李甫梧 王麗華 宋世平

（中國(guó)科學(xué)院上海應(yīng)用物理研究所 嘉定園區(qū) 上海 201800）

綜述

基于電化學(xué)分析法定量檢測(cè)MicroRNA的生物傳感器

李甫梧 王麗華 宋世平

（中國(guó)科學(xué)院上海應(yīng)用物理研究所 嘉定園區(qū) 上海 201800）

就miRNA電化學(xué)法檢測(cè)中探針材料選擇、信號(hào)放大方式、電極傳感界面調(diào)控以及電化學(xué)檢測(cè)方法在研究輻射對(duì)miRNA表達(dá)的影響方面的潛在應(yīng)用等方面進(jìn)行綜述。

MicroRNA，癌癥，生物標(biāo)記物，電化學(xué)，生物傳感器

miRNA在基因的表達(dá)調(diào)控、細(xì)胞分化和凋亡中都發(fā)揮著重大的作用。更有進(jìn)一步的研究表明，miRNA和癌癥也有著高度的相關(guān)性，miRNA在腫瘤和正常組織細(xì)胞內(nèi)表達(dá)水平具有顯著性差異。檢測(cè)體內(nèi)疾病特異性miRNA可以更加有效地診斷、監(jiān)控和評(píng)估疾病，并且可以幫助我們確定個(gè)體病人最佳的使用藥物。因此，miRNA檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展可以加速個(gè)性化診斷和精準(zhǔn)醫(yī)療的進(jìn)程［7］。更值得一提的是，最近研究發(fā)現(xiàn)miRNA也穩(wěn)定存在于血清和其他體液中［8］。目前有研究表明，對(duì)血清中和疾病相關(guān)的miRNA檢測(cè)可用于疾病的早期診斷［9］?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)乳腺癌、惡性膠質(zhì)瘤、結(jié)腸直腸癌、胰腺癌、胃癌、非小細(xì)胞肺癌、肝癌、甲狀腺乳頭狀癌、宮頸癌、成神經(jīng)細(xì)胞瘤和卵巢癌的腫瘤細(xì)胞中miRNA表達(dá)量均有異常［10］。

由于miRNA的長(zhǎng)度很短，并且通常miRNA的濃度很低，想要在臨床上準(zhǔn)確地檢測(cè)仍然具有很大的挑戰(zhàn)［11］。雖然Northern blotting是檢測(cè)miRNA的標(biāo)準(zhǔn)方法，常用來(lái)評(píng)價(jià)其它的檢測(cè)miRNA方法的可靠性，然而這個(gè)方法不僅需要很大的工作量和時(shí)間來(lái)完成，而且其靈敏度較低，還需要大量的RNA樣品［12-13］。Real-time PCR（RT-PCR）最大的缺點(diǎn)是價(jià)格昂貴，不僅購(gòu)買(mǎi)整套的機(jī)器系統(tǒng)價(jià)格昂貴，其維持和運(yùn)行費(fèi)用也相當(dāng)可觀，普通實(shí)驗(yàn)室難以開(kāi)展此項(xiàng)目，使其使用受限，并且使用該門(mén)技術(shù)還需要經(jīng)過(guò)專(zhuān)門(mén)的訓(xùn)練［14］。因此，近幾年很多有別于RT-PCR和Northern blot新方法被提出來(lái)。新方法基于不同的檢測(cè)方式，包括比色法［15］、測(cè)序［16-17］、微陣列［18］、拉曼散射［19］、電化學(xué)發(fā)光［20］、熒光法［21］和電化學(xué)［22］等。這些方法不僅減少了步驟上的復(fù)雜性，并且降低了成本［23］，本文主要對(duì)電化學(xué)分析法進(jìn)行闡述。電化學(xué)分析方法具有高靈敏度、高特異性、操作簡(jiǎn)單、低成本、快速和檢測(cè)儀器尺寸小等優(yōu)點(diǎn)［24-25］，因此，近些年來(lái)越來(lái)越多的研究團(tuán)隊(duì)將電化學(xué)分析方法用于miRNA的檢測(cè)。Gao等［26-27］最先利用電化學(xué)方法在檢測(cè)miRNA上進(jìn)行了嘗試，并以DNA作為捕獲探針（Capture probes， CPs），通過(guò)與miRNA雜交后將電信號(hào)放大達(dá)到了80 fmol/L的檢出限，檢測(cè)范圍80～200 pmol/L。

1 miRNA生物傳感器的靈敏度

由于細(xì)胞內(nèi)、血清和唾液中miRNA濃度很低，而且濃度范圍大（在人血清中從0～1 pmol/L［28］），因而更寬的檢測(cè)范圍和更低的檢出限是研究人員一直追求的。最常用的策略包括使用與miRNA親和力更高的PNA或LNA作為探針材料，或者使用更有效的信號(hào)放大系統(tǒng)提高傳感器的檢出限和檢測(cè)范圍。若要應(yīng)用于臨床，還應(yīng)注意方法的簡(jiǎn)便性和成本的控制。

1.1miRNA生物傳感器的探針材料

寡聚核苷酸（大多為DNA）合成方便而且價(jià)格便宜，研究人員最常用的是利用寡聚核苷酸作為CPs，但由于其帶有磷酸基團(tuán)且空間結(jié)構(gòu)的不太穩(wěn)定性，給miRNA檢測(cè)的靈敏度帶來(lái)了一定的阻礙。后來(lái)肽核酸（Peptide nucleic acid， PNA）和鎖核酸（Locked nucleic acid， LNA）的發(fā)現(xiàn)為miRNA的檢測(cè)提供了很好的工具。DNA、PNA、LNA結(jié)構(gòu)單元見(jiàn)圖2。

1.1.1 以肽核酸作為探針

PNA是一種核酸類(lèi)似物，最初由Nielsen等［30］合成。他們用非手性的聚酰胺骨架代替了磷酸和脫氧核糖構(gòu)成的PNA的基本骨架（圖2）。隨后Egholm等［31］證明了其與互補(bǔ)配對(duì)也遵循Watson-Crick堿基互補(bǔ)配對(duì)原則，并且由于其不帶與miRNA相同的電荷，極大地增強(qiáng)了和miRNA的親和力。同時(shí)，由于其不會(huì)被細(xì)胞中的酶降解，因而可以為miRNA的胞內(nèi)定量分析提供更可靠的探針［32］。

Fan等［33］以PNA為CPs，使用導(dǎo)電聚合物納米線的方法用于對(duì)miRNA進(jìn)行檢測(cè)。他們將PNA固定到有100對(duì)相互連鎖的梳子狀的納米間隙的陣列（Nano-gapped array）上。在與 PNA 序列互補(bǔ)的miRNA雜交后，為CPs上帶去了凈負(fù)電荷后與苯胺/辣根過(guò)氧化物酶（Horseradish peroxidase，HRP）/H2O2共同孵育，質(zhì)子化的苯胺分子附著到帶負(fù)電的miRNA-PNA雙鏈上，形成聚苯胺納米線。然后這些納米線被參雜著HCl的蒸汽擴(kuò)充，創(chuàng)建了一個(gè)導(dǎo)電網(wǎng)絡(luò)，橋接了這個(gè)生物傳感器陣列的間隙。檢測(cè)范圍10～20 pmol/L，檢出限可以達(dá)到5 fmol/L。Gao等［34］將生物素化的 PNA 作為探測(cè)探針（Detection probes， DPs），修飾有Avidin的葡萄糖氧化酶特異性吸附在一起形成復(fù)合物（GOx-DPs），當(dāng)環(huán)狀的CPs（5′端和3'端分別含有與miRNA和DPs的互補(bǔ)序列）和靶標(biāo)miRNA結(jié)合后環(huán)狀CPs，就露出DPs的結(jié)合部位，在GOx-DPs結(jié)合到CPs上后加入葡萄糖反應(yīng)即可產(chǎn)生氧化還原信號(hào)。最適條件下其檢出限達(dá)到4.0 fmol/L，范圍4.0～10 pmol/L。

1.1.2 以鎖核酸作為探針

LNA最早由Neely等［35］用于miRNA檢測(cè)分析。LNA是一種新型核酸，包含了RNA的核糖環(huán)的2′的氧原子和4′ 的碳原子連接起來(lái)的亞甲基（圖2），可以減少核糖構(gòu)象的多樣性并且增加磷酸骨架部分區(qū)域的穩(wěn)定度［36］?；谶@個(gè)結(jié)構(gòu)，LNA對(duì)與其互補(bǔ)的DNA或者RNA序列具有很高的親和力［37］。當(dāng)使用LNA作為探針時(shí)，與傳統(tǒng)的RNA或DNA寡聚核苷酸鏈作為探針相比，靈敏度提高大約10倍［38］。也有文獻(xiàn)報(bào)道，若使用頸環(huán) LNA作為捕獲探針可以提高其選擇性和靈敏度［39］。

Yin等［40］的研究中以LNA作為探針，功能化的金納米顆粒（Au nanopaticles， AuNPs）作為信號(hào)放大系統(tǒng)，AuNPs上包被了一段LNA和若干與Biotin修飾的DNA。實(shí)驗(yàn)中所用電極為石墨烯和樹(shù)突狀的納米金修飾的玻璃碳復(fù)合物，探針上帶有與靶標(biāo)miRNA和AuNPs上的LNA互補(bǔ)的序列，是一個(gè)不帶熒光基團(tuán)和淬火基團(tuán)的分子信標(biāo)。當(dāng)靶標(biāo)miRNA與探針互補(bǔ)后，這個(gè)莖環(huán)結(jié)構(gòu)的分子信標(biāo)被打開(kāi)與miRNA互補(bǔ)配對(duì)形成雙螺旋結(jié)構(gòu)，露出和 AuNPs上 LNA互補(bǔ)序列，并將其固定在電極表面。再加入Streptavidin-HRP，在室溫下孵育后加入底物對(duì)苯二酚和 H2O2產(chǎn)生電化學(xué)信號(hào)，其檢出限可以達(dá)到0.06 pmol/L。后來(lái)Yin等［10］在原來(lái)的基礎(chǔ)上，使用了帶有兩種不同序列LNA（S4， S5）功能化的AuNPs可以被作者設(shè)計(jì)的“橋狀”雙鏈DNA所捕獲。組成這個(gè)“橋狀”的雙鏈DNA的兩條脫氧核苷酸鏈的中間一段序列是互補(bǔ)配對(duì)的，兩端以兩條相互獨(dú)立的單鏈的形式存在。一端用于與兩個(gè)帶有 S4序列LNA的相連，另一端的兩條單鏈其中一條與S5相連，而另外一條在CPs與miRNA雜交環(huán)形結(jié)構(gòu)打開(kāi)后，露出的5′ 端有其互補(bǔ)序列（圖3）。

這樣的設(shè)計(jì)將其上一個(gè)研究工作的信號(hào)進(jìn)一步放大，其檢出限達(dá)到了6fmol/L［10］。這些技術(shù)利用酶聯(lián)反應(yīng)和一些納米材料對(duì)信號(hào)進(jìn)行放大，并加入對(duì)核酸親和力更高的PNA或者LNA作為CPs，得到了足夠高的靈敏度［41］。

1.2信號(hào)放大系統(tǒng)

由于 miRNA的長(zhǎng)度很短，而且在細(xì)胞內(nèi)的濃度很低，僅依靠miRNA本身所帶的負(fù)電荷為電極表面帶去的電信號(hào)很難檢測(cè)到或準(zhǔn)確測(cè)量，因此我們必須借助于一定的信號(hào)放大系統(tǒng)來(lái)增強(qiáng)傳感器的靈敏度。最常用的是體系中加入一些電化學(xué)活性分子或是使用 HRP催化其底物發(fā)生氧化還原反應(yīng)進(jìn)而給電極帶去電信號(hào)［12，40］，從而實(shí)現(xiàn)信號(hào)的放大。

Heeger等［42］利用二茂鐵作為信號(hào)輸出原件，將一段一端修飾巰基另一端連有一個(gè)二茂鐵分子的捕獲探針自組裝到金電極表面，這段探針具有類(lèi)似于熒光分子信標(biāo)的莖環(huán)結(jié)構(gòu)。在未發(fā)生雜交反應(yīng)時(shí)，探針處于莖環(huán)構(gòu)型，末端連接的二茂鐵分子處于電極的近端，而當(dāng)溶液中含有靶序列時(shí)，由于雜交反應(yīng)的發(fā)生使莖環(huán)結(jié)構(gòu)打開(kāi)，形成雙鏈DNA的剛性結(jié)構(gòu)，末端連接的二茂鐵分子就會(huì)從電極的近端移動(dòng)到遠(yuǎn)端。這種距離的改變導(dǎo)致電子傳遞效率發(fā)生變化，通過(guò)檢測(cè)二茂鐵分子氧化還原電流的變化可以方便而快速地指示雜交反應(yīng)的發(fā)生，這個(gè)方法的檢出限大約為30 pmol/L。在這個(gè)設(shè)計(jì)中，當(dāng)有一個(gè)靶標(biāo)miRNA分子和探針結(jié)合時(shí)僅能帶給電極表面一個(gè)二茂鐵的氧化還原信號(hào)，因而限制了這個(gè)傳感器的靈敏度。在Wang等［26］2012年的研究中，同樣也以二茂鐵作為氧化還原信號(hào)介質(zhì)。他們以修飾有鏈霉親和素的AuNPs作為載體，將大量二茂鐵固定在AuNPs表面實(shí)現(xiàn)信號(hào)放大。將生物素標(biāo)記的和目標(biāo)miRNA序列相同的寡聚核苷酸和目標(biāo)miRNA共同競(jìng)爭(zhēng)固定化在電極上的探針。伏安法定量分析miRNA的濃度將在生物素標(biāo)記的DNA鏈和二茂鐵包被的AuNPs發(fā)生絡(luò)合反應(yīng)后完成。二茂鐵產(chǎn)生的氧化電流信號(hào)和目標(biāo)miRNA濃度成反比，檢測(cè)范圍10～2.0 pmol/L，檢出限達(dá)10 fmol/L。與此相似，Wang等［43］在金微電機(jī)上固定了一個(gè)修飾了甲基藍(lán)（Methylene blue， MB）的三個(gè)莖環(huán)結(jié)構(gòu)DNA探針，當(dāng)miRNA和探針結(jié)合后，帶有MB的一端會(huì)靠近電極表面，從而得到一個(gè)電子轉(zhuǎn)移的信號(hào)，檢測(cè)限達(dá)到了0.1 fmol/L，并且有一個(gè)較寬的檢測(cè)范圍（亞fmol/L到nmol/L）。MB在電化學(xué)生物傳感器中是一種非常常用的氧化還原指示劑［44］。Yang等［45］以PNA為探針，建立了一個(gè)依賴(lài)于Ru（III）積累在固定于電極表面的核酸上的氧化還原系統(tǒng)，其信號(hào)放大包括鐵氰化物和Ru（III）的再生，實(shí)現(xiàn)了10 amol/L的檢出限，在當(dāng)時(shí)是靈敏度最高的miRNA傳感器。Labib等［28］對(duì)比了向反應(yīng)液中同時(shí)加入K3［Fe（CN）6］和［Ru（NH3）6］Cl3相比不加入的這兩種物質(zhì)的反應(yīng)液可以引起電流強(qiáng)度的增強(qiáng)。Wu等［46］設(shè)計(jì)了一種利用可以使目標(biāo)miRNA不斷地打開(kāi)固定在電極表面的莖環(huán)捕獲探針并再釋放回溶液中的策略，實(shí)現(xiàn)對(duì)信號(hào)的再一次放大，達(dá)到0.35 fmol/L的檢測(cè)限。

滾環(huán)擴(kuò)增（Rolling-circle amplification， RCA）是一種等溫核酸放大系統(tǒng)［47］，RCA不僅可以被應(yīng)用在電極表面［48］，也可以被用在金納米顆粒等納米材料上［49］。現(xiàn)已經(jīng)廣泛應(yīng)用在生物傳感器中，它具有很好的信號(hào)增強(qiáng)作用。Tian等［50］設(shè)計(jì)了一種基于莖環(huán)探針引發(fā)的固相滾環(huán)擴(kuò)增，他們使用碳納米管（Carbon nanotube， CNT）作為一種固相基底，識(shí)別目標(biāo)miRNA的莖環(huán)探針結(jié)合在碳納米管上。當(dāng)靶標(biāo)出現(xiàn)時(shí)，莖環(huán)結(jié)構(gòu)會(huì)被打開(kāi)，引發(fā) RCA過(guò)程，該工作得到了1.2 fmol/L的檢測(cè)限。M iao等［51］的工作更是創(chuàng)造性的把RCA嫁接到DNA四面體納米結(jié)構(gòu)上，得到了50 amol/L極低的檢測(cè)限。

2 信噪比控制

越來(lái)越多的研究喜歡利用自組裝的方式將CPs固定到電極上，在固定化過(guò)程中，由于探針之間可能存在連續(xù)的、較長(zhǎng)的互補(bǔ)序列，因而在固定化之后隨著溫度的降低可能會(huì)引起探針之間形成局部的雙螺旋，從而導(dǎo)致測(cè)量上的誤差。不僅如此，還因?yàn)樘结樕夏承┨囟ǖ墓倌軋F(tuán)能與電極表面發(fā)生特異性吸附（堿基上的N與金電極表面），因此就有必要通過(guò)特定的手段來(lái)提高雜交捕獲效率，降低非特異性吸附，從而改善傳感檢測(cè)的信噪比。

2.1電極表面修飾

在先前報(bào)導(dǎo)的工作中，各式各樣的工作電極被應(yīng)用到 miRNA檢測(cè)中，包括銦錫氧化物［52］、Ag/AgCl、石墨［53-54］、鉑絲［54］、石墨烯復(fù)合材料［55］、玻璃碳［56］、滴汞電極［57］、碳納米管［58］和金［59-61］等。

2010年，Pohlmann等［62］將一種新的檢測(cè)模型應(yīng)用到電化學(xué)檢測(cè)miRNA方面。是一種通過(guò)“缺口”雜交的方法。當(dāng)miRNA不存在時(shí)，CPs和DPs之間無(wú)法被填滿，堿基堆積力無(wú)法固定雜交的復(fù)合物，會(huì)發(fā)生搖晃。當(dāng)miRNA和Gap序列雜交后，報(bào)告酶蛋白（Reporter enzyme）可以為電極界面帶去酶促反應(yīng)產(chǎn)生的電化學(xué)信號(hào)。在這個(gè)方法中，作者使用金作為工作電極，Au-S化學(xué)工藝無(wú)疑對(duì)寡聚核苷酸探針?lè)肿油ㄟ^(guò)自組裝的方式固定化到金電極表面帶來(lái)了極大的便利［63］。在先前提到的Yin的工作中也將CPs或DPs通過(guò)該工藝固定于Au表面［10，40］。由于DNA在電極表面易發(fā)生倒伏等情況，后來(lái)的工作中對(duì)電極表面進(jìn)行了各式各樣的修飾。

由于金表面很容易修飾官能團(tuán)，尤其是帶硫基的化合物，因此越來(lái)越多的研究人員用金作為工作電極。通過(guò)在金電極表面修飾一些其他的化合物如硫基己醇（Mercaptohexanol， MCH）［64］、二硫蘇糖醇（Dithiothreitol， DTT）［65］、己二硫醇（Hexanedithiol，HDT）來(lái)保護(hù)電極表面，他們通常還被混合使用。這種通過(guò)HDT對(duì)寡聚核苷酸3'末端-OH集團(tuán)的修飾，可以減少探針單層自組裝的非特異性吸附，并且可以更好地保證固定好的探針處于一種直立的狀態(tài)以提高雜交的效率［23］。通常有圖4中這種二元、三元分子組成的單層界面（圖4）。Zhang等［24］就利用硫基己醇去阻斷金電極表面以減少表面的非特異性吸附方面進(jìn)行了嘗試。Wang等［26］利用1-乙硫醇去提高探針和miRNA雜交的效率。

利用硫基己醇等對(duì)金電極表面修飾可以一定程度上調(diào)整DNA探針密度，以及防止其倒伏與電極表面進(jìn)而影響進(jìn)一步的雜交，增加探針和靶序列結(jié)合的效率，使實(shí)驗(yàn)結(jié)果可信度更高。

2.2探針密度控制

探針的組裝密度對(duì)雜交效率有著很大影響，并不是越多越好，主要體現(xiàn)在當(dāng)探針過(guò)密時(shí)，帶負(fù)電荷的探針與同樣帶負(fù)電荷的具有互補(bǔ)序列的靶標(biāo)核苷酸鏈的靜電排斥力就越強(qiáng)，進(jìn)而使雜交反應(yīng)難以進(jìn)行。另外，因?yàn)殡s交反應(yīng)發(fā)生在固液界面上，過(guò)大的密度會(huì)增加靶序列與探針雜交時(shí)的空間位阻，位阻會(huì)降低靶序列與探針的接觸機(jī)會(huì)［66］。DNA的組裝也會(huì)被很多因素所影響，比如兩條鏈之間的靜電排斥，分子間的聚合，堿基上的氮原子會(huì)和金電極表面發(fā)生非特異性的相互作用和雙鏈之間較強(qiáng)的相互作用等（圖5）。實(shí)際情況并沒(méi)有文章中的示意圖那么完美。

為了解決以上問(wèn)題，F(xiàn)an的研究組將DNA四面體納米結(jié)構(gòu)作為探針的支架，稱(chēng)為四面體結(jié)構(gòu)探針（Tetrahedron-structured probe， TPS）。DNA四面體納米結(jié)構(gòu)由3條經(jīng)硫醇化的55 nt的DNA片段和一條帶有探針序列的DNA片段組成。將4條單鏈化學(xué)計(jì)量相等地混合在緩沖溶液中，加熱到 95 ℃變性后快速地降溫到 4 ℃，它們就能分層次地組裝起來(lái)。這個(gè)3D的納米結(jié)構(gòu)可以通過(guò)3個(gè)在四面體底部的硫醇與金表面共價(jià)相連可以容易且很穩(wěn)定地錨定在金的表面，將未雜交的探針留在頂部［68］（圖6）。

這個(gè)3D的DNA構(gòu)架在溶液中具有力學(xué)上的剛性，又具有結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。除了以上的優(yōu)點(diǎn)以外，四面體的結(jié)構(gòu)同樣為DNA探針提供了一個(gè)嚴(yán)格的構(gòu)架并且使得探針與探針之間保持一定的空間，為下一階段的雜交降低空間上的障礙［69］。

Fan的課題組在miRNA檢測(cè)中使用了辣根過(guò)氧化物酶（HRP）用于信號(hào)放大，同時(shí)采用了三明治夾心法（Sandwich-type）檢測(cè)方式。首先將TPS固定于金電極表面，四面體頂點(diǎn)的探針帶有部分和目標(biāo)miRNA互補(bǔ)的序列（Probe 1）。生物素標(biāo)記的DNA單鏈作為信號(hào)探針（Probe 2），帶有與miRNA互補(bǔ)的另外一部分序列。當(dāng)三者同時(shí)出現(xiàn)在溶液中時(shí)，由于堿基的互補(bǔ)配對(duì)和堿基堆積力的共同作用下形成一種Probe 1: miRNA: Probe 2的三明治結(jié)構(gòu)。Probe 2上的生物素可以特異性地和avidin-HRP或者多聚HRP（PolyHRP80）結(jié)合，加入底物3，3′，5，5′-四甲基聯(lián)苯胺（3，3′，5，5′ tetramethyl-benzidine， TMB）和H2O2就可以產(chǎn)生電量的電化學(xué)電流信號(hào)。當(dāng)使用Poly-HRP80時(shí)可以檢測(cè)濃度為10 amol/L的miRNA（100 μL內(nèi)含有600分子），靈敏度比使用Avidin-HRP降低了三個(gè)數(shù)量級(jí)。更值得一提的是基于PolyHRP80的電化學(xué)miRNA傳感器可以測(cè)量9個(gè)數(shù)量級(jí)內(nèi)的濃度［70］。后來(lái)他們?cè)僭诨贒NA四面體結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，將四面體結(jié)構(gòu)的頂部的探針換成莖環(huán)（Stem loop）形的探針（Probe 1）。Probe 1上帶有與待測(cè)miRNA和與生物素相連的DNA單鏈（Probe 2）的互補(bǔ)序列。這個(gè)模型的生物傳感器的檢出限達(dá)到了 1 fmol/L［12］。與上一個(gè)方法不同的是環(huán)形的DNA單鏈可以降低非特異性雜交，并且增加了CPs與miRNA和DPs互補(bǔ)序列的長(zhǎng)度，增強(qiáng)了他們形成的雙螺旋的穩(wěn)定性，從而增加其特異性以提高檢測(cè)結(jié)果的可靠性。在這次研究中，他們依然使用HRP以TMB和H2O2作為底物，用于信號(hào)放大作用。Tang等［51，71］同樣也利用DNA四面體納米結(jié)構(gòu)上電極界面調(diào)控做了很多嘗試。利用 RCA和鏈置換反應(yīng)作為放大體系在對(duì)miRNA進(jìn)行檢測(cè)時(shí)也達(dá)到了很好的檢測(cè)效果。

文中所舉的例子可以很好地體現(xiàn)出DNA四面體納米探針應(yīng)用于電化學(xué)生物傳感的優(yōu)勢(shì)，除了上文中提到DNA四面體納米探針在力學(xué)上和調(diào)節(jié)探針空間分布上的具有的一些優(yōu)勢(shì)之外，它還可以控制DNA探針的朝向，使探針不會(huì)倒伏在電極表面而影響進(jìn)一步的雜交，使DNA納米探針從一維進(jìn)化到了三維結(jié)構(gòu)。相較于硫基己醇、1-乙硫醇等對(duì)電極的修飾來(lái)說(shuō)，DNA納米結(jié)構(gòu)可以更好的控制DNA探針的朝向，能使探針在電極表面分布更均一，能更好地去操控整個(gè)傳感界面。

2.3輻射與miRNA

研究表明，一些miRNA的表達(dá)水平和該細(xì)胞系對(duì)輻射敏感性有很大的相關(guān)性。王等［72］研究了不同輻射抗拒鼻咽癌miRNA表達(dá)水平差異的研究。發(fā)現(xiàn)不同輻射抗拒NPC細(xì)胞株CNE -1和CNE-2細(xì)胞的m icroRNA的表達(dá)有差異；差異表達(dá)的miRNA與放療敏感有關(guān)。孫等［73］研究了氚水內(nèi)照射和Co-60 γ射線外照射誘發(fā)小鼠肝組織miRNA表達(dá)改變，篩選電離輻射損傷的特異性 miRNA，探討miRNA在電離輻射損傷中的功能及 m iR-34a在輻射損傷時(shí)對(duì)細(xì)胞周期的調(diào)控機(jī)制應(yīng)用miRNA芯片技術(shù)對(duì)小鼠肝組織miRNA改變進(jìn)行分析，Real-time PCR方法驗(yàn)證篩選出的差異miRNA表達(dá)。p53依賴(lài)途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡是輻射殺傷腫瘤細(xì)胞的機(jī)制之一，肖等［74］的研究表明，miR-34c對(duì)肺腺癌細(xì)胞A549細(xì)胞系有輻射增敏效應(yīng)，可強(qiáng)化p53蛋白的表達(dá)，誘導(dǎo)細(xì)胞在細(xì)胞周期的G1/G0期阻滯和凋亡。在這些研究中，對(duì) miRNA的檢測(cè)大多數(shù)是利用miRNA芯片技術(shù)或 Real-time PCR技術(shù)對(duì)相應(yīng)miRNA進(jìn)行檢測(cè)，這些方法不但昂貴，且耗時(shí)。另外Real-time PCR容易由于反應(yīng)過(guò)程中的污染帶來(lái)假陽(yáng)性的結(jié)果。因此，若上述電化學(xué)檢測(cè)技術(shù)能應(yīng)用到這些研究中去，可以得到更精確輻射和miRNA表達(dá)水平的定量關(guān)系。

2.4當(dāng)前癌癥檢測(cè)方法與miRNA電化學(xué)檢測(cè)法

輻射在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域應(yīng)用以來(lái)，為患者制造了巨大利益，但也存在對(duì)健康不利的影響。目前對(duì)癌癥檢測(cè)最常用的影像學(xué)檢查手段包括超聲，計(jì)算機(jī)斷層顯像［75-76］，磁共振顯像和正電子發(fā)射斷層顯像等。但即使是其中最先進(jìn)、最準(zhǔn)確的方法腫瘤檢出直徑至少也要在2～3 mm，才可以確認(rèn)腫瘤的形成，小于該直徑則被認(rèn)為是正常的突起。另外利用影像學(xué)方法檢查過(guò)程中患者會(huì)被暴露在一定劑量的射線中，對(duì)身體造成傷害，一旦過(guò)量并具有導(dǎo)致癌癥的風(fēng)險(xiǎn)［77］。但對(duì)血清中miRNA檢測(cè)是一種非侵入式的方法，為患者在診斷或是對(duì)預(yù)后進(jìn)行評(píng)估時(shí)極大限度減少了對(duì)患者的傷害，且更適用于普查。因此，利用檢測(cè)血清中的循環(huán)miRNA相比目前主流的幾種影像學(xué)方法要更溫和，對(duì)人體傷害降至最低。

3 總結(jié)與展望

miRNA的重要性已經(jīng)受到廣泛地認(rèn)可，并且miRNA可以在血清中穩(wěn)定存在，對(duì)人類(lèi)疾?。ò┌Y）的診斷和預(yù)測(cè)提供了很好的思路。目前有越來(lái)越多的檢測(cè)方法應(yīng)用于miRNA的檢測(cè)中。PNA及LNA的引入也在一定程度上提高了探針和靶標(biāo) miRNA檢測(cè)的親和力，各種各樣極具特色的信號(hào)放大方式提高了miRNA檢測(cè)時(shí)的靈敏度，AuNPs由于其易和蛋白以及DNA等共價(jià)結(jié)合等性質(zhì)，也已應(yīng)用于各種傳感器中。目前就DNA傳感界面的研究來(lái)說(shuō)，DNA四面體納米結(jié)構(gòu)使探針濃度、在界面的朝向都可以做到可控，且使探針在傳感界面的分布要更均一，因此傳感器能具有更高靈敏度和特異性，目前僅在金電極上有所應(yīng)用，研究者們可以在其他更廉價(jià)的電極（例如碳電極）上對(duì)DNA四面體進(jìn)行嘗試，以便拓寬DNA四面體在生物傳感中的應(yīng)用。電化學(xué)分析方法具有速度快、選擇性好、靈敏度高、分析速度快、成本低且易于微型化等優(yōu)點(diǎn)，是一種非常適用于醫(yī)院的疾病預(yù)測(cè)及診斷的方法。相比目前醫(yī)院中所用到的影像學(xué)方法，不但極大限度地減小了診斷癌癥等疾病時(shí)對(duì)病人身體的損傷，并且有望用于癌癥的早期診斷。電化學(xué)產(chǎn)品可以產(chǎn)業(yè)化，有望做成廉價(jià)的小型POCT產(chǎn)品，服務(wù)于家庭用戶。利用電化學(xué)分析法用于miRNA的臨床檢測(cè)是一種非常有實(shí)際應(yīng)用前景的方法。

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Electrochemical-based biosensors for quantification micro RNA

LI Fuwu WANG Lihua SONG Shiping
(Shanghai Institute of Applied Physics, Chinese Academy of Sciences, Jiading Campus, Shanghai 201800, China)

This review outlines the materials of recognition element， methods of signal amplification， interface regulation of electrode and the potential application of the research area in expression level of miRNA influence by radiation.

MicroRNA， Cancer， Biomarker， Electrochemical， Biosensor

CLC O653

MicroRNA（miRNA）是一種內(nèi)源性、非編碼的具有高度保守性的由大約 23個(gè)核糖核苷酸組成的RNA寡聚物，在動(dòng)物和植物中通過(guò)和編碼蛋白的基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的mRNA以堿基互補(bǔ)配對(duì)的方式結(jié)合，直接對(duì)他們的轉(zhuǎn)錄后水平進(jìn)行抑制［1-3］。最早是Lee等［4］在C. elegans處于發(fā)育后期的胚胎中發(fā)現(xiàn)lin-4 RNA對(duì)lin-14蛋白的表達(dá)起著一種抑制的作用。在后來(lái)的研究中發(fā)現(xiàn)miRNA是從染色體中轉(zhuǎn)錄出來(lái)，為一個(gè)大約由 70個(gè)核苷酸組成的初級(jí)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物叫做Pri-miRNA［5］，一個(gè)Pri-miRNA分子通常包含有幾個(gè)miRNA的序列。Pri-miRNA通過(guò)折疊形成一個(gè)發(fā)夾結(jié)構(gòu)（含有不能完全互補(bǔ)配對(duì)的莖，其長(zhǎng)度從幾百到幾千個(gè)堿基不等），進(jìn)而被RNase III型內(nèi)切酶 Drosha和 Dicer切割成大約 70 bp的Pre-miRNA，而后被Exprotin5蛋白運(yùn)出細(xì)胞核之后被細(xì)胞質(zhì)中的Dicer切割產(chǎn)生大約20 bp的miRNA雙螺旋，解旋后其中一條就成為具有抑制基因表達(dá)功能的miRNA，另外一條則被降解，偶爾也會(huì)有變成兩條miRNA的情況［6］。miRNA的作用方式是通過(guò)與mRNA的3'末端非轉(zhuǎn)錄的區(qū)域結(jié)合，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)基因的表達(dá)［3］。如果一個(gè)miRNA和靶標(biāo)mRNA上的序列不能完全互補(bǔ)，則抑制該 mRNA的翻譯過(guò)程。若完全互補(bǔ)，則該條mRNA將會(huì)被降解（見(jiàn)圖1）。根據(jù)miRNA在細(xì)胞內(nèi)的通路，可以以不同階段的miRNA為靶向，設(shè)計(jì)不同的探針就可以對(duì)細(xì)胞內(nèi)各個(gè)階段的miRNA進(jìn)行定量檢測(cè)。

LI Fuwu （male） was born in March 1991 and received his master degree from Shanghai Institute of Applied Physics，

21 March 2016； accepted 21 April 2016

Ph.D. SONG Shiping， professor， E-mail: spsong@sinap.ac.cn

O653

10.11889/j.1000-3436.2016.rrj.34.030101

國(guó)家重大科學(xué)研究計(jì)劃（2012CB932600、2013CB932800）資助

李甫梧，男，1991年3月出生，2016年6月于中國(guó)科學(xué)院上海應(yīng)用物理研究所獲理學(xué)碩士學(xué)位，生物物理專(zhuān)業(yè)，E-mail: fw lisinap@163.com

宋世平，博士，研究員，E-mail: spsong@sinap.ac.cn

初稿2016-03-21，修回2016-04-21

Supported by the National Basic Research Program of China （2012CB932600， 2013CB932800）

Chinese Academy of Sciences in June 2016， majoring in biophysics. E-mail: fw lisinap@163.com