張凌男，陳成，李恪梅，王國治，魏東，董巧香

·論著·

布氏菌活疫苗滴鼻與皮下接種的免疫效果的比較

張凌男，陳成，李恪梅，王國治，魏東，董巧香

目的將布氏減毒活疫苗通過滴鼻和皮下注射兩種方式免疫小鼠，比較兩種方式的免疫效果。

方法采用兩種方法免疫動物，免疫 4 周后分離血清、脾臟淋巴細(xì)胞及制備肺泡灌洗液。ELISA 法檢測免疫動物血清中總 IgG 抗體；ELISA 法檢測免疫動物肺泡灌洗液中總IgG、IgA 抗體；ELISPOT 法檢測分泌 IFN-γ、IL-4 的脾臟淋巴細(xì)胞數(shù)目，以及用 ELISA 方法檢測體外再刺激后小鼠脾細(xì)胞分泌細(xì)胞因子水平；流式細(xì)胞術(shù)對 T 細(xì)胞亞群進(jìn)行分類；用羊布氏菌弱毒株 M5 通過滴鼻和皮下注射兩種方式攻擊免疫動物，通過脾臟布氏菌計數(shù)評價并比較兩種免疫方法的保護(hù)效果。

結(jié)果ELISA、ELISPOT 和 T 淋巴細(xì)胞亞群分類結(jié)果顯示，兩種免疫途徑均能誘導(dǎo)體液免疫、細(xì)胞免疫應(yīng)答，兩者間無顯著差異。BALB/c 小鼠滴鼻攻擊試驗結(jié)果顯示滴鼻免疫組和皮下免疫組脾臟中布氏菌數(shù)量的對數(shù)值均為 0，陰性組脾臟中布氏菌數(shù)量的對數(shù)值為 6.24 ± 0.07；皮下攻擊試驗顯示滴鼻免疫組脾臟中布氏菌數(shù)量的對數(shù)值為 1.69 ± 0.07，皮下免疫組為 3.03 ± 0.03，陰性組為 5.29 ± 0.06。

結(jié)論兩種免疫途徑均能誘導(dǎo)體液免疫、細(xì)胞免疫應(yīng)答，滴鼻免疫組的免疫保護(hù)作用顯著優(yōu)于皮下注射組，提示滴鼻免疫是一種高效的免疫途徑。

布魯桿菌菌苗；免疫，體液；免疫，黏膜；細(xì)胞免疫；接種

www.cmbp.net.cn中國醫(yī)藥生物技術(shù)， 2016， 11（4）：308-313

布氏桿菌是一種革蘭陰性的不運動細(xì)菌，由蘇格蘭微生物學(xué)家 David Bruce 首次發(fā)現(xiàn)并分離［1］。因感染布氏桿菌引起的布病，是一種人畜共患性全身慢性傳染病，主要侵害生殖系統(tǒng)，其病癥類似于流行性感冒。家畜感染布氏桿菌后則極易引起流產(chǎn)或死胎，感染后的家畜所排出的分泌物中含有大量的布氏桿菌，具有一定的傳染力。人接觸了感染動物的分泌物，服用了污染的奶及滅菌不完全的畜肉，皆可遭受感染［2-4］，但人傳人的現(xiàn)象比較罕見。據(jù)調(diào)查，很多國家由于布氏桿菌病造成的經(jīng)濟損失是很嚴(yán)重的［5］。目前，接種疫苗是世界公認(rèn)的能夠降低布病發(fā)生和傳播最有效、最經(jīng)濟的方法［6］。我國目前仍采用牛種弱毒株 104M 菌株為人用皮上劃痕布氏菌活疫苗，而皮上劃痕弊端是不能準(zhǔn)確定量接種，接種復(fù)雜，常伴有異常反應(yīng)，接種者皮膚會有損傷，而且劃痕時皮膚伴有疼痛，皮膚遺留疤痕不易被接受，因此改善疫苗的免疫途徑是疫苗研究的熱點之一［7-9］。

本次主要采用滴鼻和皮下注射 2 種途徑免疫小鼠，通過體液免疫、黏膜免疫、細(xì)胞免疫和免疫保護(hù)力 4 個方面的試驗結(jié)果來考察不同免疫途徑的免疫效果。

1　材料與方法

1.1主要材料

1.1.1實驗動物無特定病原體級 BALB/c 小鼠，雌性，6 ～ 8 周，共 60 只，由中國食品藥品檢定研究院實驗動物中心提供，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（京）2014-0013，飼養(yǎng)于中國食品藥品檢定研究院清潔級動物室。

1.1.2菌種滴鼻免疫用和皮下注射用布氏菌活疫苗（Br-PPD）及羊布氏菌 M5 弱毒株均由中檢院結(jié)核病疫苗室提供。

1.1.3實驗儀器酶標(biāo)儀購自美國 Bio-Tek 公司；生物安全柜購自美國 Nuaire 公司；恒溫培養(yǎng)箱購自德國 Binder 公司；高速離心機購自美國Beckman 公司；酶聯(lián)斑點分析儀購于美國 CTL ImmunSpot；CO2培養(yǎng)箱購于美國 Thermo 公司；流式細(xì)胞儀購自美國 BD 公司；移液槍購于Gilson 公司。

1.1.4試劑耗材胎牛血清購自美國 Gemini 公司；ConA 和 pNPP 底物顯色液購自美國 Sigma公司；ELISPOT 試劑盒 Mouse IFN-γ ELISPOT Kit購自美國 Therma 公司；淋巴細(xì)胞分離液、無血清培養(yǎng)基購自深圳漢科生物工程有限公司；IFN-γ 及IL-4 ELISA 預(yù)包被試劑盒、TSA 培養(yǎng)基均購自美國 BD 公司；戊巴比妥鈉購自德國 Merck 公司；堿性磷酸酶標(biāo)記羊抗小鼠 IgG 購自美國 Jackson Immuno Research 公司；辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗小鼠 IgA 購自美國 Bethyl 公司；TMB 底物顯色液購自美國 Amresco 公司。

1.2方法

1.2.1動物分組及免疫實驗分為 3 組，分別為滴鼻組（5 × 107CFU/只），皮下注射組（5 × 107CFU/只），生理鹽水對照組，每組隨機分給 20 只小鼠。滴鼻組用 10 μl 移液槍對清醒狀態(tài)下小鼠進(jìn)行鼻腔免疫，體積為 10 μl/只（5 μl/鼻孔），皮下組即后肢皮下注射 0.2 ml。

1.2.2肺泡灌洗液制備免疫 4 周后，對每組5 只小鼠進(jìn)行肺泡灌洗液制備，將每只小鼠腹腔注射 40 mg/ml 戊巴比妥鈉溶液 0.15 ml，麻醉后剪開頸部皮膚，充分暴露氣管，沿氣管上端剪一楔形口，取 2 ml 注射器連接沖洗管，用 1.0 ml 生理鹽水沖洗肺泡，反復(fù)抽吸 3 次后收集沖洗液于 1.5 ml 離心管中，離心收集上清，-70 ℃ 保存。

1.2.3動物血清和脾臟淋巴細(xì)胞的制備免疫4 周后，每組取 5 只小鼠摘眼球采血，分離血清，放置于 -20 ℃ 冰箱保存，用于抗體水平的檢測。在無菌條件下，取小鼠脾臟置于篩網(wǎng)上，滴加淋巴細(xì)胞分離液，研磨，用巴氏吸管將研磨液吸入到15 ml 離心管中，滴加 10 滴左右的無血清培養(yǎng)基進(jìn)行低速梯度離心，在 25 ℃ 條件下，800 × g 離心 30 min，吸出淋巴細(xì)胞層，加入 10 ml 1640 不完全培養(yǎng)基，顛倒洗滌，室溫，250 × g 離心收集細(xì)胞，調(diào)濃度至 2.0 × 106個/ml、1.0 × 107個/ml，用于細(xì)胞免疫的檢測。

1.2.4黏膜免疫檢測

1.2.4.1間接 ELISA 法檢測小鼠肺泡灌洗液IgG 的效價加入終濃度為 4 μg/ml 的 Br-PPD蛋白包被 96 孔酶標(biāo)板，放置于 4 ℃ 冰箱，過夜；洗板，用 1% 的 BSA 封閉（200 μl/孔），37 ℃ 靜置 2 h；每孔加入 100 μl 的 2 × 開始倍比稀釋的待檢肺泡灌洗液，37 ℃ 靜置 1 h；洗板，每孔加入 100 μl 1∶2500 倍稀釋堿性磷酸酶標(biāo)記山羊抗小鼠 IgG，37 ℃ 靜置 1 h；洗板，加入 pNPP 底物顯色液（100 μl/孔），室溫避光 60 min 后，加入終止液終止反應(yīng)，檢測吸光值 A405。

1.2.4.2間接 ELISA 法檢測小鼠肺泡灌洗液IgA 的效價加入終濃度為 4 μg/ml 的 Br-PPD蛋白包被 96 孔酶標(biāo)板，放置于 4 ℃ 冰箱，過夜；洗板，用 1% 的 BSA 封閉（200 μl/孔），37 ℃ 靜置 2 h；每孔加入 100 μl 的 2 × 開始倍比稀釋的待檢肺泡灌洗液，37 ℃ 靜置 1 h；洗板，每孔加入 100 μl 1∶2500 倍稀釋辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗小鼠 IgA，37 ℃ 靜置 1 h；洗板，加入 TMB 底物顯色液（100 μl/孔），室溫避光 30 min 后，加入終止液終止反應(yīng)，檢測吸光值 A450。

1.2.5體液免疫檢測間接 ELISA 法檢測小鼠血清 IgG 的滴度。加入終濃度為 4 μg/ml 的Br-PPD 蛋白包被 96 孔酶標(biāo)板，放置于 4 ℃ 冰箱，過夜；洗板，用 1% 的 BSA 封閉（200 μl/孔），37 ℃ 靜置 1 h；每孔加入 100 μl 的 50 × 開始倍比稀釋的待檢血清，37 ℃ 靜置 1 h；洗板，每孔加入 100 μl 1∶2500 倍稀釋堿性磷酸酶標(biāo)記山羊抗小鼠 IgG，37 ℃ 靜置 1 h；洗板，加入 pNPP 底物顯色液（100 μl/孔），室溫避光 60 min 后，加入終止液終止反應(yīng)，檢測吸光值 A405。

1.2.6細(xì)胞免疫檢測

1.2.6.1分泌 IFN-γ、IL-4 的脾臟淋巴細(xì)胞的數(shù)目檢測小鼠免疫 4 周后，分離小鼠脾臟淋巴細(xì)胞，取 96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔中加混有 2.0 × 106個/ml 濃度細(xì)胞 100 μl，分別加入 100 μl 布氏Br-PPD 抗原（終濃度為 10 μg/ml）和滅活菌體抗原（終濃度為 1 × 107/ml）刺激，做復(fù)孔，用無血清培養(yǎng)液作陰性對照，終濃度為 5 μg/ml 的 ConA作陽性對照。37 ℃，放置 CO2培養(yǎng)箱中孵育 22 h，孵育完畢后，按試劑盒說明書操作步驟依次加入檢測抗體等試劑，洗板，顯色，超純水沖洗終止顯色反應(yīng)，自然風(fēng)干后計數(shù)。

1.2.6.2體外再刺激免疫小鼠脾細(xì)胞因子產(chǎn)生水平檢測取 48 孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔中加 2.0 × 106個/ml 濃度細(xì)胞 400 μl，再分別加入 50 μl 布氏 Br-PPD 抗原（終濃度為 10 μg/ml）和滅活菌體（終濃度為 1 × 107個/ml）刺激。ConA（終濃度為 5 μg/ml）為陽性對照，培養(yǎng)基為陰性對照。37 ℃，放置 CO2培養(yǎng)箱中孵育 22 h，孵育完畢后，對培養(yǎng)物進(jìn)行離心，取各孔細(xì)胞培養(yǎng)液上清，根據(jù)ELISA 試劑盒說明書操作步驟檢測體外不同刺激物刺激小鼠脾細(xì)胞分泌 IFN-γ 的水平。

1.2.7T 淋巴細(xì)胞亞群分類取 96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔中加入 1.0 × 107個/ml 濃度細(xì)胞100 μl，分別加入 10 μl 的刺激物，刺激物為布氏 Br-PPD抗原（終濃度 10 μg/ml）和滅活菌體（終濃度為1 ×107個/ml），用 PMA/離子霉素作為陽性對照，培養(yǎng)基作為陰性對照，共同孵育 3 h 后，每孔加入10 μl 的阻斷劑。12 h 后進(jìn)行胞內(nèi) IFN-γ、IL-4 染色，胞外 CD3和 CD4染色，流式細(xì)胞儀測定后，用 Cellquest 軟件進(jìn)行分析。

1.2.8布氏菌活苗免疫保護(hù)力檢測免疫 4 周后，對每組 5 只小鼠經(jīng)后肢皮下攻擊羊種布氏菌M5 弱毒株，劑量為 5.0 × 108CFU/只；每組 5 只小鼠麻醉后滴鼻攻擊羊種布氏菌 M5 弱毒株，劑量為 5.0 × 108CFU/只。4 周后解剖小鼠，無菌取出脾臟，研磨脾臟并接種平皿，通過脾臟細(xì)菌計數(shù)評價布氏菌活苗兩種免疫方式的保護(hù)效果。

1.3統(tǒng)計學(xué)處理

2　結(jié)果

2.1小鼠肺泡灌洗液中抗 Br-PPD IgG 水平

小鼠肺泡灌洗液用間接 ELISA 方法測抗體水平，結(jié)果顯示，陰性組小鼠檢測不到特性抗體，滴鼻組和皮下組小鼠均可檢測出特異性抗體 IgG、IgA，滴鼻組和皮下組 IgG 抗體水平相近（t = 1.414，P = 0.159 ＞ 0.05），差異無統(tǒng)計學(xué)意義，而滴鼻組 IgA 抗體水平高于皮下組（t = 2.489，P = 0.037 ＜ 0.05），差異有統(tǒng)計學(xué)意義，結(jié)果見圖 1。

2.2小鼠血清中抗 Br-PPD IgG 水平

小鼠血清用間接 ELISA 方法測抗體水平，結(jié)果顯示，陰性組小鼠檢測不到特性抗體，滴鼻組和皮下組小鼠均可檢測出抗體，抗體滴度均為527.80，差異無統(tǒng)計學(xué)意義，結(jié)果見圖 2。

圖1　肺泡灌洗液 IgG、IgA 抗體滴度Figure 1　The bronchoalveolar lavage fluid IgG、IgA antibody titer

圖2　血清 IgG 抗體滴度Figure 2　The serum IgG antibody titer

2.3分泌 IFN-γ、IL-4 的脾臟淋巴細(xì)胞數(shù)

檢測結(jié)果顯示，滴鼻組和皮下組在 Br-PPD 抗原和滅活菌體抗原刺激下分泌 IFN-γ 的脾臟淋巴細(xì)胞數(shù)明顯多于陰性組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜0.05），滴鼻組和皮下組在 Br-PPD 抗原刺激下分泌 IFN-γ 的脾臟淋巴細(xì)胞數(shù)結(jié)果相當(dāng)，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P = 0.9372），滴鼻組和皮下組在滅活菌體抗原刺激下分泌 IFN-γ 的脾臟淋巴細(xì)胞數(shù)結(jié)果相當(dāng)，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P = 0.5309），結(jié)果見圖 3，分泌 IL-4 的脾臟淋巴細(xì)胞數(shù)很低，沒有統(tǒng)計學(xué)意義。

2.4體外再刺激免疫小鼠脾細(xì)胞因子檢測結(jié)果

利用 ELISA 方法檢測以 Br-PPD 抗原和滅活菌體抗原體外刺激小鼠脾細(xì)胞分泌 IFN-γ、IL-4 水平。結(jié)果顯示，在 Br-PPD 抗原和滅活菌體抗原刺激下分泌的 IFN-γ 的含量明顯高于陰性組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜ 0.05），滴鼻組和皮下組在 Br-PPD抗原刺激下分泌 IFN-γ 的含量相當(dāng)，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P = 0.9228），滴鼻組和皮下組在滅活菌體抗原刺激下分泌 IFN-γ 的含量相當(dāng)，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P = 0.6643），結(jié)果見圖 4。IL-4 含量很低，無統(tǒng)計學(xué)意義。

圖3　脾臟淋巴細(xì)胞分泌 IFN-γ 斑點數(shù)目Figure 3　Different stimulator lymphocytes secreted IFN-γ spot number

圖4　脾臟脾細(xì)胞分泌 IFN-γ 的含量Figure 4　Different stimulator stimulated mouse spleen cells of IFN-γ secretion

2.5T 細(xì)胞亞群分類

從流式的結(jié)果看，在 Br-PPD 抗原和滅活菌體抗原刺激下，滴鼻組和皮下組小鼠的脾淋巴細(xì)胞中CD4+IFN-γ+細(xì)胞比例高于陰性組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜ 0.05）。滴鼻組和皮下組在 Br-PPD 抗原刺激下小鼠的脾淋巴細(xì)胞中 CD4+IFN-γ+細(xì)胞比例結(jié)果相當(dāng)，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P = 0.4413），滴鼻組和皮下組在滅活菌體抗原刺激下小鼠的脾淋巴細(xì)胞中CD4+IFN-γ+細(xì)胞比例結(jié)果相當(dāng)，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P = 0.7824），結(jié)果見圖 5。而小鼠的脾淋巴細(xì)胞中 CD4+IL-4+細(xì)胞比例很低，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

圖5　脾臟淋巴細(xì)胞中 CD4+IFN-γ+比例Figure 5　Different stimulator stimulated mouse spleen cells of CD4+IFN-γ+proportion

2.6布氏菌活苗免疫保護(hù)力

為比較兩種免疫方式的免疫保護(hù)力，用羊布氏菌 M5 弱毒株分別以皮下和滴鼻兩種方式攻擊免疫動物，以脾臟布氏菌分離數(shù)為指標(biāo)。結(jié)果顯示，滴鼻攻擊小鼠滴鼻組和皮下組動物脾組織含菌量對數(shù)值均為 0，陰性組為 6.24 ± 0.07。皮下攻擊試驗中，陰性組脾臟含菌量對數(shù)值為 5.29 ± 0.06，滴鼻組為 1.69 ± 0.07（t = 36.51，P ＜ 0.0001），兩者差異有統(tǒng)計學(xué)意義；皮下組脾臟含菌量對數(shù)值為3.03 ± 0.03（t = 38.64，P ＜ 0.0001），與對照組差異有統(tǒng)計學(xué)意義。滴鼻組脾臟含菌量對數(shù)值低于皮下組，兩者差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t = 21.45，P ＜ 0.0001）。

3　討論

本次試驗用 ELISA 法檢測免疫動物血清中總IgG 抗體，肺泡灌洗液中總 IgG、IgA 抗體的含量。結(jié)果顯示，滴鼻組和皮下組血清 IgG 平均抗體滴度均為 527.80；滴鼻組和皮下組肺泡灌洗液 IgG平均抗體滴度分別為 13.93 和 9.19，IgA 平均抗體滴度分別為 21.11 和 6.06，說明滴鼻免疫和皮下免疫都能夠誘導(dǎo)一定水平的體液免疫和黏膜免疫應(yīng)答。同時，用 ELISPOT 法檢測分泌 IFN-γ 的脾臟淋巴細(xì)胞數(shù)明顯多于陰性對照組，而分泌 IL-4的脾臟淋巴細(xì)胞數(shù)與陰性對照組無差異。ELISA 方法檢測體外刺激細(xì)胞因子檢測顯示，IFN-γ 的分泌水平遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于 IL-4，說明 Th1 型細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫為主，Th2 型細(xì)胞介導(dǎo)的體液免疫為輔，這與減毒活疫苗的作用機制相符。

疫苗的效力試驗是評價疫苗免疫保護(hù)力最可靠指標(biāo)。傳統(tǒng)布氏疫苗的效力評價主要是使用豚鼠，效力試驗用強毒株攻擊，本次研究參照《中國藥典》效力測定的方法［10］，以小鼠為動物模型，使用羊布氏菌 M5 弱毒株攻擊，大大提高了實驗的經(jīng)濟性和安全性。結(jié)果顯示，在皮下攻擊時，皮下組免疫動物脾臟布氏菌數(shù)量的對數(shù)值為 3.03 ± 0.03，滴鼻組為 1.69 ± 0.07，而陰性組為 5.29 ± 0.06。在滴鼻攻擊時，皮下組和滴鼻組免疫動物均沒有分離出布氏菌，而陰性組動物脾臟布氏菌數(shù)量的對數(shù)值為 6.24 ± 0.07。數(shù)據(jù)說明，相同免疫劑量下，滴鼻免疫對皮下攻擊的保護(hù)效果優(yōu)于皮下免疫，滴鼻免疫是一種高效的免疫途徑，為研究布氏活疫苗免疫途徑奠定基礎(chǔ)。

現(xiàn)有鼻腔攻擊的保護(hù)力結(jié)果中，滴鼻免疫組和皮下注射組均能提供完全的保護(hù)，這可能與攻擊用菌株數(shù)量及毒力有關(guān)，本課題組將應(yīng)用布氏菌強毒株進(jìn)行保護(hù)力研究，進(jìn)一步比較兩種免疫途徑的保護(hù)效果。

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【Abstract】

ObjectiveTo evaluate the immune effects in the mice to be immunized by the Brucella vaccine through intranasal immunization and hypodermic injection respectively.

MethodsFour weeks post-immunization， blood and spleen lymphocytes and the bronchoalveolar lavage fluids were collected from each animal. Serum samples and the bronchoalveolar lavage fluids were examined for total IgG/IgA antibodies using ELISA. The number of spleen lymphocytes secreting IFN-γ， IL-4 were detected by ELISPOT and ELISA method was adopted for detection of spleen cells in vitro stimulated to secrete IFN-γ， IL-4 levels of cytokines. Immunized animals were infected with attenuated Brucella melitensis M5 strain through two routes of hypodermic injection and intranasal attacking and then evaluated the acquired immune protection of immunized animals through the bacteria count of spleen.

ResultsThe results from ELISA， ELISPOT and classification of T lymphocyte subsets showed that both of the two methods of immunization were able to induce humoral immunity and cellular immune responses in mice. There was no significant difference between two methods. The intranasal attacking test and the hypodermic attacking test showed that the Brucella number of logarithmic value in the spleen of the intranasal immunization group， hypodermic injection group and the negative group were 0， 0， 6.24 ± 0.07 and 1.69 ± 0.07， 3.03 ± 0.03， 5.29 ± 0.06， respectively.

ConclusionsTwo methods of immunization induces humoral immunity and cellular immune responses in mice. The protective effect of the intranasal immunization group is superior to that of hypodermic injection group， suggesting that Brucella vaccine forintranasal immunization may be an effective method.

Author Affiliations： Department of Enviromental and Public Health Biology Wenzhou Medical College， Wenzhou 325035， China （ZHANG Ling-nan， DONG Qiao-xiang）； National Institutes for Food and Drug Control， Beijing 100050， China （CHEN Cheng，LI Ke-mei， WANG Guo-zhi， WEI Dong）

Corresponding Authors： DONG Qiao-xiang， Email： dqxdong@163.com； WEI Dong， Email： weidong1994@sina.com

www.cmbp.net.cnChin Med Biotechnol， 2016， 11（4）：308-313

Comparison of effect on intranasal immunization and hypodermic injection of Brucella vaccine

ZHANG Ling-nan， CHEN Cheng， LI Ke-mei， WANG Guo-zhi， WEI Dong， DONG Qiao-xiang

Brucella vaccine；Immunity， humoral；Immunity， mucosal；Cellular immunity；Vaccination

10.3969/j.issn.1673-713X.2016.04.004

“重大新藥創(chuàng)制”科技重大專項（2014ZX09304311-002）

325035 溫州醫(yī)科大學(xué)環(huán)境與公共衛(wèi)生學(xué)院（張凌男、董巧香）；100050 北京，中國食品藥品檢定研究院結(jié)核病疫苗室（陳成、李恪梅、王國治、魏東）

董巧香，Email：dqxdong@163.com；魏東，Email：weidong 1994@sina.com

2016-04-19