張永欣，趙斐，王臻，張瑞欣，周金明，岑山

·論著·

以分泌型熒光素酶為報告基因的單輪感染流感病毒的構建

張永欣*，趙斐*，王臻，張瑞欣，周金明，岑山

目的構建以分泌型熒光素酶為報告基因的單輪感染流感病毒用于藥物作用機制的快速鑒別。

方法通過使用分泌型熒光素酶（Gluc）序列替代流感病毒HA 基因，并利用表達質粒反式提供 HA 蛋白，借助甲型流感病毒 WSN 反向遺傳學產毒系統(tǒng)，構建帶有報告系統(tǒng)的單輪感染流感病毒。

結果首輪接種單輪感染流感病毒的細胞上清中可以檢測到 Gluc 信號，但檢測不到病毒滴度，而在第二輪感染的細胞上清中檢測不到 Gluc 信號，表明該單輪感染病毒在感染過程中能夠分泌 Gluc 蛋白并且不能產生具有感染性的子代病毒顆粒。通過對復制動力學和時相的觀察，明確了單輪感染病毒的生活周期，同時結合 4 種已知作用機制的抗流感藥物的阻斷實驗結果，證明該系統(tǒng)可以用來快速、有效地鑒別藥物的作用機制。

結論成功構建了以分泌型熒光素酶為報告基因的單輪感染流感病毒，該系統(tǒng)可以用于抗病毒藥物作用機制的快速鑒別。

流感病毒 A 型；藥物評價， 臨床前；單輪感染病毒；Gluc 報告基因

www.cmbp.net.cn中國醫(yī)藥生物技術， 2016， 11（4）：300-307

甲型流感病毒是急性呼吸道傳染性疾病的主要病原體之一。臨床上預防和治療流感的手段主要有疫苗和抗流感藥物，但是由于流感病毒具有極強的重組變異和抗原漂移能力，嚴重地限制了流感疫苗的免疫保護作用。同時，目前的流感病毒流行株對臨床一線抗流感藥物也產生了不同程度的耐藥［1-2］，因此亟需尋找新的抗流感藥物靶標和發(fā)展新型抗流感病毒藥物。

抗流感病毒藥物研發(fā)過程中，藥物作用機制研究是其中一個重要方面。由于流感病毒復制周期比較短，病毒的多輪感染對藥物作用環(huán)節(jié)的確定造成較大干擾。因此，通過構建單輪感染流感病毒，對其藥物作用時相進行觀察，可以快速、有效地鑒別藥物的作用機制；同時，將單輪感染模型應用于高致病性流感毒株，可以降低操作的危險性以及對實驗條件的要求。

甲型流感病毒的生活周期包括病毒吸附，脫衣殼，病毒核糖核蛋白（vRNPs）轉運入核，基因組轉錄和復制，病毒蛋白合成，vRNPs 核輸出、組裝和釋放等過程［3］。病毒顆粒經過 HA 介導［4］的吸附、進入等環(huán)節(jié)后在細胞質中完成脫衣殼過程，病毒 vRNPs 釋放進入細胞質，隨后入核，在核內啟動轉錄和復制過程。轉錄產生的病毒 mRNA 翻譯成病毒蛋白，復制產生的 vRNA 與新合成的病毒蛋白組裝成 vRNPs 后出核，運送至細胞膜的出芽位點。病毒各組分在出芽位點組裝成完整的病毒顆粒后出芽釋放，完成流感病毒整個生活史。

研究表明在病毒包裝細胞中給 HA 缺陷的流感病毒反式提供 HA 蛋白，獲得的重組病毒可以有效地感染細胞，但其子代病毒沒有感染性［5］。例如，K?nig 等［6］用海腎熒光素酶編碼基因替代了 HA的編碼區(qū)，構建了可以表達海腎熒光素酶的單輪感染流感病毒。本研究借鑒上述報告的工作原理，結合分泌型的 Gaussia 熒光素酶，構建了單輪感染的流感病毒，進而將其應用于藥物作用機制的快速檢測。雖然類似的分析方法在流感病毒基礎研究中已有應用［7］，但是將其應用于藥物作用機制的研究尚屬首次，同時分泌型報告基因極大地簡化了分析程序。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1質粒pHW181-PB2、pHW182-PB1、pHW183-PA、 pHW185-NP、 pHW186-NA、pHW187-M、pHW188-NS 分別為流感病毒H1N1/WSN/33 的 PB2、PB1、PA、NP、NA、M 和NS 蛋白的表達質粒，獲贈于 Dr. Robert G. Webster［8］。pHH-Gluc 質粒獲贈于 Dr. Erik de Vires［9］。在 pHW184-Gluc 質粒中，Gaussia 熒光素酶基因的編碼序列反向插入取代了流感病毒H1N1/WSN/33 HA 節(jié)段的編碼區(qū)。將 HA 的編碼序列插入到 pCAGGS 載體中構建得到表達 HA蛋白的質粒 pCAGGS-HA-IRES-puro。

1.1.2主要試劑腔腸素 h 購自美國 Promega公司；Flu-M1 鼠單克隆抗體（貨號：SC-69824）、Flu-HA 鼠單克隆抗體（貨號：SC-52025）、β-actin 鼠單克隆抗體（貨號：SC-47778）購自美國 Santa Cruz公司；辣根過氧化物酶（HRP）標記山羊抗小鼠 IgG（貨號：ZB-2305）、TRITC 標記山羊抗小鼠 IgG（貨號：ZF-0313）購自北京中杉金橋有限公司；Trizol 購自美國 Invitrogen 公司；一步法熒光定量PCR 反應試劑盒購自日本 Takara 公司。

1.1.3儀器Gradient Thermal Cycler PCR 儀購自美國 Bio-Rad 公司；Centro XS3 LB 960 酶標儀購自德國 Berthold 公司；Stratagene MX3000P 實時熒光定量 PCR 儀購自美國 Agilent 公司；HC Power Supply 蛋白電泳儀購自美國 Bio-Rad 公司；LSM 710 激光共聚焦掃描顯微鏡購自德國Zeiss 公司。

1.2方法

1.2.1流感病毒制備在直徑 100 mm 培養(yǎng)皿中同時接種 293T 細胞和可以穩(wěn)定表達流感 HA 蛋白的 MDCK-HA 細胞。培養(yǎng) 24 h 后，轉染流感病毒7 質粒和 pHW184-Gluc 及 pCAGGS-HA-IRES-puro質粒。36 h 后收集上清，離心后過濾，濃縮，分裝，保存于 -80 ℃ 冰箱。

1.2.2細胞培養(yǎng)及感染A549 細胞培養(yǎng)于含10% 胎牛血清的 DMEM 培養(yǎng)基，接種于 6 孔板（細胞數(shù) 4 × 105個/孔）。培養(yǎng) 24 h 后以 MOI = 1接種病毒，24 h 后收集上清或者細胞。

1.2.3Gluc活性測定Gluc 活性檢測依照文獻［10］的方法操作。首先在 PBS 溶液中溶解腔腸素h，配制成濃度為 16.7 μmol/L 的腔腸素 h 底物，室溫避光孵育 30 min。同時，取 5 μl 待測上清液放入白色不透明、平底的 96 孔板中，再加入 35 μl PBS 溶液。使用酶標儀進行熒光強度測定。檢測時，由于反應產物半衰期極短，使用進樣器將避光孵育的底物按每孔 60 μl 的進樣量逐孔加入并收集信號，檢測 Gluc 的相對活性。

1.2.4Western blot 檢測收集細胞于 6 孔板，每孔加入細胞裂解液 100 μl，冰浴 0.5 h 裂解細胞。提取細胞總蛋白，進行 SDS-PAGE 電泳，轉膜，抗體孵育及 ECL 顯色。

1.2.5病毒感染力（TCID50）測定單輪感染的流感病毒滴度檢測借助穩(wěn)定表達流感 HA 蛋白的MDCK 細胞，參照文獻［11］進行 TCID50檢測。1.2.6實時熒光定量 PCR 檢測病毒基因的mRNA 表達水平按照試劑盒說明書，提取細胞總RNA。使用一步法熒光定量 PCR 反應試劑盒以管家基因 gapdh 為內參，用 2-ΔΔCt法［12］對待測基因mRNA 水平進行相對定量。

1.2.7激光共聚焦實驗病毒感染 A549 細胞后先于 4 ℃ 同步化吸附 1 h 再換成預熱的 DMEM培養(yǎng)基，置于 37 ℃，5% CO2孵箱中按照實驗需要培養(yǎng)一段時間后免疫熒光處理并觀察。一抗使用濃度為 1∶1000 的 Flu-NP 鼠單克隆抗體，二抗為TRITC 標記的山羊抗小鼠 IgG（1∶200）。

1.2.8時間添加實驗A549 細胞鋪 24 孔板，每孔接種 1 × 105個細胞。細胞培養(yǎng) 24 h 后，加入單輪感染流感病毒，4 ℃ 同步化吸附 1 h，用預冷的 PBS 清洗 3 遍，每孔加入 300 μl 37 ℃ 預熱的含 2% FBS 的 DMEM 培養(yǎng)基。以病毒吸附完成為 0 點，在 -1 ～ 0 h，0 ～ 2 h，2 ～ 4 h，4 ～ 6 h，6 ～8 h，8 ～ 10 h 分別加入不同作用機制的抗流感藥物，感染 12 h 后收集細胞上清，檢測 Gluc 信號。

2　結果

2.1帶有 Gluc 報告基因的單輪感染流感病毒的構建

流感病毒基因組為負鏈 RNA，因此使用 Gluc編碼序列的反向互補序列替換 pHW184-HA 質粒的編碼區(qū)（圖 1A）。同時將 HA 的編碼序列插入到哺乳動物表達載體 pCAGGS 上（圖 1B）。將上述兩個質粒連同編碼流感病毒其他蛋白的 7 個質粒共轉染細胞后，包裝得到的流感病毒含有完整的病毒外殼，但基因組中的 HA 節(jié)段被編碼分泌型Gluc 蛋白的序列所取代。該假病毒可以正常地感染宿主細胞，產生分泌型熒光素酶，但在感染過程中無法表達 HA 蛋白，因此不能包裝、釋放完整的子代病毒顆粒進行下一輪感染，所以稱為單輪感染流感病毒（圖 1C）。

圖1　單輪感染流感病毒的構建方案（A：pHW184-Gluc 質粒示意圖；B：pCAGGS-HA-IRES-puro 質粒示意圖；C：單輪感染流感病毒感染細胞后可分泌 Gluc 熒光素酶，但不能包裝產生具有感染性的子代顆粒）Figure 1　The scheme of the assay （A： Schematic representation of pHW184-Gluc； B： Schematic representation of pCAGGS-HA-IRES-puro； C： The single-cycle virus could express secreted Gluc during infection， but not produce infectious progenies）

為了驗證構建的單輪感染流感病毒的可靠性，分別用單輪感染流感病毒和野生型流感病毒感染6 孔板中的 A549 細胞，24 h 后收集上清檢測Gluc 信號以及病毒的滴度。同時將收集到的上清再去感染 A549 細胞，24 h 后收集上清再次檢測Gluc 信號和病毒滴度。

結果如圖 2A 所示，只有首輪感染單輪流感病毒的實驗組可以檢測到 Gluc 信號，實驗組收集的上清再次感染細胞后無明顯的 Gluc 信號；對照組野生型流感病毒不含有 Gluc 報告基因因而無Gluc 信號。圖 2B 中，分別檢測病毒接種液、初次感染后以及再次感染后所收集上清的病毒滴度發(fā)現(xiàn)，單輪感染流感病毒感染細胞后收集的上清均檢測不到病毒滴度，不具有感染性；而野生型流感病毒感染細胞后收集的上清滴度雖然較接種液有所降低，但仍然具有一定的感染性。以上結果表明，我們成功地構建了可以表達 Gluc 蛋白的單輪感染流感病毒，該病毒在感染過程中能夠分泌 Gluc蛋白并且不能產生具有感染性的子代病毒顆粒。

為了進一步證實該病毒的單輪感染是由于 HA蛋白的缺失造成的，將上述實驗收集到的細胞裂解液進行 Western blot 分析，分別檢測流感病毒的M1 蛋白和 HA 蛋白。結果顯示，野生型流感病毒感染的細胞中均能檢測到 M1 和 HA 蛋白；而在單輪感染流感病毒的第一輪感染中，只有 M1 蛋白能被檢測到，HA 蛋白未被檢出，從而證明我們構建的單輪感染流感病毒是由于基因組中的 HA 編碼序列被取代，導致子代病毒的包膜中缺失 HA 蛋白無法進行下一輪感染，達到單輪感染的目的（圖2C、2D）。

2.2單輪感染流感病毒的復制動力學

為了觀察單輪感染流感病毒的復制動力學過程，分別用單輪感染流感病毒和野生型流感病毒感染 A549 細胞，同步化吸附后于不同的時間點取樣檢測 Gluc 信號以及病毒 mRNA 的含量。如圖 3A 所示，單輪病毒感染 4 ～ 6 h 后，Gluc 信號出現(xiàn)明顯上升，10 ～ 12 h 到達平臺期；在圖 3B中，單輪感染病毒 mRNA 的水平在 2 ～ 10 h 逐漸升高，10 h 以后逐漸達到平衡，其趨勢與 Gluc 結果相一致。在感染的早期（2 ～ 4 h），Gluc 信號升高的程度略低于 mRNA，估計與蛋白翻譯滯后于RNA 轉錄有關。野生型流感病毒 mRNA 水平在感染 2 h 后顯著上升，在 10 h 之內與單輪感染病毒的復制動力學曲線基本吻合，而且在 10 h 后仍處于持續(xù)升高的過程，與其持續(xù)性多輪感染的過程相符合。

圖2　單輪感染流感病毒的可靠性檢驗 （A：檢測上清的 Gluc 活性；B：檢測上清的病毒滴度；C：檢測細胞裂解液中的流感 M1 蛋白；D：檢測細胞裂解液中的流感 HA 蛋白）Figure 2　Verification of the single-cycle infectious influenza virus （A： Measurement of Gluc activity； B： Measurement of supernatant titer； C： Western blot analysis of M1 protein； D： Western blot analysis of HA protein）

圖3　單輪感染流感病毒的復制動力學曲線（A：以 Gluc 活性為標準繪制的動力學曲線；B：以病毒 mRNA 水平為標準繪制的動力學曲線）Figure 3　Replication dynamics of the single-cycle infectious influenza virus （A： Measurement of Gluc activity； B： Measurement of viral mRNA level by qRT-PCR）

2.3單輪感染流感病毒的復制時相

單輪感染病毒的生活周期包括病毒吸附、脫衣殼、vRNPs 入核、基因組轉錄和復制、病毒蛋白合成、vRNPs 核輸出等過程。為了明確各個階段的時間范圍，探尋單輪感染病毒的復制時相，為后期抗病毒藥物作用機制的快速鑒別提供理論依據(jù)，我們用單輪感染流感病毒和野生型流感病毒分別感染A549 細胞，同步化吸附后通過免疫熒光觀察不同時間階段 NP 蛋白的定位。我們發(fā)現(xiàn)在野生型流感病毒感染的對照組中，同步化吸附后 4 h 可在部分細胞核中觀察到 NP 蛋白。感染 4 ～ 8 h 后細胞核中的 NP 蛋白呈現(xiàn)大幅度上升，8 ～ 10 h 后胞漿中出現(xiàn) NP 蛋白的累積。24 h 后由于細胞病變，細胞核的形態(tài)發(fā)生改變。在單輪感染病毒的實驗組中，感染 6 h 后部分細胞核中出現(xiàn) NP 蛋白，6 ～10 h 后細胞核中的 NP 蛋白大量增多，24 h 后NP 蛋白分布于胞質中，細胞形態(tài)沒有較大改變（圖 4）。圖 3B 結果顯示，病毒 mRNA 水平在感染 4 h 后才出現(xiàn)明顯升高，提示早期核內定位的NP 蛋白應為轉運入核的 vRNPs。NP 蛋白在早期階段主要參與基因組的轉錄和復制，晚期階段參與vRNPs 的組裝及出核。由此我們推斷單輪感染流感病毒的復制時相為：病毒吸附宿主細胞后，4 h 之內完成脫衣殼，入核，并進行基因組轉錄和復制，6 ～ 10 h 病毒蛋白逐漸合成，隨后新組裝的 vRNPs出核轉運到胞漿。子代病毒因缺失 HA 蛋白而無法繼續(xù)完成病毒的生活周期。該復制時相也與病毒復制動力學的觀察結果相一致。

2.4單輪感染流感病毒鑒別藥物作用機制的應用

圖4　應用免疫熒光技術確定單輪感染流感病毒的復制時相Figure 4　Replication phases of the single-cycle infectious influenza virus measured by immunofluorescence

圖5　4 種作用機制明確的抗流感藥物證明藥物作用機制與作用時間的相關性（A：利巴韋林；B：奧司他韋；C：金剛烷胺；D：T-705）Figure 5　Inhibition test with 4 kinds of anti-flu drugs to confirm the relation between action mechanism and adding time of agents （A： Ribavirin； B： Oseltamir； C： Amantadine； D： T-705）

為了驗證構建的單輪感染病毒是否可以用于鑒別藥物的作用機制，我們用不同作用機制的抗流感藥物，通過時間添加實驗，考察藥物的抗病毒活性。在感染的不同時間段分別加入利巴韋林（抑制GTP 合成）、奧司他韋（NA 抑制劑）、金剛烷胺（抑制病毒脫衣殼）、T-705（抑制基因組轉錄復制）。圖 5 結果顯示，加入利巴韋林的實驗組中，只有2 ～ 4 h 的藥物作用組 Gluc 信號降低，說明利巴韋林主要抑制基因組復制的初始階段，對復制的合成階段作用不明顯，這與其競爭性抑制單磷酸肌苷（IMP）脫氫酶，阻斷 GTP 從頭合成途徑的作用機制相符合［13］。加入奧司他韋的實驗組中，-1 ～ 4 h的藥物作用組 Gluc 信號降低，其中以 0 ～ 2 h 作用組信號降低最為顯著，說明 NA 被奧司他韋抑制后，與受體結合的病毒顆粒的釋放受到顯著影響。由于 NA 在識別細胞受體、促進病毒進入等過程中也發(fā)揮一定的作用，所以在 -1 ～ 0 h 和 2 ～ 4 h 的藥物作用階段也表現(xiàn)出信號的降低；加入金剛烷胺的實驗組中，只有 0 ～ 2 h 的藥物作用組 Gluc 信號明顯降低，說明病毒脫衣殼過程發(fā)生在病毒進入后的早期階段（感染后 2 h 之內），時間節(jié)點與上述復制周期的觀察結果十分吻合。加入 T-705 的實驗組中，0 ～ 6 h 的各藥物作用組均出現(xiàn)水平相當?shù)腉luc 信號降低，提示該階段是病毒 RNA 復制與轉錄的主要時期［14］。值得關注的是，盡管病毒 RNA 在 6 ～ 10 h 仍然持續(xù)上升（圖 3），但 T-705 在該階段加入后并未表現(xiàn)出 Gluc 的抑制活性。這一結果提示在病毒 RNA 合成的晚期階段（6 ～ 10 h）有可能主要為基因組復制階段，并非為蛋白翻譯提供mRNA［15］。綜合上述 4 種藥物的阻斷實驗結果我們得出：抑制 GTP 合成的藥物作用時間為 2 ～4 h，抑制 NA 活性的藥物作用時間為 -1 ～ 4 h，抑制病毒脫衣殼藥物的作用時間為 0 ～ 2 h，抑制病毒基因組轉錄復制藥物的作用時間為 0 ～ 6 h。結合單輪感染病毒復制時相的結果我們認為，藥物阻斷實驗的結果可以有效地證實藥物的作用機制，并且實驗周期較短（＜ 48 h），因此單輪感染流感病毒可以作為一種快速、有效的鑒別藥物作用機制的手段。

3　討論

我們通過 Gluc 序列替代流感 HA 基因，并使用表達質粒反式提供 HA 蛋白，借助流感 8 質粒產毒系統(tǒng)，構建了帶有報告系統(tǒng)的單輪感染流感病毒，并證實了該病毒感染細胞后一方面可以有效地表達報告基因，另一方面子代病毒由于不含有完整的包膜結構因而只存在單輪感染。接著通過對復制動力學和時相的觀察，確定了單輪感染流感病毒在細胞內的生活周期，對其在細胞內的生物學進程有了明確的掌握。通過不同時間段的藥物阻斷實驗，證實了構建的單輪感染流感病毒可以用來快速、有效地鑒別藥物的作用機制，輔助傳統(tǒng)的抗流感病毒藥物篩選中藥物作用機制的研究。另外通過構建能夠穩(wěn)定表達流感 HA 蛋白的 MDCK-HA 細胞系，使其反式提供 HA 蛋白完成子代病毒的包裝，不僅大大簡化了單輪病毒的產毒過程，而且實現(xiàn)了在病毒完整生活周期中對藥物作用機制的篩選。綜上所述，本文構建的單輪感染流感病毒，借助分泌型的Gaussia 熒光素酶，不僅為藥物作用機制的研究提供了一個新型、快捷的研究手段，同時我們設想將構建單輪感染流感病毒的手段應用到高致病性禽流感病毒上，進一步擴大抗病毒藥物的研究范圍，減少高致病性禽流感病毒操作的危險性以及對實驗條件的要求。

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【Abstract】

ObjectiveTo construct a single-cycle infectious influenza virus with the Gluc reporter system for rapid identification of mechanism of antiviral drugs.

MethodsWe have constructed a single-cycle infectious influenza virus with the Gluc reporter system by co-transfection of 8 influenza virus packaging plasmids in which the HA coding sequence was replaced by the sequence of the secreted Gaussia luciferase. In addition， the HA protein was offered by the expression plasmid pCAGGS-HA-IRES-puro.

ResultsThe Gluc signal could be detected in the cell supernatant during the first round infection with the single-cycle infectious virus but no infectious virions were detected. And also， during the second round infection， no Gluc signal could be detected. It was indicated that during infection the single-cycle infectious virus could express Gluc protein but not produce infectious progeny particles. By studies of replication kinetics and life phase， we specified the life cycle of the single-cycle infectious virus. Combined with the results of the blocking experiment by four kinds of anti-flu drugs with clear action mechanism， it was proved that this single round infectious system could be applied for quick and effective identification of action mechanism of anti-flu agents.

ConclusionA single-cycle infectious influenza virus with the Gluc reporter system is successfully constructed and may be used for identification of action mechanism of anti-flu agents.

Author Affiliation： Department of Immunology， Institute of Medicinal Biotechnology， Chinese Academy of Medical Sciences & Union Medical College， Beijing 100050， China

Corresponding Authors： ZHOU Jin-ming， Email： zhou_jim@hotmail.com； CEN Shan， Email： shancen@hotmail.com

www.cmbp.net.cnChin Med Biotechnol， 2016， 11（4）：300-307

Construction of a single-cycle infectious influenza virus with the Gluc reporter system

ZHANG Yong-xin， ZHAO Fei， WANG Zhen， ZHANG Rui-xin， ZHOU Jin-ming， CEN Shan

Influenza A virus；Drug evaluation， preclinical；Single-cycle infectious virus；Gluc reporter

10.3969/j.issn.1673-713X.2016.04.003

國家自然科學基金（81401675）

100050 北京，中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)學院醫(yī)藥生物技術研究所免疫生物學室

周金明，Email：zhou_jim@hotmail.com；岑山，Email：shancen@hotmail.com

2016-03-25

*同為第一作者