敖　瀾，劉　清，胡　娜，趙紫豪，胡海霞，方廖瓊，*

（1.西南大學(xué)生物技術(shù)學(xué)院，重慶　400716；2.重慶醫(yī)科大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)院省部共建超聲醫(yī)學(xué)工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室超聲醫(yī)學(xué)工程重慶市市級(jí)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶　400016）

SD大鼠胰腺組織在聚焦超聲消融損傷后的血管生成

敖瀾1，劉清1，胡娜1，趙紫豪1，胡海霞2，方廖瓊1，2*

（1.西南大學(xué)生物技術(shù)學(xué)院，重慶400716；2.重慶醫(yī)科大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)院省部共建超聲醫(yī)學(xué)工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室超聲醫(yī)學(xué)工程重慶市市級(jí)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶400016）

目的通過(guò)檢測(cè)經(jīng)聚焦超聲（FUS）消融的SD大鼠胰腺組織凝固性壞死區(qū)中Tie-2受體mRNA的表達(dá)和組織學(xué)結(jié)構(gòu)變化，探討FUS消融對(duì)凝固性壞死組織的血管生成的影響。方法隨機(jī)將4～6周齡的SPF級(jí)SD大鼠60只分為FUS組（50只），對(duì)照組（10只）。FUS局部消融SD大鼠胰腺組織后，分別取消融后1周，2周，1個(gè)月，3個(gè)月，6個(gè)月和對(duì)照組的胰腺組織。用RT-PCR的方法，以GAPDH基因?yàn)閮?nèi)參，進(jìn)行半定量分析檢測(cè)Tie-2 mRNA的表達(dá)；同時(shí)HE染色、光學(xué)顯微鏡下觀察凝固性壞死區(qū)組織學(xué)的變化；免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)胰腺組織中Tie-2的表達(dá)。結(jié)果RT-PCR檢測(cè)到Tie-2 mRNA在對(duì)照組和FUS消融組織中均有表達(dá)。與對(duì)照組相比，F(xiàn)US消融后1、2周Tie-2 mRNA的表達(dá)量降低（P＜0.01），消融后1個(gè)月mRNA表達(dá)量增多，于消融后3個(gè)月達(dá)到最大值（P＜0.01），消融后6個(gè)月表達(dá)量逐漸降低，但仍高于對(duì)照組（P＜0.01）。組織學(xué)表明，F(xiàn)US消融后在凝固性壞死區(qū)有新生血管的逐步形成。免疫組織化學(xué)表明，在正常的胰腺組織中有Tie-2的表達(dá)，但在FUS消融胰腺組織中Tie-2的表達(dá)增多。結(jié)論在FUS消融后6個(gè)月內(nèi)，大鼠胰腺凝固性壞死區(qū)域內(nèi)有新生血管的生成，且比正常血管生成速度快。

血管生成；超聲，聚焦；胰腺；大鼠，Sprague-Dawley

血管生成發(fā)生在許多生理和病理的過(guò)程中，包括胚胎發(fā)育、損傷修復(fù)和腫瘤的生長(zhǎng)［1-3］。Tie-2是內(nèi)皮特異性受體酪氨酸激酶家族的成員［4-5］，主要表達(dá)在內(nèi)皮細(xì)胞上，在成體的血管組織中，Tie-2起了重要的作用，其能夠在缺血、缺氧及炎癥存在的情況下表達(dá)上調(diào)［6］。Tie-2是血管生長(zhǎng)、重構(gòu)的重要調(diào)節(jié)因子［7］，并可能有促進(jìn)血管生成和維持血管穩(wěn)定性的作用［8］。聚焦超聲（focused ultrasound，F(xiàn)US）是近年興起的一種腫瘤治療技術(shù)，已用于實(shí)體腫瘤的臨床治療，其可在短時(shí)間（0.5～1.0 s）內(nèi)使靶點(diǎn)迅速升溫并發(fā)生蛋白質(zhì)變性和不可逆的凝固性壞死，而且不損傷其覆蓋的和周?chē)闹匾鞴伲?-10］。胰腺具有內(nèi)分泌和外分泌的功能且有一定的自我修復(fù)能力［11］，其功能活躍，血液循環(huán)豐富。FUS雖已用于胰腺癌等疾病的治療并取得了一定療效［12］，但基礎(chǔ)研究的匱乏阻礙了其進(jìn)一步發(fā)展。FUS消融胰腺是否會(huì)影響胰腺修復(fù)過(guò)程中的血管生成鮮有報(bào)道。本研究通過(guò)RT-PCR和組織學(xué)及免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)Tie-2的表達(dá)，以初步探討FUS消融SD大鼠胰腺后凝固性壞死區(qū)組織血管生成的過(guò)程。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組選取4～6周齡的SPF級(jí)SD大鼠60只，體質(zhì)量130～150 g，雌雄各半，隨機(jī)分為2組：FUS組（50只），對(duì)照組（10只），由重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。本研究通過(guò)重慶醫(yī)科大學(xué)生物醫(yī)學(xué)研究委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2FUS消融大鼠胰腺SD大鼠術(shù)前12 h禁食，不禁飲。經(jīng)3%戊巴比妥鈉（1.2 ml/kg體質(zhì)量）腹腔注射麻醉后，備皮，將動(dòng)物固定于手術(shù)板上，脫毛處理，常規(guī)消毒鋪巾。于劍突下0.5 cm處沿正中線(xiàn)依次切開(kāi)皮膚、肌肉層，并挑破腹膜，暴露腹腔，擠壓左腹部致胃暴露，然后輕柔牽扯胃體暴露全部胰腺。FUS設(shè)備（CZF，重慶海扶技術(shù)有限公司）換能器頻率為9.7 MHz，輸出功率5 W。輻照時(shí)，將探頭垂直緊貼胰腺，采用無(wú)菌生理鹽水作為耦合劑，移動(dòng)治療頭從點(diǎn)到線(xiàn)再到面，在每一個(gè)治療點(diǎn)停留6 s直至出現(xiàn)可見(jiàn)的凝固性壞死，然后移動(dòng)到下一個(gè)治療點(diǎn)，完成后逐層關(guān)腹。對(duì)照組未開(kāi)啟治療頭能量，其他操作均一致。

1.3組織學(xué)與免疫組織化學(xué)檢查將FUS組大鼠分別于消融后1周、2周、1個(gè)月、3個(gè)月、6個(gè)月處死，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)取10只，獲取胰腺組織，采用4%多聚甲醛固定，常規(guī)石蠟切片，HE染色觀察組織病理學(xué)變化，免疫組織化學(xué)觀察組織Tie-2的表達(dá)。一抗為兔抗大鼠的Tie-2多克隆抗體（sc-9026，Santa Cruz Biotechnology），二抗為抗兔的免疫球蛋白（PV-9001）。反應(yīng)產(chǎn)物按DAB試劑盒（ZLI9018）說(shuō)明進(jìn)行染色。光學(xué)顯微鏡（BX51，Olympus）下觀察拍照，內(nèi)皮細(xì)胞膜上出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽(yáng)性表達(dá)。每張切片隨機(jī)選擇5個(gè)高倍鏡視野計(jì)分：陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)＜10%為0分；10%～30%為1分；＞30%～50%為2分；＞50%～70%為3分；＞70%為4分。同時(shí)按著色強(qiáng)度計(jì)分：染色弱，呈淡黃色者為1分；染色中等，呈黃色者為2分，染色強(qiáng)，呈棕黃色者為3分。兩種計(jì)分相加（0～7分）：0分為陰性（-）；1～2分為弱陽(yáng)性（+）；3～4分中度陽(yáng)性（++）；5～7分強(qiáng)陽(yáng)性（+++）。

1.4Tie-2 mRNA水平檢測(cè)剩余胰腺部分取其凝固性壞死區(qū)組織，利用Trizol提取總RNA（Trizol試劑說(shuō)明書(shū)），經(jīng)電泳鑒定其完整性，NanoDrop2000酶標(biāo)儀（賽默飛）測(cè)定RNA濃度和OD 260/280比值。各取2 μg總RNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)生成cDNA，以2 μl cDNA為模板進(jìn)行RT-PCR，總體積為50μl，檢測(cè)Tie-2表達(dá)水平隨時(shí)間的變化情況。Tie-2引物序列：5'-TCCCTACCTCTTGTGTCTGA-3'/5'-CCTGTCCACGGTCATAGTTA-3'；以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）作為內(nèi)參照，其引物序列為：5'-AACGACCCCTTCATTGAC GG-3'/5'-TCCACGACATACTCAGCAC-3'。擴(kuò)增片段的長(zhǎng)度分別為315、190 bp。PCR產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分析。每個(gè)時(shí)間點(diǎn)各取10只大鼠，每只取3次電泳結(jié)果進(jìn)行計(jì)算及圖像處理，以GAPDH為參照進(jìn)行半定量分析。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)分析軟件。數(shù)據(jù)以±s表示，采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1血管生成的組織學(xué)特征HE染色后可見(jiàn)FUS消融后1～2周，輻照區(qū)細(xì)胞結(jié)構(gòu)被破壞，胞質(zhì)淡染，細(xì)胞輪廓不明顯，只有少量的血管結(jié)構(gòu)；輻照后1個(gè)月，凝固性壞死開(kāi)始被逐漸吸收，被吸收部分呈網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，損傷灶可見(jiàn)新生血管結(jié)構(gòu)；輻照后3～6個(gè)月，凝固性壞死被大量吸收，損傷灶區(qū)域可見(jiàn)大量的新生血管結(jié)構(gòu)。見(jiàn)圖1。

2.2胰腺組織細(xì)胞Tie-2的表達(dá)免疫組織化學(xué)染色發(fā)現(xiàn)，在正常胰腺組織已存在的血管中，Tie-2在內(nèi)皮細(xì)胞中呈弱表達(dá)（圖2A），F(xiàn)US消融1個(gè)月后，Tie-2表達(dá)量逐漸增多，在消融后3個(gè)月時(shí)Tie-2的表達(dá)量達(dá)到最大（圖2B），強(qiáng)陽(yáng)性率為19.9%，而對(duì)照組強(qiáng)陽(yáng)性率為4.5%（圖2C）。

圖1　FUS消融大鼠胰腺后，各時(shí)間點(diǎn)胰腺組織病理圖（HE，×200） A.正常的胰腺組織；B.FUS消融1周后的胰腺組織；C.FUS消融2周后的胰腺組織；D.FUS消融1個(gè)月后的胰腺組織；E.FUS消融3個(gè)月后的胰腺組織；F.FUS消融6個(gè)月后的胰腺組織　箭示血管

圖2　Tie-2在SD大鼠胰腺正常組織和FUS消融后組織的表達(dá)　A.Tie-2在胰腺組織已存在的血管中呈弱陽(yáng)性表達(dá)（DAB，×200）；B.FUS消融后3個(gè)月時(shí)Tie-2在消融組織的表達(dá)（DAB，×200）；C.2組FUS消融后3個(gè)月Tie-2的強(qiáng)陽(yáng)性率比較

2.3胰腺組織Tie-2 mRNA表達(dá)水平RT-PCR的結(jié)果顯示Tie-2在正常胰腺組織和消融胰腺組織中均可有表達(dá)（圖3），GAPDH mRNA作為內(nèi)參在所有樣本中均可檢測(cè)到。FUS消融后1、2周時(shí)，與對(duì)照組相比，F(xiàn)US組Tie-2 mRNA的表達(dá)量明顯降低（P＜0.01）；在消融后1個(gè)月時(shí)，mRNA表達(dá)量增多，在消融后3個(gè)月達(dá)到最大值，與對(duì)照組相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.01）；消融后6個(gè)月時(shí)表達(dá)量逐漸降低，但仍高于對(duì)照組（P＜0.01），見(jiàn)圖4。

圖3　Tie-2 mRNA　在對(duì)照組和FUS組中表達(dá)的RT-PCR分析從左到右依次為條帶1～6。條帶1：正常胰腺組織；條帶2：消融后1周的胰腺組織；條帶3：消融后2周的胰腺組；條帶4：消融后1個(gè)月的胰腺組織；條帶5：消融后3個(gè)月的胰腺組織；條帶6：消融后6個(gè)月的胰腺組織

圖4　RT-PCR檢測(cè)在對(duì)照組和FUS組中Tie-2 mRNA的相對(duì)表達(dá)量?。?：與對(duì)照組相比，P＜0.01）

3　討論

FUS是一種非侵入性的治療方法，其將來(lái)自體外裝置的超聲能量聚焦使靶區(qū)產(chǎn)生凝固性壞死和細(xì)胞凋亡［13-14］，損傷區(qū)的凝固性壞死組織會(huì)逐漸被吸收，進(jìn)而被新生的組織替代，以達(dá)到治療的目的，且不會(huì)引起周?chē)M織的損傷。血管生成在組織形成的過(guò)程中起重要作用，因?yàn)樵偕M織需要新生血管供給必需的氧氣和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。胰腺是一個(gè)重要的敏感器官，其本身具有一定的自我修復(fù)能力。本研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)US消融SD大鼠胰腺后，隨著時(shí)間的推移，凝固性壞死逐漸被吸收，同時(shí)新生血管逐漸產(chǎn)生，說(shuō)明FUS不僅能使組織產(chǎn)生凝固性壞死，而且能促進(jìn)組織再生過(guò)程中的血管生成。

Tie-2是內(nèi)皮細(xì)胞上特有的酪氨酸激酶受體之一［15-16］，并且這些激酶在胚胎血管發(fā)育的過(guò)程中發(fā)揮著重要作用［17-18］。研究［19-21］報(bào)道，在與損傷修復(fù)和乳腺癌相關(guān)的內(nèi)皮細(xì)胞的血管生成中，Tie-2受體表達(dá)上調(diào)，且這些研究均證明Tie-2受體在血管生理學(xué)和病理學(xué)中起重要作用。但FUS消融后，組織修復(fù)的過(guò)程中Tie-2表達(dá)是否受到影響尚未知。本研究檢測(cè)到Tie-2 mRNA在正常胰腺組織和消融胰腺組織中均有表達(dá)，F(xiàn)US消融后1周和2周，Tie-2 mRNA表達(dá)量降低，在消融后1個(gè)月，mRNA表達(dá)量增多，于消融后3個(gè)月達(dá)到最大值，與免疫組織化結(jié)果相同，在消融后6個(gè)月，表達(dá)量逐漸降低。研究［22］報(bào)道在皮膚損傷修復(fù)的血管生成中也涉及Tie-2表達(dá)的上調(diào)，說(shuō)明Tie-2在血管生成中起到重要的作用。FUS消融胰腺組織后1周，檢測(cè)到Tie-2 mRNA表達(dá)量降低，說(shuō)明FUS消融后仍有血管存在，可能是由于FUS只破壞2 mm以下的小血管。Hynyen等［23］用 FUS照射直徑小于0.2 mm的腫瘤微血管后，血管立即破壞，血管內(nèi)皮細(xì)胞消失，基底膜出現(xiàn)裂隙。這些結(jié)果均表明，F(xiàn)US輻照SD大鼠胰腺后，有新生血管形成，且比正常血管形成速度快，故FUS與血管生成的過(guò)程有關(guān)。在輻照區(qū)血管生成速度加快的原因可能是由于FUS輻照后，雖對(duì)胰腺有一定的破壞作用，但同時(shí)胰腺有一定的自我修復(fù)能力，在損傷后的修復(fù)過(guò)程中，需血管提供充分營(yíng)養(yǎng)，因此損傷后的血管生成速度變快，但具體的機(jī)制還需進(jìn)一步研究。

綜上所述，F(xiàn)US對(duì)血管生成具有一定的促進(jìn)作用，有望為一些血管性疾病的治療帶來(lái)新的思路。同時(shí)，利用FUS治療胰腺癌等疾病，要特別注意消融損傷對(duì)血管的影響，消融完全徹底才會(huì)達(dá)到滿(mǎn)意的治療效果。

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Angiogenesis after focused ultrasound ablation on pancreas of SD rats

AO Lan1，LIU Qing1，HU Na1，ZHAO Zihao1，HU Haixia2，F(xiàn)ANG Liaoqiong1，2*
（1.College of Biotechnology，Southwest University，Chongqing 400716，China；2.State Key Laboratory of Ultrasound Engineering in Medicine Co-founded by Chongqing and the Ministry of Science and Technology，Chongqing Key Laboratory of Ultrasound in Medicine and Engineering，College of Biomedical Engineering，Chongqing Medical University，Chongqing 400016，China）

ObjectiveTo evaluate the effect of angiogenesis of coagulation necrosis tissue and the Tie-2 expression after focused ultrasound（FUS）ablation on the pancreas of SD rats by detecting the expression of Tie-2 mRNA and the histologic structure changes.MethodsTotally 60 healthy SD rats of 4 to 6 weeks age were randomly divided into FUS group（n=50）and control group（n=10）.Ablated pancreatic specimens were obtained at 0（normal pancreas），the 1st week，the 2nd week，the 1st month，the 3rd month and the 6th month after FUS focal ablation for RT-PCR，histology and immunohistochemical analysis.The Tie-2 mRNA expression was detected by half quantitative analysis using RT-PCR method.Pancreatic tissue was dyed with HE stain and examined pathologically under an optical microscope for the coagulation necrosis area.Furthermore，the expression of Tie-2 was observed by immunohistochemistry.ResultsExpression of Tie-2 mRNA was detected in normal pancreatic tissue and the abated tissues by RT-PCR.Compared with the control group，expression of Tie-2 decreased on the 1st and 2nd weeks after FUS ablation（P＜0.01），but mRNA expression increased on the 1st month and reached a maximum on the 3rd month（P＜0.01），and the expression gradually reduced on the 6th month after FUS ablation，but the level was still higher than the control group.Histology showed that formation of new blood vessels were observable at the ablation area after the treatment.Immunohistochemically，Tie-2 was expressed in the pre-existing vessels of the normal pancreatic tissue，and Tie-2 expression increased in the ablated pancreatic tissue.ConclusionIn the period of the 6 month after FUS ablation，there are new blood vessels formation in the coagulation necrosis area of rats 'pancreas and it is associated with the expression of Tie-2.

Angiogenesis；Ultrasound，focused；Pancreas；Rat，Sprague-Dawley

R361.2；R445.1

A

1672-8475（2016）08-0495-05

10.13929/j.1672-8475.2016.08.011

敖瀾（1990—），女（滿(mǎn)族），黑龍江佳木斯人，在讀碩士。研究方向：聚焦超聲治療胰腺癌。E-mail：m15213340965_1@163.com

方廖瓊，西南大學(xué)生物技術(shù)學(xué)院，400716；重慶醫(yī)科大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)院省部共建超聲醫(yī)學(xué)工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室超聲醫(yī)學(xué)工程重慶市市級(jí)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，400016。E-mail：lqfang06@163.com

2015-12-06

2016-01-04