陶益，陳西，任玉超，蔡寶昌（南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，江蘇南京210023）

酒續(xù)斷對(duì)骨質(zhì)疏松型大鼠OPG/RANK/RANKL軸系統(tǒng)的調(diào)控研究*

陶益，陳西，任玉超，蔡寶昌
（南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，江蘇南京210023）

目的比較生、酒續(xù)斷灌胃給藥對(duì)骨質(zhì)疏松大鼠骨保護(hù)素（OPG）/細(xì)胞核因子-κB受體活化因子（RANK）/RANK配體（RANKL）軸的調(diào)控差異。方法將30只購于上海杰思捷實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司的SPF級(jí)SD大鼠通過去勢(shì)法造成骨質(zhì)疏松大鼠模型，隨機(jī)分為正常組、假手術(shù)組、模型組、雌二醇組、生續(xù)斷組和酒續(xù)斷組，每組5只，灌胃給藥12周后，麻醉主動(dòng)脈取血，采用全自動(dòng)生化分析儀對(duì)給藥12周后大鼠血清中鈣（Ca）、磷（P）、堿性磷酸酶、骨鈣素4項(xiàng)基本指標(biāo)進(jìn)行分析，同時(shí)使用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法檢測(cè)血清OPG、RANK和RANKL 3項(xiàng)骨代謝指標(biāo)水平，并進(jìn)行組間對(duì)比分析。結(jié)果與模型組比較，雌二醇組、生續(xù)斷組和酒續(xù)斷組大鼠的堿性磷酸酶、骨鈣素和RANKL水平均顯著降低，OPG和RANK水平均顯著升高，酒續(xù)斷組大鼠的Ca水平顯著降低，P水平升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與雌二醇組比較，生續(xù)斷組大鼠的堿性磷酸酶和骨鈣素水平顯著升高，酒續(xù)斷組大鼠的Ca水平顯著降低，P和骨鈣素水平顯著升高，生續(xù)斷組和酒續(xù)斷組大鼠的OPG和RANK水平均顯著降低，RANKL水平均顯著升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與生續(xù)斷組比較，酒續(xù)斷組大鼠的Ca、堿性磷酸酶、骨鈣素及RANKL水平均顯著降低，OPG和RANK水平均顯著升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論續(xù)斷對(duì)骨質(zhì)疏松大鼠的治療作用與其調(diào)控OPG/RANK/RANKL軸有關(guān)，酒續(xù)斷的調(diào)控能力強(qiáng)于生續(xù)斷。

酒炙；續(xù)斷；骨保護(hù)素；Rank配體；骨質(zhì)疏松；大鼠

【Abstract】Objective To compare the regulation difference of gavage administration of crude and wine-processed Dipsacus on OPG/RANK/RANKL axis in osteoporosis rat.Methods Thirty SPF grade SD rats purchased from the Shanghai Jiesijie Laboratory AnimalCo.，Ltd.were established the osteoporotic modelby the castrationmethod and randomly divided into the normal group，sham operation group，model group，estradiol group，crude Dipsacus group and wine-processed Dipsacus group，5 cases in each group.After 12 weeks of gavage administration，the ratswere anesthetized and aortic blood was collected.The basic biochemical indicators of serum Ca，P，alkaline phosphatase and osteocalcin were analyzed by adopting the automatic biochemical analyzer.Meanwhile，the 3 bonemetabolic indicators of serum OPG，RANK and RANKL levels were determined by using the ELISA method.Results Compared with the model group，the levels of alkaline phosphatase，osteocalcin and RANKL in the estradiolgroup，crude Dipsacus group and wine-processed Dipsacusgroup were significantly reduced，while the levelsofOPG and RANK were significantly increased，the Ca level in the wine-processed Dipsacus group was significantly reduced and the P level was increased，the differences were statistically significant（P＜0.05）；compared with the estradiol group，the levels of alkaline phosphatase and osteocalcin in the crude Dipsacusgroup were significantly increased，whereas the Ca level in thewine-processed Dipsacus group was significantly reduced and the levels of P and osteocalcin were significantly increased，the levels of OPG and RANK in the crude and wine-processed Dipsacus groups were significantly reduced，while the RANKL levelwas significantly elevated，the differenceswere statistically significant（P＜0.05）；compared with the crude Dipsacus group，the levels of Ca，alkaline phosphatase，osteocalcin and RANKL levels in thewine-processed Dipsacus group were significantly reduced，while the levels of OPG and RANK were significantly increased with statistical differences（P＜0.05）.Conclusion The curative effect of Dipsacus in treating osteoporosis rat is related with its regulating the OPG/RANK/RANKL axis.The regulation ability ofwine-processed Dipsacus is stronger than thatofcrude Dipsacus.

【Key words】Wine processing；Dipsacusasper；Osteoprotegerin；Rank ligand；Osteoporosis；Rats

骨質(zhì)疏松癥屬于骨代謝性疾病，主要特征是骨量低于正常值和骨質(zhì)微結(jié)構(gòu)受破壞且變脆，容易導(dǎo)致骨折。隨著人口老齡化的加劇，老年骨質(zhì)疏松癥患者持續(xù)增加，我國(guó)目前有3 500～4 000萬骨質(zhì)疏松患者，女性占2/3，骨質(zhì)疏松癥已經(jīng)位居中老年人五大疾病患病率之首［1］。中藥在治療骨質(zhì)疏松癥方面療效顯著，如續(xù)斷皂苷能夠顯著增加骨質(zhì)疏松大鼠骨密度，增強(qiáng)骨強(qiáng)度［2］，但續(xù)斷治療骨質(zhì)疏松癥的作用機(jī)制仍不清楚。現(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，骨保護(hù)素（OPG）、細(xì)胞核因子-κB受體活化因子（RANK）和RANK配體（RANKL）三者形成的局部調(diào)節(jié)體系在骨生長(zhǎng)和骨重建中起著十分重要的調(diào)節(jié)作用［3-5］。作者推測(cè)續(xù)斷治療骨質(zhì)疏松的作用可能與調(diào)控OPG/RANK/ RANKL軸有關(guān)。本文首先建立大鼠骨質(zhì)疏松模型，然后灌胃給予生續(xù)斷和酒續(xù)斷水提取液，采用全自動(dòng)生化分析儀對(duì)給藥12周后大鼠血清中鈣（Ca）、磷（P）、堿性磷酸酶、骨鈣素4項(xiàng)基本指標(biāo)進(jìn)行分析，同時(shí)使用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）對(duì)血清中OPG、RANK和RANKL 3項(xiàng)骨代謝指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定，比較生、酒續(xù)斷給藥后相關(guān)指標(biāo)的差異性。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物30只雌性SPF級(jí)SD大鼠購于上海杰思捷實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK（滬）2013-0006。通過去勢(shì)法將30只大鼠造成骨質(zhì)疏松型大鼠模型，隨機(jī)分為六組，即正常組、假手術(shù)組、模型組、雌二醇組、生續(xù)斷組和酒續(xù)斷組，每組5只；大鼠體質(zhì)量分別為（183.53±4.39）、（186.94±7.66）、（184.52±6.91）、（185.40±8.50）、（183.53±8.28）、（182.99±10.49）g，各組大鼠體質(zhì)量比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。

1.1.2藥物與試劑續(xù)斷藥材在四川收集，經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)蔡寶昌教授鑒定為川續(xù)斷科植物川續(xù)斷（Dipsacusasperoides C.Y.Cheng et T.M.Ai）的干燥根，黃酒購于紹興女兒紅釀酒有限公司，β-雌二醇購于阿拉丁試劑有限公司，ELISA試劑盒購于泉州科諾迪生物科技有限公司。按照《2015版中國(guó)藥典》要求對(duì)續(xù)斷進(jìn)行炮制［6］，（1）生續(xù)斷：取原藥材，除去雜質(zhì)，洗凈，潤(rùn)透，切薄片，干燥，得生續(xù)斷備用；（2）酒續(xù)斷：取續(xù)斷片，加黃酒拌勻，每100千克續(xù)斷片用黃酒10 kg悶透，置炒制容器內(nèi)，用文火加熱，炒至微帶黑色，取出，放涼，得酒續(xù)斷備用。稱取續(xù)斷生品及酒品各50 g，用8倍量純水加熱回流提取2次，每次2 h，合并2次提取液，濾過，倒入蒸發(fā)皿上濃縮至100mL，放置于4℃冰箱備用。

1.2方法大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后，在無菌條件下，正常組不作處理，假手術(shù)組大鼠切除少量腹部脂肪，其余4組大鼠切除雙側(cè)卵巢。術(shù)后4周開始灌胃，生續(xù)斷組以生斷續(xù)1.35g/（kg·d）劑量灌胃；酒續(xù)斷組以酒斷續(xù)1.35 g/ （kg·d）劑量灌胃；雌二醇組以雌二醇25μg/（kg·d）灌胃給藥（雌二醇難溶于水，以0.5%羧甲基纖維素鈉助溶），每天1次；其他組給予相同體積的生理鹽水，持續(xù)12周。大鼠灌胃給藥12周后，禁食，麻醉，抽取腹主動(dòng)脈血5 mL，經(jīng)13 000 r/m離心10 min，吸取上清液，存放于-20℃冰箱待測(cè)。

1.2.1生化指標(biāo)分析采用日立全自動(dòng)生化分析儀對(duì)不同組別大鼠血清中Ca、P、堿性磷酸酶、骨鈣素4項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定［7］，并對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.2.2ELISA法檢測(cè)血清中OPG、RANK和RANKL水平將樣品血清稀釋、加樣，加酶標(biāo)抗體，依次加入顯色劑、終止液，用酶標(biāo)儀測(cè)量吸光度（OD值）。以標(biāo)準(zhǔn)物濃度和OD值計(jì)算出樣品水平，再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品的實(shí)際水平。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以±s表示，各組間指標(biāo)比較采用ANOVA方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1各組大鼠常規(guī)生化指標(biāo)結(jié)果比較與正常組比較，假手術(shù)組大鼠血清Ca、P、堿性磷酸酶水平無明顯變化，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），而骨鈣素水平顯著升高，且模型組大鼠血清Ca水平顯著降低，堿性磷酸酶和骨鈣素水平顯著升高，雌二醇組、生續(xù)斷組和酒續(xù)斷組大鼠血清Ca水平顯著降低，血清P水平顯著升高，堿性磷酸酶和骨鈣素水平顯著升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與模型組比較，雌二醇組、生續(xù)斷組和酒續(xù)斷組大鼠的堿性磷酸酶和骨鈣素水平顯著降低，酒續(xù)斷組大鼠的Ca水平顯著降低，P水平顯著升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與雌二醇組比較，生續(xù)斷組大鼠的堿性磷酸酶和骨鈣素顯著升高，酒續(xù)斷組Ca水平顯著降低，P和骨鈣素水平顯著升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與生續(xù)斷組比較，酒續(xù)斷組大鼠的Ca、堿性磷酸酶和骨鈣素水平顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表1。

表1　各組大鼠血清中Ca、P、堿性磷酸酶和骨鈣素水平比較（±s，n=5）

表1　各組大鼠血清中Ca、P、堿性磷酸酶和骨鈣素水平比較（±s，n=5）

注：與正常組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與雌二醇組比較，cP＜0.05；與生續(xù)斷組比較，dP＜0.05。

組別正常組假手術(shù)組模型組雌二醇組生續(xù)斷組酒續(xù)斷組2.54±0.06 2.47±0.05 2.41±0.04a2.42±0.07a2.42±0.06a2.32±0.02abcdCa （mmol/L）1.53±0.11 1.66±0.29 1.74±0.26 1.76±0.15a1.86±0.22a2.02±0.16abc39.25±3.69 39.00±8.25 61.67±4.89a42.75±2.63b49.20±3.70abc43.33±2.89bd6.56±0.14 7.72±0.28a68.29±2.91a14.69±1.78ab36.15±3.07abc26.08±2.21abcdP （mmol/L）堿性磷酸酶（U/L）骨鈣素（μg/L）

2.2各組大鼠血清OPG、RANK、RANKL水平比較與正常組比較，假手術(shù)組大鼠血清OPG和RANK水平略有上升，RANKL水平略有降低，模型組大鼠血清OPG 和RANK水平顯著升高，RANKL水平顯著降低，雌二醇組、生續(xù)斷組和酒續(xù)斷組大鼠血清OPG和RANK水平顯著升高，RANKL水平顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與模型組比較，雌二醇組、生續(xù)斷組和酒續(xù)斷組OPG和RANK水平顯著上升，RANKL水平顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與雌二醇組比較，生續(xù)斷和酒續(xù)斷組OPG和RANK水平顯著降低，RANKL水平顯著升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與生續(xù)斷組比較，酒續(xù)斷組OPG和RANK水平顯著升高，RANKL水平顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表2。

表2　各組大鼠血清OPG、RANK、RANKL水平比較（±s，n=5）

表2　各組大鼠血清OPG、RANK、RANKL水平比較（±s，n=5）

注：與正常組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與雌二醇組比較，cP＜0.05；與生續(xù)斷組比較，dP＜0.05。

169.23±12.93 235.35±12.86a336.86±14.11a959.79±30.55ab462.93±25.27abc544.01±26.32abcdOPG （ng/L）0.37±0.02 0.42±0.03a0.64±0.03a1.84±0.11ab0.89±0.07abc1.11±0.06abcd328.93±27.05 268.07±15.68a228.28±12.01a76.84±4.27ab171.24±13.82abc120.63±9.73abcdRANK （pmol/L）RANKL （μg/L）組別正常組假手術(shù)組模型組雌二醇組生續(xù)斷組酒續(xù)斷組

3　討論

續(xù)斷始載于《本經(jīng)》，味苦、辛，微溫，歸肝、腎經(jīng)。續(xù)斷的現(xiàn)代炮制方法主要有切片、酒炙、鹽制、炒制、麩制、炭制等，2015年版《中國(guó)藥典》收載3種在臨床上使用廣泛的飲片規(guī)格：生續(xù)斷片、酒續(xù)斷和鹽續(xù)斷［6］。續(xù)斷生品補(bǔ)肝腎、通血脈、強(qiáng)筋骨，多用于筋骨疼痛。酒續(xù)斷始載于《雷公炮炙論》，曰：“用酒浸一伏時(shí)，焙干用”，續(xù)斷酒炙可引藥向外行散，增強(qiáng)通血脈之功，多用于風(fēng)濕痹痛，跌打損傷。續(xù)斷的主要化學(xué)成分為皂苷和酚酸類化合物，現(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，續(xù)斷具有抗骨質(zhì)疏松作用，皂苷類成分是其主要抗骨質(zhì)疏松成分［7-11］。

骨質(zhì)疏松癥是一種以骨量低下、骨微結(jié)構(gòu)破壞、導(dǎo)致骨脆性增加、易發(fā)生骨折為特征的全身性骨病。骨骼主要由膠原質(zhì)和磷酸鈣組成，膠原質(zhì)是一種形成軟組織的蛋白質(zhì)，磷酸鈣則是一種增加骨骼強(qiáng)度和增加軟組織硬度的礦物質(zhì)。常規(guī)與骨礦物質(zhì)有關(guān)的生化檢查包括血清游離鈣、血清無機(jī)磷和血清鎂等［12］。本研究發(fā)現(xiàn)，生續(xù)斷和酒續(xù)斷灌胃給藥均能降低模型大鼠血鈣水平，提高大鼠血清無機(jī)磷水平，酒續(xù)斷灌胃給藥引起的變化幅度大于生續(xù)斷，說明生續(xù)斷和酒續(xù)斷灌胃給藥有利于血清中的游離鈣沉積形成骨骼。

骨生化標(biāo)志物也是確定骨骼健康的一項(xiàng)重要指標(biāo)［12］，如血清總堿性磷酸酶、骨鈣素和Ⅰ型前膠原羧基端前肽等是反映骨形成的生化指標(biāo)。堿性磷酸酶在機(jī)體中的主要生理功能是在成骨過程中水解磷酸酯，為羥基磷灰石的沉積提供必要的磷酸，同時(shí)水解焦磷酸鹽，解除其對(duì)骨鹽形成的抑制作用，有利于成骨作用。骨鈣素主要由成骨細(xì)胞合成并分泌，比較穩(wěn)定，不受骨吸收因素的影響。通過血清骨鈣素可以了解成骨細(xì)胞，特別是新形成的成骨細(xì)胞的活動(dòng)狀態(tài)。骨轉(zhuǎn)換加速是骨質(zhì)疏松的一個(gè)特點(diǎn)，高骨轉(zhuǎn)換率可導(dǎo)致骨重吸收超過骨形成，增加骨折風(fēng)險(xiǎn)。骨鈣素水平隨骨更新率的變化而變化，骨更新率越快，骨鈣素水平越高，反之，則降低。原發(fā)性骨質(zhì)疏松和絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松是高轉(zhuǎn)換型的，所以骨鈣素明顯升高；老年性骨質(zhì)疏松癥是低轉(zhuǎn)換型的，因而骨鈣素升高不明顯。本研究發(fā)現(xiàn)，生、酒續(xù)斷灌胃給藥均能降低模型組大鼠血清堿性磷酸酶活性，降低血清骨鈣素水平，說明生、酒續(xù)斷灌胃可以降低骨轉(zhuǎn)換率，減少骨質(zhì)重吸收，且酒續(xù)斷的作用更強(qiáng)。

骨骼的形態(tài)發(fā)生和重建包括2個(gè)對(duì)立統(tǒng)一的過程，即成骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨基質(zhì)合成過程和破骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨吸收過程。OPG、RANK和RANKL形成的局部調(diào)節(jié)體系，在骨生長(zhǎng)、發(fā)育及骨構(gòu)塑和骨重建中起著十分重要的作用［4］。RANKL是破骨細(xì)胞分化所必需的細(xì)胞因子，促進(jìn)破骨細(xì)胞前體細(xì)胞分化，誘導(dǎo)破骨細(xì)胞生成；RANK是RANKL的受體，二者結(jié)合后參與破骨細(xì)胞的分化，促進(jìn)骨質(zhì)的吸收；OPG主要由成骨細(xì)胞分泌，特異性消除膜結(jié)合的可溶性RANKL抑制破骨細(xì)胞生成和成熟破骨細(xì)胞的活性。本研究發(fā)現(xiàn)，生、酒續(xù)斷灌胃給藥均能顯著提高模型大鼠血清OPG和RANK水平，降低RANKL水平，表明生、酒續(xù)斷均能抑制破骨細(xì)胞生成，抑制骨質(zhì)吸收。

綜上所述，續(xù)斷能夠調(diào)控OPG/RANK/RANKL軸系統(tǒng)，促進(jìn)成骨，抑制破骨，維持骨質(zhì)疏松大鼠體內(nèi)成骨和破骨活動(dòng)的平衡，酒續(xù)斷的調(diào)控力度大于生續(xù)斷。

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Study on regulation of wine-processed Dipsacus on OPG/RANK/RANKL axis system in osteoporosis rats*

Tao Yi，Chen Xi，Ren Yuchao，Cai Baochang
（College ofPharmacy，Nanjing University of Traditional Chinese Medicine，Nanjing，Jiangsu 210023，China）

10.3969/j.issn.1009-5519.2016.08.003

A

1009-5519（2016）08-1127-03

科技部國(guó)家科技重大專項(xiàng)基金資助項(xiàng)目（2012ZX09304005）；江蘇省自然科學(xué)基金青年項(xiàng)目（BK20140963）。

陶益（1985-），助理研究員，主要從事中藥炮制學(xué)研究。

（2016-01-16）