張大軍，張曉華，王兆華

(吉林省中醫(yī)藥科學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130012)

正交試驗(yàn)法優(yōu)選增率復(fù)脈顆粒水提工藝

張大軍*，張曉華，王兆華

(吉林省中醫(yī)藥科學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130012)

確定增率復(fù)脈顆粒的最佳水提工藝。方法：應(yīng)用高效液相色譜法和正交實(shí)驗(yàn)法，以增率復(fù)脈方中活性成分丹參素轉(zhuǎn)移率及全方干膏得率為指標(biāo)，確定增率復(fù)脈顆粒的最佳水提工藝參數(shù)。結(jié)果：增率復(fù)脈顆粒最佳水提工藝為：處方飲片加10倍量水，煎煮2次，每次2h。結(jié)論：經(jīng)試驗(yàn)優(yōu)選出的水提工藝穩(wěn)定可靠，適用于增率復(fù)脈顆粒的提取。

增率復(fù)脈顆粒；HPLC法；正交實(shí)驗(yàn)法；丹參素

增率復(fù)脈顆粒由丹參、黃芪、桂枝等八味中藥組成，是吉林省中醫(yī)藥科學(xué)院內(nèi)科應(yīng)用于臨床多年的經(jīng)驗(yàn)方。用于治療病態(tài)竇房結(jié)綜合癥(心動(dòng)過(guò)緩)，可明顯增加病人心率，延緩疾病進(jìn)展[1]。經(jīng)吉林省中醫(yī)藥科學(xué)院藥理室試驗(yàn)研究表明：灌胃增率復(fù)脈顆粒(0.25～2g/kg)可明顯抑制普萘洛爾引起的大鼠心率減慢作用；縮短乙酰膽堿引起的大鼠心動(dòng)過(guò)緩的持續(xù)時(shí)間；能明顯延長(zhǎng)異丙腎上腺素和亞硝酸鈉耐常壓缺氧存活時(shí)間；對(duì)正常小鼠，亦可明顯延長(zhǎng)小鼠耐常壓缺氧死亡時(shí)間[2]。本實(shí)驗(yàn)以方中活性成分丹參素轉(zhuǎn)移率和全方干膏得率為指標(biāo)，采用HPLC法和正交實(shí)驗(yàn)法，確定了該制劑最佳水提工藝。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

日本島津LC-10AT高效液相色譜儀(日本島津公司)；SPD-10A紫外檢測(cè)器(日本島津公司)；AE163電子天平(瑞士梅特勒公司)。

1.2 試藥

丹參素鈉對(duì)照品(批號(hào)110855-2014)購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定研究院；乙腈、甲醇、磷酸為色譜純，乙酸乙酯、冰乙酸、氯化鈉為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)[3]

以活性成分丹參素轉(zhuǎn)移率和全方干膏得率為指標(biāo)，選用L9(34)正交表對(duì)加水量、提取時(shí)間、提取次數(shù)進(jìn)行考察。因素和水平見(jiàn)表1，試驗(yàn)順序見(jiàn)表2。

表1 因素和水平表

2.2 樣品測(cè)定

2.2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent ZORBAX SB-C18柱(5μm,4.6×250mm)；流動(dòng)相：乙腈-0.5%乙酸(2：98)；流速：1mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)：283nm；柱溫：室溫。

2.2.2 樣品溶液的制備

按處方比例稱取各藥材飲片，按表2條件進(jìn)行提取，合并提取液，濾過(guò)，濾液濃縮并定容至250mL，得到9份樣品溶液。

2.2.3 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取丹參素鈉對(duì)照品適量，加50%甲醇制成每1mL含1.2mg的溶液(相當(dāng)于每1mL含丹參素1.08mg)，即得。

2.2.4 供試品溶液制備與測(cè)定

精密吸取“2.2.2”項(xiàng)下九份樣品溶液各50mL，分別加鹽酸2d，再加入氯化鈉5g，搖勻，濾過(guò)，吸取濾液各25 mL，用乙酸乙酯提取4次，每次20 mL，合并提取液，回收溶劑至近干，殘?jiān)?0%甲醇溶解，并定容至10 mL，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

精密吸取對(duì)照品溶液和供試品溶液各10μL，按“2.2.1”項(xiàng)下條件，測(cè)定并計(jì)算丹參素含量及提取率；精密吸取剩余樣品溶液各90mL，平行2份，水浴蒸干，于105℃烘箱干燥至恒重，測(cè)定干燥物重量，計(jì)算干膏得率，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2。

2.2.5 陰性供試品溶液制備

精密吸取缺丹參的陰性樣品溶液 50mL，按供試品溶液制備方法制備陰性供試品溶液。

2.2.6 專屬性試驗(yàn)

精密吸取上述對(duì)照品溶液、陰性供試品溶液和供試品溶液各 10 μL，按"2.2.1"項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)樣。結(jié)果表明，供試品溶液中主要色譜峰得以充分分離，且丹參素峰形良好，陰性對(duì)照在丹參素保留時(shí)間處無(wú)干擾峰出現(xiàn)，見(jiàn)圖 1。

2.2.5 方法學(xué)考察

丹參素在23.8～238μg·mL-1范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，回歸方程為Y=332723.8x+3645.5，r=0.9998；取丹參素鈉對(duì)照品溶液重復(fù)進(jìn)樣6次，RSD=0.35%、吸取供試品溶液重復(fù)進(jìn)樣6次，RSD=0.58%，結(jié)果高效液相色譜儀精密度良好；分別取供試品溶液，于24h內(nèi)不同時(shí)間重復(fù)進(jìn)樣6次，RSD=0.93%，表明供試品溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定。

A.丹參素對(duì)照品色譜圖；B.供試品色譜圖；C陰性對(duì)照色譜圖

圖1 高效液相色譜圖

2.3 結(jié)果

2.3.1 正交實(shí)驗(yàn)評(píng)分

根據(jù)丹參素轉(zhuǎn)移率和干膏收率，將兩指標(biāo)綜合加權(quán)評(píng)分。分別將丹參素轉(zhuǎn)移率、干膏得率最高結(jié)果計(jì)為100，并與之比較，依次對(duì)9次試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行綜合評(píng)分。將丹參素提取率權(quán)重系數(shù)設(shè)為0.7，將干膏得率權(quán)重系數(shù)設(shè)為0.3，綜合評(píng)分=0.7×丹參素轉(zhuǎn)移率+0.3×干膏得率,結(jié)果見(jiàn)表2。

2.3.2 方差分析見(jiàn)表3

表2 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果分析

從試驗(yàn)結(jié)果直觀得出，各因素影響順序?yàn)镃(煎煮次數(shù))>B(煎煮時(shí)間)>A(加水量)；從方差分析結(jié)果得出，C(煎煮次數(shù))P<0.05，具有顯著性，B(煎煮時(shí)間)和A(加水量)不具有顯著性。從生產(chǎn)的實(shí)際考察，為了節(jié)省工時(shí)，節(jié)省能源，優(yōu)選煎煮工藝為A2B3C2，即加10倍量水，煎煮2次，每次2h。

表3 方差分析表

注：F0.05=19.00 F0.01=99.00；“*”表示有顯著性

2.4 工藝驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

分別稱取50倍量處方藥材，共3份，按照確定的優(yōu)選工藝條件A2B3C2進(jìn)行重復(fù)驗(yàn)證，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 工藝驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.5 結(jié)論

通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)選和工藝驗(yàn)證，確定了增率復(fù)脈顆粒水煮最佳工藝參數(shù)為：處方藥材加10倍量水，煎煮2次，每次2h。在此工藝條件進(jìn)行3次工藝驗(yàn)證試驗(yàn)，丹參素轉(zhuǎn)移率在60%以上，RSD=1.26%，表明該最佳工藝條件是穩(wěn)定可靠，可用于增率復(fù)脈顆粒工藝提取。

3 討論

(1)采用高效液相色譜法測(cè)定丹參素含量的文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)較多[5-6]，我們?cè)捎眉状?冰乙酸-水(5：1：94)、甲醇-0.1%磷酸(10：90)等多種流動(dòng)相進(jìn)行分離，供試品中丹參素色譜峰未能得到充分分離；后采用乙腈酸水系流動(dòng)相試驗(yàn)，經(jīng)多次摸索，供試品中丹參素色譜峰得以充分分離，最后確定流動(dòng)相為：乙腈-0.5%乙酸(2：98)。

(2)曾采用Agilent ZORBAX SB-C18(5μm,4.6×150mm)色譜柱進(jìn)行試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)丹參素色譜峰與后面雜質(zhì)峰未能達(dá)到充分分離，選用Agilent ZORBAX SB-C18(5μm,4.6×250mm)色譜柱，供試品中丹參素色譜峰得以充分分離。

(3) 供試品溶液制備過(guò)程中滴加鹽酸，可提高乙酸乙酯萃取效果；加氯化鈉可減少乳化。

[1] 錢 峰，于清華，張曉華，等.于作盈教授治療病態(tài)竇房結(jié)綜合征經(jīng)驗(yàn)[J].中國(guó)中醫(yī)急癥，2013，22 (10)：1711-1729.

[2] 增率復(fù)脈顆粒藥效試驗(yàn)，本項(xiàng)目研究資料待發(fā)表.

[3] 江玲麗，程建明.正交試驗(yàn)優(yōu)選宣肺化痰方水提工藝[J].現(xiàn)代中藥研究與實(shí)踐，2015，29(5):43-45.

[4] 李全斌，張昌文，吳建萍，等.活血定痛合劑中丹參素和原兒茶醛的含量測(cè)定[J].實(shí)用藥物與臨床，2014，17(9)：1170-1174.

[5] 李蕓薈.HPLC法測(cè)定冠心寧軟膠囊中丹參素的含量[J].天津藥學(xué)，2015，27(3)：16-17.

[6] 楊炳火，夏崇才，周芙瓊，等.正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化超聲煎煮法提取丹參中丹參素的研究[J].環(huán)球中醫(yī)藥，2014，7(12)：926-928.

(本文文獻(xiàn)格式：張大軍，張曉華，王兆華.正交試驗(yàn)法優(yōu)選增率復(fù)脈顆粒水提工藝[J].山東化工，2016，45(12)：28-30.)

Optimization of Extraction Techenology of Zengmaifulv Granules by Orthogonal Test

Zhang Dajun*,Zhang Xiaohua,Wang Zaohua

(Academy of Chinese Medical Sciences of Jilin Province, Changchun 130012,China)

Objective：To establish the best decoction technology of Zengmaifulv granules .Methods：Take transport rate of Danshensu and extractive of Chinese herbal decoction pieces as an indecator to determine the extraction process of Zengmaifulv granules. Results：Herbs plus 10 times amount of water to decoct 2times,boiling 2hours every time. Conclusion： The optinized techenology is stable and reliable, can be used tor the extraction of Zengmaifulv granules.

zengmaifulv granules; orthogonal test; HPLC; danshensu

2016-04-18

吉林省中醫(yī)藥專題研究項(xiàng)目(20152T22)

張大軍(1964—)，主任藥師，研究方向：中藥新藥與制劑。

TQ461

A

1008-021X(2016)12-0028-03