柴士偉，劉　芳

淫羊藿化學(xué)成分分離鑒定*

柴士偉，劉芳

（天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，天津300193）

［目的］研究淫羊藿葉的化學(xué)成分。［方法］綜合運用溶劑法提取、萃取、正相硅膠、Sephadex LH-20、反相ODS以及制備高效液相色譜等分離純化方法，對淫羊藿葉化學(xué)成分進行分離，通過質(zhì)譜、核磁共振波譜等方法鑒定各單體化合物結(jié)構(gòu)。［結(jié)果］從淫羊藿干燥葉的95%乙醇提取物（V/V）中共分離鑒定7個化合物，分別為2，3，4，6，7-五甲氧基-菲（1）、4，5，-二羥基-2，3，6-三甲氧基-9，10-二氫菲（2）、5，7，4′-三甲氧基-4-苯基香豆素（3）、3，5，7，4′-四甲氧基黃酮（4）、4-羥基-3-異戊二烯基-苯甲酸（5）、4-羥基肉桂酸甲酯（6）、4-羥基-（2E）-2-壬烯酸（7）。［結(jié)論］化合物1～7均為首次從淫羊藿屬分離得到化合物。

淫羊藿；化學(xué)成分；結(jié)構(gòu)鑒定

淫羊藿為小檗科淫羊藿屬植物淫羊藿（Epimedium brevicornu Maxim.）、箭葉淫羊藿［Epimedium sagittatum（Sieb.et Zucc.）Maxim］、柔毛淫羊藿（Epimedium pubescens Maxim.） 或朝鮮淫羊藿（Epimedium koreanum Nakai）的干燥葉，具有補腎陽，強筋骨，祛風(fēng)濕的功效。常用于腎陽虛衰，陽萎遺精，筋骨微軟，風(fēng)濕痹痛，麻木拘攣等［1-5］。文獻報導(dǎo)其主要含有黃酮、菲、木脂素、酚苷以及紫羅酮類等化學(xué)成分［6-12］。本文采用有機溶劑萃取法，結(jié)合正相硅膠、Sephadex LH-20、反相ODS及制備高效液相等柱色譜法，從淫羊藿干燥葉體積分?jǐn)?shù)95%乙醇提取物中分離鑒定了7個化合物，經(jīng)波譜方法鑒定其結(jié)構(gòu)分別為：2，3，4，6，7-五甲氧基-菲（1）、4，5，-二羥基-2，3，6-三甲氧基-9，10-二氫菲（2）、5，7，4′-三甲氧基-4-苯基香豆素（3）、3，5，7，4′-四甲氧基黃酮（4）、4-羥基-3-異戊二烯基-苯甲酸（5）、4-羥基肉桂酸甲酯（6）、4-羥基-（2E）-2-壬烯酸（7），其中化合物1～7均為首次從淫羊藿屬植物分離得到。

1　藥材、儀器和試劑

淫羊藿藥材購買于河北省安國市藥材市場，經(jīng)天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院主任藥師馬瑛鑒定為小檗科淫羊藿屬植物淫羊藿（Epimedium brevicornu Maxim.）的干燥葉，標(biāo)本（20130125）存放于天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院飲片庫房。

制備高效液相色譜儀為Agilent 1200 series（美國安捷倫公司）；制備色譜柱：Agilent Eclipse XDBC18柱（250 mm×21.2 mm，7μm）；Agilent 6410三重四級桿質(zhì)譜儀（美國安捷倫公司）；BRUKER AVANCEⅢ500超導(dǎo)核磁共振波譜儀（瑞士布魯克公司，TMS為內(nèi)標(biāo)）。

柱層析硅膠（青島海洋化工廠分廠）；薄層層析板（天津思利達科技有限公司）；反相ODS（50 μm，120 ?，日本YMC公司）；Sephadex LH-20（美國GE公司）；分析純甲醇、乙醇、石油醚（60～90℃）、乙酸乙酯及色譜純甲醇（天津市康科德科技有限公司）、分析純二氯甲烷、氯仿、丙酮（天津市江天化工技術(shù)有限公司）。

2　提取與分離

20 kg淫羊藿干燥葉粗粉用8倍量體積分?jǐn)?shù)為95%乙醇回流提取3次，每次2 h，濾過，合并濾液，50℃下減壓回收，真空干燥得干膏3 800 g。取3 000 g，加去離子水10 000 mL混懸，用等體積的乙酸乙酯萃取3次，合并乙酸乙酯層，減壓濃縮得乙酸乙酯萃取物約1 000 g。對萃取物進行硅膠柱層析分離，二氯甲烷-丙酮（1∶0→10∶1→5∶1，2∶1→1∶1→0∶1）梯度洗脫，薄層（TLC）檢識，合并相同流分，得8個流分（Fr.1-8）。

Fr.2（100g）經(jīng)硅膠柱色譜，石油醚-丙酮（100∶0→0∶100）梯度洗脫，TLC檢識，合并相同流分，得到12個流分，其中Fr.1.12（620 mg）經(jīng)ODS開放柱色譜和制備高效液相色譜制備得到了化合物1（23 mg）。Fr. 4（112 g）經(jīng)硅膠柱色譜，石油醚-丙酮（100∶0→0∶100）梯度洗脫，得到8個流分，其中Fr.4.7（1120mg）經(jīng)ODS開放柱色譜和制備高效液相色譜分離得到了化合物2（34mg）和化合物4（90mg）。Fr.4.8（935mg）經(jīng)ODS開放柱色譜和制備高效液相色譜分離得到了化合物3（10 mg）。Fr.6（160 g）經(jīng)ODS開放柱色譜和制備高效液相色譜分離得到了化合物7（20 mg）。Fr.8（130 g）經(jīng)硅膠柱色譜，二氯甲烷-甲醇（100∶0→0∶100）梯度洗脫，TLC檢識，合并相同流分，得到15個流分，其中Fr.8.8（510 mg）經(jīng)sephadex LH-20（甲醇洗脫）及ODS開放柱色譜和制備高效液相色譜分離得到了化合物5（65 mg）；Fr.8.15（620 mg）經(jīng)sephadex LH-20及ODS開放柱色譜和制備高效液相色譜分離得到了化合物6（35 mg）?；衔?～7的結(jié)構(gòu)式見圖1。

3　結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1：白色無定形粉末，易溶于甲醇。在正離子MS譜中，可觀測到準(zhǔn)分子離子峰m/z：329.1［M+H］+，推測其分子量為328。在1H-NMR（500MHz，CD3OD）譜低場區(qū)，可以觀測到5個芳香氫質(zhì)子信號：δ 7.19（1H，s，H-1），7.30（1H，s，H-8），7.52（1H，d，J＝8.5 Hz，H-10），7.57（1H，d，J＝8.5 Hz，H-9），9.03（1H，s，H-5）；在中高場區(qū)可以觀測到5個甲氧基質(zhì)子信號δ3.97（3H，s，7-OCH3），3.97（3H，s，3-OCH3），3.98（3H，s，2-OCH3），3.99（3H，s，4-OCH3），4.01（3H，s，6-OCH3）。在13C-NMR（125 MHz，CD3OD）譜上出現(xiàn)14個相應(yīng)的芳香碳信號：δ106.6（C-1），153.2（C-2），143.8（C-3），152.7（C-4），108.9（C-5），150.2（C-6），149.6（C-7），109.7（C-8），127.3（C-9），126.0（C-10），119.7（C-4a），125.6（C-4b），128.9（C-8a）和131.2（C-10a），以及5個甲氧基信號：δ56.2（2-OCH3），61.7（3-OCH3），61.1（4-OCH3），56.4（6-OCH3）和56.3（7-OCH3）。1H、13C-NMR譜數(shù)據(jù)與文獻對照［13］，結(jié)果基本一致，鑒定化合物1為2，3，4，6，7-五甲氧基-菲。

化合物2：白色無定形粉末，易溶于甲醇。在正離子ESI-MS譜中，可以觀測到準(zhǔn)分子離子峰m/z：303.0［M+H］+，推測其分子量為302。在1H-NMR（500 MHz，CD3OD）譜低場區(qū)，可以觀測到3個芳香氫質(zhì)子信號：δ 6.60（1H，s，H-1），6.80（1H，d，J＝8.0 Hz，H-8），6.84（1H，d，J＝8.0 Hz，H-7）；在高場區(qū)可以觀測到一組脂肪氫質(zhì)子信號：δ 2.61（4H，br s，H-9，10）及3個甲氧基質(zhì)子信號δ 3.82（3H，s，3-OCH3），3.87（3H，s，2-OCH3），3.88（3H，s，6-OCH3）。在13CNMR（125 MHz，CD3OD）譜上出現(xiàn)12個相應(yīng)的芳香碳信號：δ 105.6（C-1），153.4（C-2），137.8（C-3），148.3（C-4），142.6（C-5），149.0（C-6），110.8（C-7），120.2（C-8），116.4（C-4a），122.4（C-4b），133.8（C-8a）和137.7（C-10a），以及2個脂肪碳和3個甲氧基信號：δ 31.6（C-9），32.7（C-10），56.8（2-OCH3），61.2（3-OCH3）和56.5（6-OCH3）。1H、13C-NMR譜數(shù)據(jù)與文獻對照［14］，結(jié)果基本一致，鑒定化合物2為4，5，-二羥基-2，3，6-三甲氧基-9，10-二氫菲。

圖1　化合物1～7結(jié)構(gòu)Fig.1　Structures of compounds 1～7

化合物3：白色無定形粉末，易溶于甲醇。在正離子ESI-MS譜中，可以觀測到準(zhǔn)分子離子峰m/z：312.9［M+H］+，推測其分子量為312。在1H-NMR（500 MHz，CD3OD）譜低場區(qū)，可以觀測到一組AA′BB′芳香氫質(zhì)子信號：δ 6.99（2H，d，J＝8.5 Hz，H-3′，5′），7.81（2H，d，J＝8.5 Hz，H-2′，6′），還可觀測到3個孤立的芳香質(zhì)子信號：δ 6.41（1H，s，H-6），6.51（1H，s，H-3），6.64（1H，s，H-8）；在中高場區(qū)可以觀測到3個甲氧基質(zhì)子信號：δ 3.85（3H，s，5-OCH3），3.86（3H，s，4′-OCH3），3.90（3H，s，7-OCH3）。在13C-NMR（125 MHz，CD3OD）譜上出現(xiàn)1個內(nèi)酯羰基信號：δ179.9（C-2）；14個相應(yīng)的芳香碳信號：δ107.1（C-3），163.4（C-4），162.0（C-5），97.4（C-6），166.4（C-7），94.2（C-8），109.1（C-4a），161.2（C-8a），124.3（C-1′），129.0（C-2′，6′），115.5（C-3′，5′）和164.1（C-4′）；碳譜中還可觀測到3個甲氧基信號：δ56.6（7-OCH3），56.5（4′-OCH3）和56.0（5-OCH3）。1H、13C-NMR譜數(shù)據(jù)與文獻對照［15］，結(jié)果基本一致，鑒定化合物3為5，7，4′-三甲氧基-4-苯基香豆素。

化合物4：黃色無定形粉末，易溶于甲醇。在正離子ESI-MS譜中，可以觀測到準(zhǔn)分子離子峰m/z：342.9［M+H］+，推測其分子量為342。在1H-NMR（500 MHz，CD3OD）譜低場區(qū)，可以觀測到2個間位耦合芳香氫信號：δ6.45（1H，d，J＝2.0 Hz）和δ 6.66（1H，d，J＝2.0 Hz）分別為6位和8位氫信號；低場區(qū)還可觀測到B環(huán)的一組AA′BB′芳香氫信號：δ 7.05（2H，d，J＝9.0Hz，H-3′，5′），8.05（2H，d，J＝9.0 Hz，H-2′，6′），提示B對位取代；此外，還可觀測到4個甲氧基質(zhì)子信號：δ 3.77（3H，s，3-OCH3），3.87（3H，s，4′-OCH3），3.90（3H，s，5-OCH3）和 3.91（3H，s，7-OCH3）。在13C-NMR（125 MHz，CD3OD）譜上出現(xiàn)黃酮苷元相應(yīng)的碳信號：δ 155.3（C-2），141.9（C-3），176.0（C-4），162.3（C-5），97.1（C-6），166.3（C-7），93.8（C-8），160.3（C-9），109.8（C-10），123.9（C-1′），131.1（C-2′，6′），115.1（C-3′，5′）和163.2（C-4′），以及4個甲氧基信號：δ 60.3（3-OCH3），56.6（5-OCH3），56.6（7-OCH3）和56.0（4′-OCH3）。1H、13C-NMR譜數(shù)據(jù)與文獻對照［16］，結(jié)果基本一致，鑒定化合物4為3，5，7，4′-四甲氧基黃酮。

化合物5：白色粉末，易溶于氯仿。在正離子ESI-MS譜中，可觀測到準(zhǔn)分子離子峰m/z：207.1［M+H］+，推測其分子量為206。在1H-NMR（500 MHz，CD3OD）譜低場區(qū)，可以觀測到一組ABX芳香氫質(zhì)子信號：δ 6.78（1H，d，J＝8.0 Hz，H-5），7.70（1H，dd，J＝2.0，8.0 Hz，H-6），7.74（1H，d，J＝2.0Hz，H-2）；還可以觀測到1個烯氫信號：δ5.32（1H，t，J＝7.5Hz，H-2′）；在高場區(qū)可以觀測到一組脂肪氫質(zhì)子信號：δ 3.29（2H，m，H-1′）及2個甲基質(zhì)子信號δ 1.72（3H，s，H-4′），1.75（3H，s，H-5′）。13C-NMR（125 MHz，CD3OD）譜上出現(xiàn)6個相應(yīng)的芳香碳信號：δ122.5（C-1），132.5（C-2），129.4（C-3），166.1（C-4），115.3（C-5）和130.5（C-6）；1個羰基碳信號δ170.5（C-7），及一組異戊二烯基信號δ29.0（C-1′），123.3（C-2′），133.7（C-3′），17.9（C-4′），26.0（C-5′）。1H、13C-NMR譜數(shù)據(jù)與文獻對照［17］，結(jié)果基本一致，鑒定化合物5為4-羥基-3-異戊二烯基-苯甲酸。

化合物6：白色無定形粉末，易溶于甲醇。在正離子ESI-MS譜中，可以觀測到準(zhǔn)分子離子峰m/z：179.1［M+H］+，推測其分子量為178。在1H-NMR（500 MHz，CD3OD）譜低場區(qū)，可以觀測到一組AA′BB′芳香氫質(zhì)子信號：δ 6.81（2H，d，J＝9.0Hz，H-3′，5′），7.46（2H，d，J＝9.0Hz，H-2′，6′），及一對反式烯氫信號：δ 6.32（1H，d，J＝16.0 Hz，H-8），7.62（1H，d，J＝16.0 Hz，H-7）；氫譜中還可觀測到1個甲氧基信號：δ 3.35（3H，s，9-OCH3）。在13C-NMR（125 MHz，CD3OD）譜上出現(xiàn)6個相應(yīng)的芳香碳信號：δ127.3（C-1），131.2（C-2，6），116.9（C-3，5），161.3（C-4），一對烯碳信號：δ146.8（C-7），115.4（C-8），1個羰基碳信號δ168.7，以及1個甲氧基信號δ 49.9。1H、13CNMR譜數(shù)據(jù)與文獻對照［18］，結(jié)果基本一致，鑒定化合物6為4-羥基肉桂酸甲酯。

化合物7：白色無定形粉末，易溶于甲醇。在正離子ESI-MS譜中，可以觀測到準(zhǔn)分子離子峰m/z：173.1［M+H］+，推測其分子量為172。在1H-NMR（500 MHz，CD3OD）譜低場區(qū)，可以觀測到一組反式烯氫質(zhì)子信號：δ 5.95（1H，dd，J＝1.5，16.0 Hz，H-2），6.90（1H，dd，J＝5.0，16.0 Hz，H-3）；氫譜中還可觀測到：δ 0.91（3H，t，J＝7.0 Hz，H-9），1.33（4H，m，H-6，8），1.35（2H，m，H-7），1.54（2H，m，H-5），4.21（1H，dd，J＝5.0，11.0Hz，H-4）。在13C-NMR（125 MHz，CD3OD）譜上出現(xiàn)2個相應(yīng)的烯碳信號：δ121.1（C-2），152.7（C-3），71.7（C-4），37.6（C-5），26.2（C-6），23.9（C-7），32.9（C-8），14.4（C-9）；碳譜中還有1個羰基碳信號δ170.2（C-1）。1H、13C-NMR譜數(shù)據(jù)與文獻對照［19］，結(jié)果基本一致，鑒定化合物7為4-羥基-（2E）-2-壬烯酸。

4　結(jié)論

從淫羊藿葉體積分?jǐn)?shù)為95%的乙醇提取物的乙酸乙酯萃取物中分離鑒定了7個化合物，分別為：2，3，4，6，7-五甲氧基-菲（1）、4，5，-二羥基-2，3，6-三甲氧基-9，10-二氫菲（2）、5，7，4′-三甲氧基-4-苯基香豆素（3）、3，5，7，4′-四甲氧基黃酮（4）、4-羥基-3-異戊二烯基-苯甲酸（5）、4-羥基肉桂酸甲酯（6）、4-羥基-（2E）-2-壬烯酸（7）。化合物1～7為首次從淫羊藿屬分離得到化合物。

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（本文編輯：高杉，于春泉）

Isolation and identification of chemical constituents from Epimedium brevicornu Maxim.

CHAI Shi-wei，LIU Fang
（The First Affiliated Hospital of Tianjin University of Traditional Chinese Medicine，Tianjin 300193，China）

［Objective］To investigate chemical constituents from the leave of Epimedium brevicornu Maxim.［Methods］The compounds were purified by solvents extracting and several column chromatography，including silica gel，Sephadex LH-20，ODS and preparative HPLC.Their structures were identified by MS and NMR spectra.［Results］Seven compounds were separated from 95%ethanol（V/V）extractofE.brevicornuandidentifiedas2，3，5，6，7-pentamethoxy-phenanthrene（1），4，5-dihydroxy-2，3，6-trimethoxy-9，10-dihydrophenanthrene（2），5，7，4′-trimethoxy-4-phenylcoumarin（3），3，5，7，4′-tetramethoxyflavone（4），4-hydroxy-3-prenylbenzoic acid（5），4-Hydroxycinnamic acid methyl ester（6），and（2E）-2-nonenoic acid，4-hydroxy（7）.［Conclusion］Compound 1～7 were obtained from genus of Epimedium for the first time.

Epimedium brevicornu Maxim.；chemical constituent；structural identification

R284.2

A

1672-1519（2016）02-0114-04

10.11656/j.issn.1672-1519.2016.02.14

天津市高等學(xué)?？萍及l(fā)展基金一般資助項目（20120203）。

柴士偉（1979-），男，碩士，主管藥師，主要從事中藥學(xué)相關(guān)研究。

（2015-09-16）