汝成業(yè)， 張　娟， 堵國成，陳　堅，李江華*

（1.江南大學(xué) 食品安全與營養(yǎng)協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 無錫214122；2.江南大學(xué) 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室，江蘇 無錫214122；3.江南大學(xué) 糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國家工程實驗室，江蘇 無錫 214122；4.江南大學(xué) 糖化學(xué)與生物技術(shù)教育部重點實驗室，江蘇 無錫214122；5.江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無錫214122）

包埋固定化酶降解牛奶αs1-酪蛋白過敏性研究

汝成業(yè)1，2，5， 張娟2，5， 堵國成4，5，陳堅3，5，李江華*2，5

（1.江南大學(xué) 食品安全與營養(yǎng)協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 無錫214122；2.江南大學(xué) 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室，江蘇 無錫214122；3.江南大學(xué) 糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國家工程實驗室，江蘇 無錫 214122；4.江南大學(xué) 糖化學(xué)與生物技術(shù)教育部重點實驗室，江蘇 無錫214122；5.江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無錫214122）

利用海藻酸鈉固定化蛋白酶，探求其對牛奶過敏原αs1-酪蛋白的特異性降解。以固定化酶的活力回收率為指標(biāo)，探究了固定化的條件、固定化酶的部分性質(zhì)以及固定化酶在去除牛奶過敏原蛋白的應(yīng)用。結(jié)果表明：最優(yōu)固定化條件為，海藻酸鈉質(zhì)量分數(shù)為4.0%，CaCl2的質(zhì)量分數(shù)為3.0%，固定化時間0.5 h，固定化酶量為V（海藻酸鈉）∶V（酶液）為1∶3，固定化效率達到67.5%；固定后的酶最適反應(yīng)溫度70℃，最適反應(yīng)pH 10.0，連續(xù)使用6次后剩余酶活達到40.0%以上；將固定化酶作用于2.0%脫脂奶粉溶液中，60℃條件下反應(yīng)25min過敏原αs1-酪蛋白得到特異性降解。

海藻酸鈉；固定化酶；αs1-酪蛋白；過敏原

牛奶是一種營養(yǎng)豐富的全蛋白質(zhì)，是優(yōu)質(zhì)的營養(yǎng)食品。牛奶蛋白主要是由酪蛋白和乳清蛋白組成，其中酪蛋白約占牛乳蛋白的80.0%。而αs1-酪蛋白是牛乳中主要酪蛋白，在脫脂乳中約占全酪蛋白）的38.0%。αs1-酪蛋白由199個氨基酸組成，并可與鈣、鐵、銅、鋅等金屬離子結(jié)合形成可溶性物質(zhì)，促進金屬離子在體內(nèi)的吸收［1］。由于母乳中不含有αs1-酪蛋白，使得其成為牛乳中重要的過敏原蛋白之一，而且牛奶過敏嬰兒存在著發(fā)生哮喘、濕疹、過敏性鼻炎等特應(yīng)性疾病的風(fēng)險［2-3］?；诖?，尋求合適的降解牛奶過敏原的方法日益重要。目前常用于去除牛奶過敏原蛋白的熱處理、糖基化、發(fā)酵等方法對牛奶營養(yǎng)和風(fēng)味具有一定的影響，同時其對過敏原蛋白的降解特異性不強［4］。采用酶法降解具有相對專一性并且作用迅速，但主要集中在對α-乳清蛋白和β-乳球蛋白的降解［5］。作者組前期篩選得到一株優(yōu)先降解αs1-酪蛋白的菌株，但其游離酶穩(wěn)定性差，難以回收［6］，易混入牛奶溶液中難以去除等，使得應(yīng)用受到一定的限制。采用固定化酶技術(shù)不僅保留了游離酶的優(yōu)點，而且可以克服游離酶催化反應(yīng)不連續(xù)化以及不易回收的缺點，因而具有更加廣闊的前景［7］。

目前固定化酶的制備方法主要有包埋法、交聯(lián)法、共價鍵結(jié)合法和吸附法等［8］，其中包埋法反應(yīng)條件溫和，不需要化學(xué)修飾蛋白酶的氨基酸殘基，而且對酶分子結(jié)構(gòu)改變少，酶活力損失小等優(yōu)點。在固定化酶常用的包埋材料中海藻酸鈉最為常見，具有固化、成形方便，材料安全等優(yōu)勢。由于Ca2+可與海藻酸鈉反應(yīng)生成海藻酸鈣微凝膠，安全無毒并具有有良好的生物相溶性，可以在溫和條件下實現(xiàn)對酶的固定，有助于保持酶的生物活性。此外海藻酸鈉原材料價格低廉、材料易得等特點［9］，因而受到廣泛重視，已應(yīng)用于食品加工、藥物緩釋、生物工程等領(lǐng)域。

作者利用海藻酸鈉為載體對已純化獲得的堿性蛋白酶進行固定化，分析固定化條件對蛋白酶活性的影響，同時對固定化酶的酶學(xué)性質(zhì)進行初步探討，并研究固定化酶對牛奶過敏原αs1-酪蛋白的特異性降解，為獲得低敏牛奶制品提供參考。

1　材料與方法

1．1主要材料與試劑

1.1.1試劑酪蛋白：分析純，上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司產(chǎn)品；海藻酸鈉：化學(xué)純，中國醫(yī)藥（集團）上?；瘜W(xué)試劑公司產(chǎn)品；氯化鈣：分析純，中國醫(yī)藥（集團）上?；瘜W(xué)試劑公司產(chǎn)品；三氯乙酸等試劑為國產(chǎn)分析純。

1.1.2儀器紫外分光光度計（UV2450）：日本島津公司產(chǎn)品；電熱恒溫水浴鍋：江蘇省醫(yī)療器械廠產(chǎn)品；PHS-3C型酸度計：杭州亞美電子儀器廠產(chǎn)品；電泳儀：美國Bio-Rad公司產(chǎn)品。

1.1.3堿性蛋白酶Bacillus Licheniformis CN1菌

株經(jīng)發(fā)酵后純化獲得。

1．2實驗方法

1.2.1蛋白酶的活力測定

1）游離酶活性測定采用福林—酚試劑法測定蛋白酶活力［10］。酶活力單位定義：一個酶活力單位是指在一定實驗條件下 （pH 10.0，60℃時，2.0 g/L酪蛋白作底物，反應(yīng)時間10 min）水解酪蛋白產(chǎn)生lμg酪氨酸時所需要的酶量，單位U/mL。

2）固定化酶活力測定一定體積的酶液經(jīng)固定化后加入一定體積pH 10.0的硼酸鈉緩沖液，使其處于pH 10.0的體系中，方法與游離酶活力測定相同。酶活力回收率=（固定化酶的總活力/游離酶的總活力）×100%。固定化酶的相對酶活是指在同組試驗中以活性最高為100%。

1.2.2固定化堿性蛋白酶的制備參照文獻［11］制備固定化蛋白酶。首先稱取一定量的海藻酸鈉溶于一定體積的蒸餾水溶液中，加熱完全溶解后放置室溫，冷卻至35℃左右，加入一定比例的堿性蛋白酶混勻，4℃冰箱靜置一段時間至溶液混合均勻，用5 mL注射器滴入到一定濃度的CaCl2溶液中，磁力攪拌一定時間后，用去離子水洗滌3次，濾紙濾干水分。4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3固定化酶在牛奶蛋白中的應(yīng)用利用蛋白電泳直觀檢測牛奶過敏原蛋白條帶的消失程度。通過在質(zhì)量分數(shù)2.0%的脫脂奶粉溶液里添加一定量的固定化酶，調(diào)節(jié)脫脂奶粉溶液的pH值以及反應(yīng)溫度，反應(yīng)不同時間后高溫終止反應(yīng)，然后進行SDS-PAGE電泳［12］。

2　結(jié)果與討論

2.1固定化酶的制備

2.1.1海藻酸鈉質(zhì)量分數(shù)的確定將一定量酶液與不同質(zhì)量分數(shù)的海藻酸鈉溶液混合，測定固定化酶的活性。

圖1　海藻酸鈉質(zhì)量分數(shù)對固定化酶活性的影響Fig.1　Effects of sodium alginate concentration on the relative activity of immobilized enzyme

由圖l可知，當(dāng)海藻酸鈉質(zhì)量分數(shù)為4.0%時，固定化酶活力最大。當(dāng)海藻酸鈉質(zhì)量分數(shù)達到5.0%后，其黏度很大，難以擠成球狀，影響凝膠成型，同時凝膠的孔徑也小，影響酶與底物的結(jié)合。反之海藻酸鈉質(zhì)量分數(shù)太小，凝膠的孔徑較大，固定化酶容易流失。因此選擇機械強度適宜的凝膠，同時有利于底物和產(chǎn)物從凝膠微孔擴散通過，保證酶促反應(yīng)速度，結(jié)合圖1，選擇海藻酸鈉質(zhì)量分數(shù)為4.0%。

2.1.2CaCl2質(zhì)量分數(shù)的確定CaCl2的質(zhì)量分數(shù)對形成凝膠的機械強度有重要影響。當(dāng)CaCl2質(zhì)量分數(shù)達到5.0%后，形成的凝膠表面將會分布的Ca2+較多，由于Ca2+會與酶作用位點競爭性結(jié)合，從而降低酶活性，若太少又導(dǎo)致凝膠強度太小，包埋不夠徹底，使其包埋在內(nèi)部的部分蛋白酶流失，影響酶的活性。由圖2可知，當(dāng)CaCl2質(zhì)量分數(shù)為3.0%時，固定化酶活性達到最佳。

圖2　CaCl2的質(zhì)量分數(shù)對固定化酶活性的影響CaCl2Fig.2　Effects of CaCl2concentration on the relative activity of immobilized enzyme

2.1.3固定化時間的確定固定化時間是指海藻酸鈉與固定化酶的混合液滴落到CaCl2溶液中的反應(yīng)時間。按照上述實驗條件，取酶液與海藻酸鈉溶液混勻，滴入3.0%的CaCl2溶液中，固定不同時間，測定固定化酶活力，結(jié)果如圖3所示。隨著固定化時間的延長，其回收率逐漸降低，酶在CaCl2溶液中固定化時間的最佳選擇為0～1.0 h，以便保證得到較高的固定化酶酶活。固定化時間越長，海藻酸鈉與氯化鈣的反應(yīng)就越完全，形成的海藻酸鈣凝膠珠就越致密，對固定化蛋白酶的活性起到了部分抑制的作用［13］。

圖3　固定化時間對固定化酶活性的影響Fig.3　Effects of immobilized time on the relative activity of immobilized enzyme

2.1.4固定化酶量的確定用于固定化的酶量直接關(guān)系到固定化酶的活力，酶的加入量亦有一最佳值，將酶液量與質(zhì)量分數(shù)為4%海藻酸鈉溶液按不同體積比進行固定，固定化時間選擇為0.5 h，測定固定化酶的活力，結(jié)果如圖4所示。海藻酸鈉與酶液按照體積比1∶3的比例進行固定化，酶活回收率最高，過多的酶液會導(dǎo)致游離酶的浪費，而少量的海藻酸鈉則不能與酶液充分結(jié)合，造成固定化酶的效率下降。

圖4　固定化酶量對固定化酶活力的影響Fig.4　Effects of different enzyme amounts on the relative activity of immobilized enzyme

2.2固定化堿性蛋白酶的酶學(xué)性質(zhì)

2.2.1pH對固定化酶和游離酶活力的影響控制反應(yīng)溫度為60℃，在不同pH的磷酸緩沖溶液中測定固定化酶和溶液酶活力，結(jié)果如圖5所示。圖5 中pH對固定化酶和游離酶活力的影響不大，其最適pH均在10.0左右，但固定化酶對pH的穩(wěn)定性減弱，對pH相對更敏感。將固定化酶放置于不同pH緩沖液中常溫1 h后測定其殘余酶活，以固定化酶在pH 10.0測定的酶活為100%，固定化酶在不同pH體系中放置1 h后其酶活幾乎不變，說明固定化酶具有一定的pH耐受性。

圖5　pH對固定化酶和游離酶活力的影響Fig.5　Effects　of pH　on　the　relative　activity　of immobilized and liquid enzyme

2.2.2溫度對固定化酶和游離酶活力的影響溫度對固定化酶和游離酶活力影響較大，固定化酶的最適反應(yīng)溫度較游離化酶提高10℃，耐熱性增強。在較高溫度下保持酶活具有一定的優(yōu)勢。對于在中高溫條件下進行的反應(yīng)，固定化酶具有一定的優(yōu)勢。在50、60、70℃下測定固定化酶的熱穩(wěn)定性，在50、60℃的條件下反應(yīng)1 h后其酶活損失較少，基本保持一致，但在70℃的條件下，酶活在10min后迅速下降，由此可以認定固定化酶的最適反應(yīng)溫度應(yīng)控制在60℃左右，此溫度對于中高溫的反應(yīng)具有一定的優(yōu)勢。結(jié)果見圖6。

圖6　溫度對固定化酶和游離酶活力的影響Fig.6　Effects of temperature on the relative activity of immobilized and liquid enzyme

2.2.3固定化酶的低溫穩(wěn)定性將固定化酶放于4℃冰箱中，每隔2 d分別測定酶活，結(jié)果見圖7。由圖7可以看出：固定化酶放置10 d后酶活下降到原來的85.2%，放置20 d后保留78.5%，說明在4℃下，固定化酶相對穩(wěn)定，有利于進行短期保存，并且相對于游離酶而言具有更久的儲存能力。

圖7　貯存時間對固定化酶的影響Fig.7　Effects of storage stability on the relative activity of immobilized enzyme

2.2.4固定化酶的操作重復(fù)性測定循環(huán)使用固定化酶的酶活來計算固定化酶的操作穩(wěn)定性。將每次反應(yīng)后的固定化酶利用pH 10.0的緩沖液沖洗干凈，并用濾紙吸干其水分后進行后續(xù)測定，連續(xù)測定7次，結(jié)果如圖8。隨著循環(huán)次數(shù)的增加，相對酶活力降低，連續(xù)使用7次后酶活保留原來的21.0%。造成酶活力損失的原因可能是，載體受到磨損，酶從海藻酸鈉載體上脫落，或是酶的作用位點隨著水解酪蛋白的不斷進行而逐漸暴露，容易遭到破壞。實驗結(jié)果表示，固定化酶循環(huán)使用5次后，酶活力仍可保持原來的53.8%。相對游離酶而言其總酶活得到提高，降低了酶的生產(chǎn)成本。

圖8　利用次數(shù)對固定化酶的影響Fig.8　Effects of repeat times on the relative activity of immobilized enzyme

2.3固定化酶在降解牛奶αs1-酪蛋白的應(yīng)用

將固定化的蛋白酶按照一定比例添加到質(zhì)量分數(shù)2.0%脫脂奶粉溶液中進行反應(yīng)，以未添加的脫脂奶粉溶液作為對照，定時取樣進行SDS-PAGE電泳，控制反應(yīng)溫度在不同的溫度條件下進行反應(yīng)，獲得其優(yōu)先性降解牛奶過敏原的最佳溫度，使其能夠?qū)^敏原蛋白具有最大的降解，同時保留牛奶中其他蛋白營養(yǎng)成分。選取了溫度為50、60、70℃進行反應(yīng)，結(jié)果如圖9和圖10。固定化酶在pH 10.0的堿性條件下對脫脂奶粉溶液的降解能力優(yōu)于pH 7.0的中性條件，與以酪蛋白為底物測得的最適pH保持一致。在pH 10.0的條件下，固定化酶對酪蛋白的降解順序為優(yōu)先降解αs1-酪蛋白和β-酪蛋白，而在pH 7.0的條件下其主要降解β-酪蛋白，對αs1-、αs2-酪蛋白 幾乎不降解，說明pH對固定化酶對αs1-酪蛋白的降解具有重要作用。在pH 10的脫脂奶粉溶液中控制反應(yīng)溫度60℃，反應(yīng)25 min的時間范圍內(nèi)，達到對牛奶αs1-酪蛋白 的優(yōu)先性降解，達到特異性降解牛奶過敏原αs1-酪蛋白的效果。

圖9　50℃下固定化酶對脫脂牛奶蛋白的降解Fig.9　SDS-PAGE profile of skim m ilk hydrolyzed by immobilized enzyme at different pH values under 50℃

圖10　70℃下固定化酶對脫脂牛奶蛋白的降解Fig.10　SDS-PAGE profile of skim m ilk hydrolyzed by immobilized enzyme at different pH values under 70℃

3　結(jié)語

用包埋法固定此蛋白酶應(yīng)用于降解牛奶過敏原蛋白中，所用載體海藻酸鈉安全無毒，而且價格低廉，同時制備過程簡單，成本低，條件溫和。將固定化酶應(yīng)用到牛奶蛋白溶液中，不影響牛奶制品的使用，而且可以實現(xiàn)多次使用并方便回收，并能夠達到對牛奶過敏原αs1-酪蛋白的特異性降解，具有較好的應(yīng)用前景。但是此方法距離工業(yè)化應(yīng)用還具有一段距離，今后將通過分子改造的手段以及與不同的改性技術(shù)相結(jié)合，以達到更好地特異性降低αs1-酪蛋白致敏性的效果。

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A llergenicity Investigation of Hydrolyzedαs1-Casein in Bovine M ilk by Immobilized Protease

RU Chengye1，2，5， ZHANG Juan2，5， DU Guocheng4，5， CHEN Jian3，5，LIJianghua*2，5
（1.Synergetic Innovation Center of Food Safety and Nutrition，Wuxi 214122，China；2.Key Laboratory of IndustrialBiotechnology，M inistryofEducation，JiangnanUniversity，Wuxi214122，China；3.National Engineering Laboratory for Cereal Fermentation Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China；4.The Key Laboratory of Carbohydrate Chemistry and Biotechnology，M inistry of Education，Jiangnan University，Wuxi 214122，China；5.School of Biotechnology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China）

Proteasewas immobilized using sodium alginate as the carrier.The specific degradation of milk allergen（αs1-casein）was investigated.The immobilization conditions of protease，properties of immobilized enzyme and application inm ilk allergen removalwere studied using the immobilized enzyme activity recovery rate as an index.The immobilization efficiency reached up to 67.5%under the optimal condition of immobilization achieved w ith 4.0%sodium alginate（ratio of mass to volume），3%CaCl2（ratio ofmass to volume），the volume of sodium alginate and protease of1∶3 and 0.5 h for immobilization reaction at pH 10.0 under 70℃.The activity of immobilized enzymewas retained over 40%used after six cycles.Them ilk allergenαs1-casein was specifically degraded when the immobilized protease adding to 2.0%w t skim m ilk solution at pH 10.0 under 60 ℃for25m inute.

sodium alginate，immobilized enzyme，αs1-casein，allergy

TS 252

A

1673—1689（2016）04—0387—06

2014-11-25

國家863計劃項目（2011AAl00905）；國家973計劃項目（2013CB733902）；國家自然科學(xué)基金項目（31470160）；江蘇省自然科學(xué)基金項目（BK2012553）；中國博士后科學(xué)基金項目（114957）。

李江華（1966—），男，江西九江人，工學(xué)博士，教授，主要從事酶技術(shù)、發(fā)酵過程優(yōu)化與控制研究。E-mail．lijianghua@jiangnan.edu.cn