糊精 （上海源葉生物科技有限公司產(chǎn)品）；乙醇等其余試劑均為分析純。

1.2儀器

DF-101S型智能集熱式恒溫加熱磁力攪拌器：河南省予華儀器有限公司產(chǎn)品；SHZ-DI-Ⅱ型循環(huán)水式真空泵：浙江黃巖求精真空泵廠產(chǎn)品；UV-2550紫外-可見分光光度儀：日本島津公司產(chǎn)品；Autoscience AS3120超聲波清洗機(jī)：奧特賽恩斯儀器有限公司產(chǎn)品；BT125D電子分析天平：賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司產(chǎn)品：DZF1.0型真空干燥箱：上海長(zhǎng)源儀器設(shè)備廠產(chǎn)品；CP2115D電子天平：Satorius公司產(chǎn)品。

1.3方法

1.3.1NAR-β-CD包合物的制備稱取適量β-CD溶于水中，加熱溶解制成β-CD飽和水溶液，備用。稱取一定量NAR原料藥，加入適量體積分?jǐn)?shù)70%乙醇，置恒溫磁力攪拌中，加入β-CD飽和水溶液，磁力加熱攪拌一定時(shí)間，靜置，放入冰箱中冷藏24 h，真空抽濾，用無(wú)水乙醇多次洗滌濾餅，干燥，得到橙黃色固體即為NAR-β-CD包合物［6］。

1.3.2對(duì)照品儲(chǔ)備液的制備取在105℃干燥至恒重的NAR對(duì)照品20mg，精密稱定，置100mL容量瓶中，加體積分?jǐn)?shù)70%乙醇適量，搖勻使溶解，再加體積分?jǐn)?shù)70%乙醇至刻度，精密量取5 mL置50 mL量瓶中，加體積分?jǐn)?shù)70%乙醇稀釋至刻度，即得20mg/L對(duì)照品溶液。

1.3.3供試品溶液的制備取NAR-β-CD包合物適量，加體積分?jǐn)?shù)70%乙醇溶解配成一定質(zhì)量濃度的供試品溶液。

1.3.4紫外檢測(cè)波長(zhǎng)的掃描精密量取NAR對(duì)照品溶液適量，在200～600 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，選取最大吸收波長(zhǎng)作為NAR含量測(cè)定時(shí)的檢測(cè)波長(zhǎng)。

1.3.5評(píng)價(jià)指標(biāo)以NAR-β-CD包合物包合率（Y1）和包合物得率 （Y2）評(píng)價(jià)指標(biāo)。Y1=包合物中NAR的質(zhì)量/投入NAR的質(zhì)量；Y2=干燥包合物的質(zhì)量/（β-CD的質(zhì)量+NAR的質(zhì)量）

1.3.6星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法優(yōu)化工藝通過前期預(yù)實(shí)驗(yàn)選擇出對(duì)包合率、包合物得率有影響的3個(gè)因素為自變量：β-CD與NAR的投料質(zhì)量比 （X1）、包合時(shí)間（X2）、包合溫度（X3），并分別進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)，從而確定3個(gè)自變量水平范圍分別為X1：1∶1～6∶1；X2：0.5～5 h；X3：40～80℃。根據(jù)星點(diǎn)設(shè)計(jì)原理，每個(gè)因素設(shè)置5個(gè)水平，分別用-α、-1、0、1、α表示，本實(shí)驗(yàn)中α=1.682。星點(diǎn)設(shè)計(jì)因素水平見表1，試驗(yàn)安排及結(jié)果見表2［7］。

表1　星點(diǎn)設(shè)計(jì)因素水平表Table 1　Independent variables and levels

表2　星點(diǎn)設(shè)計(jì)表與結(jié)果Table 2　Experiment design and results

2　結(jié)果與分析

2.1NAR的含量測(cè)定

2.1.1紫外檢測(cè)波長(zhǎng)的確定經(jīng)全波長(zhǎng)掃描，結(jié)果顯示NAR在288 nm和322 nm處有最大吸收波長(zhǎng)，由于β-CD在288 nm處也有吸收，為避免處方中β-CD的干擾，故選用322 nm處作為NAR含量測(cè)定時(shí)的檢測(cè)波長(zhǎng)。

2.1.2標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制精密量取NAR對(duì)照品儲(chǔ)備液3、4、5、6、7、8mL于10mL容量瓶中，加入體積分?jǐn)?shù)70%乙醇至刻度，得到6、8、10、12、14、16 mg/L的對(duì)照品溶液。以70%乙醇為空白對(duì)照溶液，照紫外-可見分光光度法 （《中國(guó)藥典》2010年版一部附錄VA）試驗(yàn)，在322 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。以對(duì)照品濃度C為橫坐標(biāo)，吸光度A為縱坐標(biāo)，繪制NAR的標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程A=0.052 1C+0.035 0，r=0.992 7，表明NAR在6～16 mg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.1.3精密度試驗(yàn)配制高、中、低3個(gè)質(zhì)量濃度（14、10、6 mg/L）的NAR對(duì)照品溶液，對(duì)NAR進(jìn)行日間和日內(nèi)差別的測(cè)定。日內(nèi)精密度RSD分別為1.68%、2.31%、1.96%（n=5）；日間精密度RSD分別為1.25%、2.42%、2.37%（n=5），結(jié)果顯示本方法精密度良好。

2.1.4穩(wěn)定性試驗(yàn)取供試品溶液，每隔5min測(cè)定一次，記錄吸光度，連續(xù)測(cè)定6次，計(jì)算NAR吸光度的RSD為1.06%，表明供試品溶液在30 min內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.5重復(fù)性試驗(yàn)取NAR-β-CD包合物6份，平行配制成供試品溶液進(jìn)行測(cè)定，連續(xù)測(cè)定，記錄吸光度，計(jì)算NAR的RSD為0.92%，表明該方法重復(fù)性較好。

2.1.6回收率試驗(yàn)按處方量的80%、100%、120%加入NAR對(duì)照品，平行制備3份，測(cè)定樣品中NAR的量，計(jì)算回收率。結(jié)果平均回收率分別為98.42%、98.85%、99.14%，RSD分別為1.83%、2.36%、2.49%。

2.2星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法優(yōu)化工藝

2.2.1模型擬合采用Design Expert 8.05軟件，分別對(duì)各因素水平進(jìn)行多元線性回歸和非線性回歸（二項(xiàng)式公式擬合），多元線性回歸方程：包合率C= 87.42+4.57A+5.70B+2.39C，r=0.729；包合物得率Y2= 62.76+2.51A+3.82B+1.74C，r＝0.665；多元線性回歸方程相關(guān)系數(shù)均較低，表示自變量與因變量之間線性相關(guān)性較差，多元線性回歸擬合度不佳，預(yù)測(cè)性較差，故采用二項(xiàng)式擬合。二項(xiàng)式擬合模型為包合率Y1=95.48+4.57A+5.70B+2.39C+0.61AB+0.17AC+ 0.071BC-5.05A2-3.97B2-2.78C2，r=0.964；包合物得率Y2=68.95+2.51A+3.82B+1.74C-0.52AB-0.82AC-1.33BC-4.21A2-2.57B2-2.29C2，r=0.982。兩個(gè)二項(xiàng)式擬合方程的相關(guān)系數(shù)分別是0.964和0.982，表明此設(shè)計(jì)模型擬合程度良好，可以用此模型對(duì)NAR包合物工藝進(jìn)行預(yù)測(cè)和分析。

2.2.2效應(yīng)面優(yōu)化由Design Expert 8.05軟件繪制不同影響因素對(duì)于響應(yīng)值的三維曲線，分別固定投料質(zhì)量比、包合時(shí)間和包合溫度3個(gè)影響因素其中之一，考察其他2個(gè)因素對(duì)包合率、包合物得率的效應(yīng)曲面圖，結(jié)果見圖1。根據(jù)方程和響應(yīng)面圖確定NAR包合物的最優(yōu)工藝參數(shù)：β-CD與NAR投料質(zhì)量比為5∶1，包合時(shí)間為1.412 h，包合溫度為48.11℃。

圖1　包合率，包合物得率的效應(yīng)面的三維圖Fig.1　Response surface p lot（3D）of the bias for the inclusion ratio andinclusion com plexes yield

2.3驗(yàn)證試驗(yàn)

根據(jù)優(yōu)化的最佳工藝條件，平行進(jìn)行3組NAR包合物驗(yàn)證試驗(yàn)，并對(duì)包合率和包合物得率進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見表3。其中偏差＝（預(yù)測(cè)值－實(shí)測(cè)值）/預(yù)測(cè)值。通過驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)可知，星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法所建立的模型預(yù)測(cè)性良好，方法可行，可較好地應(yīng)用于NAR包合物的工藝優(yōu)化。

2.4NAR-β-CD包合物溶出度測(cè)定

表3　星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面優(yōu)化法驗(yàn)證Table 3　Verification of the Central composite designresponse surfacemethodology

按中國(guó)藥典2010年版（第二部）溶出度測(cè)定法第三法測(cè)定NAR-β-CD的體外溶出度。以100mL人工胃液（含質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%PEG400）作為溶出介質(zhì)，并設(shè)定溶出介質(zhì)溫度恒定在在 （37±0.5）℃，再將NAR-β-CD包合物及NAR分別置于相同的溶出介質(zhì)中，設(shè)置轉(zhuǎn)速為100r/min，于5，10，15，30，45，60，70，90 min吸取溶出液10 mL，并補(bǔ)充等體積含質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%PEG400的溶出介質(zhì)，用微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液按2.2項(xiàng)下含量測(cè)定方法進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算出不同時(shí)間NAR的累積釋藥率，結(jié)果見圖2。

圖2　NAR及NAR-β-CD包合物的累積溶出曲線Fig.2　In vitro release curve of NAR and NAR-β-CD

3　結(jié)語(yǔ)

將藥物分子與-包合材料通過范德華力形成包合物后，可使溶解度增大，穩(wěn)定性提高，毒副作用降低等作用，還可調(diào)節(jié)藥物在體內(nèi)的釋放速率，有效提高藥物生物利用度，可用于制備緩控釋制劑和靶向制劑。

采用攪拌法制備NAR-β-CD包合物，操作方法簡(jiǎn)單，易于工業(yè)化生產(chǎn)；通過預(yù)實(shí)驗(yàn)初步篩選出投料質(zhì)量比、包合時(shí)間、包合溫度范圍，采用星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面發(fā)優(yōu)化NAR-β-CD包合物制備工藝，經(jīng)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)證明，星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法對(duì)制備工藝進(jìn)行優(yōu)化，其試驗(yàn)次數(shù)少、精度高，對(duì)結(jié)果進(jìn)行多元線性回歸和二項(xiàng)式擬合，經(jīng)效應(yīng)面法預(yù)測(cè)最佳工藝條件，所建立的模型相關(guān)系數(shù)較高，預(yù)測(cè)性較好，對(duì)開發(fā)研究NAR-β-CD包合物新劑型奠定基礎(chǔ)。

在包合過程中，藥物分子先溶解在適當(dāng)?shù)娜軇┲?，再與-β-CD形成包合物，由于疏水力是促進(jìn)包合的主要作用力，故包和條件通常在水或不同濃度的乙醇中進(jìn)行，NAR水溶性較低，在制備NAR-β-CD包合物時(shí)，先將NAR溶解在體積分?jǐn)?shù)70%乙醇中，經(jīng)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)溶解效果較好，且乙醇易于揮發(fā)，再與β-CD形成包合物，有利于包合物的形成。

比較NAR和NAR-β-CD包合物在人工胃液中90 min內(nèi)的累積溶出率，NAR為37.15%，NAR-β-CD包合物為83.24%，結(jié)果表明NAR制成NAR-β-CD包合物后溶出度顯著提高。

［1］Fa Yun Zhang，Gang Jun Du，Ling Zhang，et al.Naringenin nnhances the anti-tumor effect of doxorubicin through selectively inhibiting the activity ofmultidrug resistance-associated proteinsbutnotP-glycoprotein［J］.Pharmaceutical Research，2009，26 （4）：914-925.

［2］Feng-Lin Yen，Tzu-HuiWu，Liang-Tzung Lin，etal.Naringenin-loaded nanoparticles improve the physicochem ical propertie and the hepatoprotective effects of naringenin in orally-administered rats w ith CCl4-Induced acute liver failure life［J］. Pharmaceutical Research，2009，26（4）：893-902.

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［4］劉艷杰，項(xiàng)榮武.星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法在藥學(xué)試驗(yàn)中的應(yīng)用［J］.中國(guó)現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué)雜志，2007，24（6）：455-457. LIU Yanjie，XIANG Rongwu.Application of central composite design/response surfacemethodology in pharmacy experiment design［J］.Chinese Journal of Modern Applied Pharmacy，2007，24（6）：455-457.（in Chinese）

［5］李潁，曾茂貴，鄭笈，等.星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法優(yōu)化魚腥草揮發(fā)油-β-環(huán)糊精包合物的制備工藝［J］.中草藥，2014，45（13）：1855-1862. LIYing，ZENG Maogui，ZHEN Ji，et al.Optim ization of preparation of volatile oil from Houttuynie Herba-β-cyclodextrin inclusion complex by central composite design-response surfacemethod［J］.Chinese Traditional and Herbal Drugs，2014，45 （13）：1855-1862.（in Chinese）

［6］徐新榮，于海濤，杭麗，等.柚皮素β-環(huán)糊精包合物的制備及對(duì)模型大鼠脈絡(luò)膜新生血管形成的抑制作用［J］.中國(guó)藥房，2014，25（11）：981-984. XU Xinrong，YU Haitao，HANG Li，et al.Preparation of inclusion complex of naringenin andβ-cyclodextrin and inhibitory effectsof iton choroidalneovascularization inmodel rats［J］.China Pharmacy，2014，25（11）：981-984.（in Chinese）

［7］Wu w，CuiG H.Central composite design and response surfacemethod and itsapplication in pharmacy［J］.Foreign Medical Sciences Section of Phamacy，2000，27（5）：292-298.

App lication of the Central Com posite Design and Response Surface M ethodology to the Preparation Optim ization of Naringenin-β-Cyclodextrin Inclusion Com p lexes

WANG Zhangjie1，LIJingjing1，HU Rongfeng*2，3
（1.School of Pharmaceutical Sciences，Anhui Xinhua College，Hefei 230088，China；2.School of Pharmacy，Anhui University of Traditional Chinese Medicine，Hefei 230031，China；3.Key Laboratory of Research and Development of Chinese Medicine in Anhui Province，Hefei230038，China）

The central composite design and response surfacemethodologywere applied to optimize the preparation technology of naringenin-β-cyclodextrin inclusion complexes.The inclusion ratio and the yield of inclusion complexeswere studied as independentvariables，using several dependent variables such as stirring，themass ratio of NAR-β-CD，inclusion time，and inclusion temperature. The results were fitted by linear equations and second-order polynom ial equation based on the central composite design and response surfacemethod.The optimal inclusion processwas predicted according to formulation and further verified by experiments.The cumulative dissolution ratesof the NAR-β-CD inclusion complexes and the NAR were comparatively studied.The optimal conditionfor the preparation of NAR-β-CD inclusion complexeswas achieved w ith a ratio of 5∶1（β-CD∶NAR），inclusion time of 1.412 h，and inclusion temperature at 48.11℃，where the bias for the prediction valueand theoreticalvalue of the inclusion ratio and the yield of inclusion complexeswere 1.43%and 1.99%，while the cumulative dissolution rate of NAR and NAR-β-CD inclusion complexeswere37.15%and 83.24%，respectively.

Naringenin，β-cyclodextrin，inclusion ratio，yield of the inclusion complexes，central composite design，response surface

TS 23

A

1673—1689（2016）04—0438—05

2014-11-19

安徽高校自然科學(xué)研究項(xiàng)目（KJ2016A312）；國(guó)家級(jí)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目（201312216024）；安徽新華學(xué)院校級(jí)科研項(xiàng)目（2013zr008）；安徽新華學(xué)院校級(jí)質(zhì)量工程項(xiàng)目（2013jgkcx02）。

王章姐（1982—），女，安徽安慶人，理學(xué)碩士，講師，主要從事藥物新劑型研究。E-mail：40462634@qq.com

胡容峰（1965—），女，理學(xué)博士，教授，主要從事緩控釋制劑技術(shù)研究。E-mail：hurongfeng@163.com